BRCA1 E BRCA2

UNIVERSITÁ POLITECNICA
DELLE MARCHE
FACOLTÁ DI MEDICINA E CHIRURGIA
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TUMORI EREDO-FAMILIARI DI
MAMMELLA ED OVAIO:
ANALISI MUTAZIONALE DEI GENI
BRCA1 EE BRCA2
Tesi di Dottorato di:
Relatore: Chiar. mo
Dott.ssa Silvia Pagliaretta
Prof. Stefano Cascinu
A
Annnnoo A
Accccaaddeem
miiccoo 22001111//22001122
INDICE
RIASSUNTO
1
CAPITOLO 1: INTRODUZIONE
1.1 EPIDEMIOLOGIA DELLE NEOPLASIE ALLA MAMMELLA ED OVAIO 3
1.2 BASI MOLECOLARI DELLA CARCINOGENESI
4
1.3 LE PROTEINE BRCA1 E BRCA2
7
1.3.1 Struttura della proteina BRCA1
7
1.3.2 Struttura della proteina BRCA2
9
1.4 FUNZIONE DELLE PROTEINE BRCA1 E BRCA2
1.4.1 Riparazione del danno al DNA
10
10
a) Ruolo di BRCA1
10
b) Ruolo di BRCA2
11
1.4.2 Regolazione della trascrizione
12
1.4.3 Controllo del ciclo cellulare
13
1.5 I TUMORI EREDITARI
15
1.5.1 La sindrome HBOC e rischio cancro
16
1.5.2 Incidenza delle mutazioni germinali nei geni BRCA1 e BRCA2
18
1.6 IL TEST GENETICO
19
1.6.1 Selezione dei pazienti
21
CAPITOLO 2: SCOPO DELLO STUDIO
24
CAPITOLO 3: PAZIENTI E METODI
3.1 CRITERI DI SELEZIONE
25
3.1.1 Criteri clinici
25
3.1.2 Criteri Informatici
25
a) BRCAPRO
25
b) Manchester Scoring System
26
3.2 STUDIO DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 E BRCA2
II
26
3.2.1 Estrazione del DNA genomico
26
3.2.2 Reazione a catena della polimerasi
27
3.2.3 Purificazione dell’amplificato
34
3.2.4 Reazione di sequenza
35
3.2.5 lettura della sequenza
38
3.3 STUDIO DEI GRANDI RIARRANGIAMENTI GENICI IN BRCA1 E BRCA2:
MLPA (Multiplex Ligation Probe amplification)
39
CAPITOLO 4: RISULTATI
4.1 SOGGETTI ESAMINATI
45
4.2 BRCAPRO
47
4.3 ANALISI DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 E BRCA2
48
4.3.1 Studio del gene BRCA1
48
4.3.2 Studio del gene BRCA2
56
4.3.3 Studio dei parenti sani
64
CAPITOLO 5: DISCUSSIONE
66
BIBLIOGRAFIA
III
ABSTRACT
Approximately up to 5 %-10% of all cases of breast and ovarian cancers exhibit a
familial pattern of incidence.
During the 90s, reserchers discovered that this familial predisposition was caused by
germline mutations in two tumor suppressor genes called BReast CAncer susceptibility
gene 1 and 2, or BRCA1 and BRCA2.
Mutations in these genes are associated with a dominant autosomic genetic
predisposition at high penetrance.
It is now widely accepted that individuals, that inherit a germline mutation in BRCA1 or
BRCA2, have a significantly increased lifetime risk of developing breast or/and ovarian
cancer.
Our study aims to evaluate the presence of germline mutations in BRCA1 and BRCA2
both in patients with breast and / or ovarian cancer both in their relatives.
In the study, candidates identification was based on familial history and on the results
provided by computer programs such as BRCAPRO and Manchester Scoring System.
The approach used was based on BRCA1 and BRCA2 sequence screening by direct
sequencing methods, while the study of large gene rearrangements was carried out by
MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification).
To date, 741 patients were selected, 692 were women and 49 were men, with a mean age
of onset disease of 44 years (range 16-84).
BRCA1 and BRCA2 mutational analysis was completed on 725 patients.
191 mutations have been totally identified, 52 of which in BRCA1:
- 19 frameshift, 17 missense, 3 nonsense, 2 splice site mutations, 7 intronic
variants and 4 gene rearrangements;
IV
and 57 in BRCA2:
- 21 frameshift, 4 nonsense, 20 missense, 5 silent, intronic variants 5 and 2 in the
splice site.
Then the study was extended to 256 healthy subjects, relatives of analyzed patients.
The analysis was completed on 181 subjects. A total of 77 mutations have been found:
22 in BRCA1 and 17 in BRCA2.
The collected data confirm the possibility of detect predisposing mutations in high risk
patients. Individuals carrying the mutation, will benefit from a prevention program.
V
RIASSUNTO
Sulla base delle informazioni ad oggi disponibili, si stima che circa il 5-10% dei
carcinomi mammari ed ovarici insorga su base eredo-familiare.
Nel corso degli anni ‘90, sono stati identificati due geni oncosoppressori che, se mutati,
sono responsabili della comparsa sia di tumori mammari che ovarici.
Questi geni sono stati chiamati BReast CAncer susceptibility gene 1 e 2 ovvero BRCA1 e
BRCA2.
Le mutazioni di questi geni si trasmettono con modalità di tipo autosomico dominante.
Da un punto di vista clinico, l’importanza nel rilevare mutazioni in questi geni, risiede
nel fatto che i soggetti, portatori di mutazioni predisponenti, hanno un elevato rischio di
ammalarsi di tumore.
Il nostro studio si è proposto di valutare l’incidenza delle mutazioni germinali di BRCA1
e BRCA2 sia nei pazienti con neoplasia della mammella e/o dell’ovaio sia nei parenti dei
pazienti portatori.
L’identificazione dei soggetti candidati allo studio, si è basata sulle caratteristiche
dell’anamnesi familiare e sui risultati forniti da programmi informatici quali BRCAPRO e
Manchester Scoring System.
Lo studio della sequenza nucleotidica di tutti gli esoni dei geni BRCA1 e BRCA2 è stato
effettuato tramite sequenziamento diretto; mentre lo studio di grandi riarrangiamenti
genici è stato effettuato grazie alla tecnica MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification).
Ad oggi, sono stati selezionati 741 pazienti, di cui 692 donne e 49 uomini, con un’età
mediana d’insorgenza della malattia di 44 anni (range 16-84).
L’analisi mutazionale di BRCA1 e BRCA2 è stata completata su 725 pazienti.
In totale sono state identificate 191 mutazioni, di cui 52 in BRCA1:
1
-
19 frameshift, 17 missenso 3 nonsenso, 2 mutazioni nel sito di splicing, 7 varianti
introniche e 4 riarrangiamenti genici;
e 57 in BRCA2:
-
21 frameshift, 4 nonsenso, 20 missenso, 5 silenti, 5 varianti introniche e 2
mutazioni nel sito di splicing.
Lo studio è stato esteso poi a 256 soggetti sani, parenti dei pazienti analizzati, dei quali
188 donne e 68 uomini. L’analisi è stata completata su 181 soggetti. Sono state trovate,
in totale 77 mutazioni, di cui 22 in BRCA1 e 17 in BRCA2.
I dati raccolti finora confermano la possibilità di rilevare mutazioni predisponenti allo
sviluppo di carcinomi mammari ed ovarici in soggetti ad alto rischio. I soggetti
identificati potranno quindi sottoporsi a strategie preventive.
2
Capitolo 1
INTRODUZIONE
1.1 EPIDEMIOLOGIA DELLE NEOPLASIE ALLA MAMMELLA ED OVAIO
Il tumore della mammella è il tumore di gran lunga più frequente nel sesso femminile.
Nonostante la copertura dei programmi di screening mammografico ed il progresso delle
tecniche terapeutiche abbia notevolmente contribuito alla sopravvivenza di pazienti
affetti da cancro al seno, questo tipo di neoplasia è ancora oggi una delle principali cause
di morte nelle donne1.
La malattia presenta inoltre un’ampia variabilità geografica, con tassi più alti, fino a 10
volte, nei Paesi economicamente avanzati.
In Italia, si contano circa 46.000 nuovi casi l’anno e circa 13.000 decessi; dati che
andranno, purtroppo, ad aumentare a causa dell’ allungamento della vita media2, 3.
In particolare, nella regione Marche, nell’anno 2010, sono stati diagnosticati 3257 nuovi
casi4.
I fattori di rischio principali per questa neoplasia sono stati identificati nella storia
riproduttiva (nulliparità o prima gravidanza a termine dopo i 30 anni, mancato
allattamento al seno), nel profilo ormonale , nelle abitudini di vita in aggiunta alla
presenza di pregressa patologia displastica o neoplastica della mammella e un’anamnesi
familiare positiva per tali tumori.
Il cancro ovarico rappresenta circa il 30% di tutti i tumori maligni dell’apparato genitale
femminile, occupa il decimo posto tra tutti i tumori nelle donne per quanto riguarda
l’incidenza ed il quinto per mortalità solo tra le donne in età 50-69 (7% del totale dei
decessi)2,3.
3
Questo tumore presenta un gradiente Nord-Sud: rispettivamente sono diagnosticati al
Nord 12,1, al Centro 10,1 e nel Meridione 9,7 casi ogni 100.000 donne/anno2.
1.2 BASI MOLECOLARI DELLA CARCINOGENESI
Il processo ci carcinogenesi, ossia la trasformazione multi-steps da tessuto sano a
neoplastico, deriva da eventi genici, somatici e/o ereditari, cumulativi che garantiscono
un vantaggio selettivo del clone in cui tali alterazioni si accumulano.
Tali alterazioni possono causare l’attivazione persistente di vie di trasduzione del segnale
innescate da fattori di crescita e la soppressione di altrettante vie che portano alla morte
cellulare programmata (apoptosi)5.
Il risultato di tale trasformazione è sia il mancato equilibrio fra sopravvivenza e morte
cellulare con successiva crescita cellulare incontrollata, sia la disregolazione della
comunicazione cellula/cellula e cellula/matrice extracellulare con conseguente
potenziale invasivo della cellula neoplastica.
I geni che, se mutati, conferiscono suscettibilità al cancro, appartengono a tre classi:
-
proto-oncogeni
-
oncosoppressori
-
geni deputati alla riparazione del DNA
I proto-oncogeni svolgono un ruolo importante nella regolazione del ciclo e del
differenziamento cellulare.
I proto-oncogeni ed i loro prodotti possono essere classificati in:
-
fattori di crescita (sis, int-2)
-
tirosin-chinasi, serin/treonin chinasi e recettori tirosin-chinasi ( src, fgr, fps/fes, kit,
pim-1,mos)
4
-
proteine G associate alla membrana (H-ras, K-ras, gsp)
-
regolatori citoplasmatici (crk)
-
fattori trascrizionali nucleari (myc, fos, jun, erbA, ski)
Nelle cellule sane l’espressione dei proto-oncogeni è strettamente controllata, in modo
che la crescita e la divisione cellulare avvengano solo in momenti appropriati della vita
della cellula6.
Per “attivare” un proto-oncogene, in oncogene, è sufficiente una sola mutazione nella
sequenza del gene.
Nel caso in cui la mutazione avvenga in un gene che codifica per un recettore , questo
recettore viene attivato in maniera costitutiva, ossia anche in assenza del ligando. Se
invece, ad essere mutate sono le proteine tirosin-chinasi, si ha l’attivazione costitutiva
(ligando indipendente) della cascata a valle della trasduzione del segnale, che porta ad
una divisione incontrollata.
I geni oncosoppressori, scoperti alla fine degli anni ’60, sono geni i in grado d’inibire la
crescita e la divisione cellulare; sono capaci quindi, di sopprimere la proliferazione
incontrollata tipica delle cellule cancerose.
A differenza delle mutazioni negli oncogeni, le alterazioni a carico dei geni
oncosoppressori seguono “ l’ ipotesi dei due colpi ” ovvero, è necessario che entrambi
gli alleli di un determinato gene siano mutati affinché si manifesti l’ effetto.
Di fatto, qualora un solo allele sia danneggiato (primo colpo), il secondo resterebbe in
ogni caso in grado di generare una proteina corretta.
Se la prima lesione genica è a carico delle cellule germinali , viene ereditata ed è presente
in tutte le cellule dell’organismo.
La seconda mutazione (secondo colpo), che porta alla loss of function del gene
oncosoppressore, avviene nelle cellule somatiche già portatrici della prima lesione.
5
In altre parole, gli alleli di geni oncosoppressori sono solitamente recessivi, mentre
quelli degli oncogeni sono comunemente dominanti,
I soppressori tumorali possono essere distinti in due categorie: gatekeepers e caretakers. I
primi sono chiamati anche “guardiani o oncosoppressori in senso stretto” e controllano
direttamente la crescita cellulare, promovendo l’apoptosi o inibendo la proliferazione; gli
altri, denominati anche “custodi”, agiscono indirettamente, controllando l’integrità del
DNA.
L’inattivazione di un gene caretakers porta ad una condizione di instabilità genomica
diffusa7.
Fanno parte di questa categoria i geni APC, BRCA1 & 2, DCC, NF1 e 2, p16, p53, RB,
VHL e WT1.
Ultima classe di geni è quella deputata alla riparazione dei danni al DNA. Questo
gruppo comprende geni che riparano gli errori che avvengono durante la duplicazione
del DNA. A seconda del tipo di danno che il DNA subisce, vengono coinvolti differenti
meccanismi di riparo.
NER (Nucleotide Excision Repair), BES (Base excision repair) e MMR (MisMatch Repair) sono
deputati al riparo delle lesioni a singolo filamento del DNA; HR (Homologous
Recombination Repair) e NHEJ (Non-Homologous End Joining) riparano i danni a doppio
filamento dell’elica di DNA.
6
1.3 LE PROTEINE BRCA1 E BRCA2
BRCA1 e BRCA2 (BReast CAncer susceptibility gene 1 e 2) codificano per proteine ad
elevato peso molecolare con simili modelli di espressione e di localizzazione subcellulare . Sono entrambe espresse in molti tessuti, principalmente durante la fase G1/S
del ciclo cellulare, indicando un loro ruolo durante la replicazione del DNA.
Inoltre le proteine BRCA sono localizzate nel nucleo delle cellule somatiche, dove
coesistono in caratteristici foci subnucleari che si ridistribuiscono a seconda della
localizzazione del danno al DNA.
1.3.1 Struttura della proteina BRCA1
Il gene BRCA1, mappato sul braccio lungo del cromosoma 17 (17q21), fu scoperto da
Mary-Claire king nel 199410 .
Questo gene è composto da 24 esoni, per una lunghezza complessiva di 5693bp. Di
questi esoni, 22 codificano per una proteina di 1863 aminoacidi (220kDa), mentre gli
esoni 1 e 4 vengono processati durante la trascrizione.
La proteina codificata da BRCA1 presenta numerosi domini funzionali.
All’estremità N-terminale si trova il dominio RING-finger che comprende all’incirca i
primi 109 aminoacidi della proteina.
All'interno di questo dominio vi è una regione, di circa 50aa, caratterizzata da un pattern
conservato con struttura del tipo cys3-his-cys4, responsabile del legame di due ioni zinco
(Zn2+)11.
Tale dominio è coinvolto nell’attività ubiquitino ligasi infatti consente a BRCA1 di
mono o poli ubiquitinare le proteine che devono essere degradate12.
Questa attività è possibile grazie al legame del dominio RING-finger con due proteine:
BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1) e BAP1 (BRCA1-associated protein 1)13.
7
La regione compresa fra gli aminoacidi 200-300 contiene due segnali di localizzazione
nucleare NLS ed i siti di legame per le proteine p53, cMYC, RB e ZBRK1. Adiacente a
questa regione si trova il dominio di legame per le proteine SW1 e SNF implicato nel
rimodellamento della cromatina.
La porzione centrale della proteina BRCA1 (aa 452-1079) contiene il sito di legame con
il DNA ed è coinvolta nel meccanismo di riparo della doppia elica mediato dal
complesso mutiproteico BASC (BRCA1-Associated Surveillance Complex).
Comprese tra gli aminoacidi 1280 e 1524 si trovano poi numerose sequenze SCD (SQ
Cluster Domains) che costituiscono i siti preferenziali per la fosforilazione di BRCA1 da
parte delle chinasi ATM, CHK2 e CDK2.
La porzione C-terminale presenta due sequenze, di circa 110 aminoacidi ognuna,
ripetute in tandem ed evolutivamente conservate chiamate BRTC (BRCA C-Terminale). La
struttura di ogni dominio BRTC presenta un core centrale, formato da quattro foglietti β
paralleli, circondato da tre α-eliche.
Le due ripetizioni BRTC si ripiegano in maniera testa-coda, dando luogo alla
formazione di una tasca costituita per la maggior parte da amminoacidi idrofobici.
Questi domini costituiscono il sito di legame per molte proteine fra le quali l’RNA
polimerasi II, p300, BACH1, i complessi istone-diacetilasi HDAC1 e HDAC2, p53,
CtIP (carboxy-terminal-binding-interacting-protein) e con RB.
Figura 1: Domini funzionali della proteina BRCA1 e relative interazioni con le proteine.
8
1.3.2 Struttura della proteina BRCA2
Il gene BRCA2 scoperto nel 1995 e mappato sul braccio lungo del cromosoma 13
(13q12), è costituito da 27 esoni (11385 nucleotidi) e codifica per una proteina nucleare
di 3418 aminoacidi (384 kDa).
La proteina BRCA2 contiene solamente due domini funzionali.
Il primo, situato nella regione centrale del gene, codificato interamente dall’esone 11, è il
motivo ripetuto BRC (che contiene 8 ripetizioni di una sequenza di 20-30 aminoacidi),
essenziale nel ruolo di riparazione del DNA e nel legame con RAD51. L’altro, a livello
dell’estremità C-terminale, è il sito di legame con la proteina DSS1, adiacente ai siti NLS.
La regione carbossi terminale presenta anche un sito di interazione con BRCA1.
DSS1 è una piccola proteina che regola l’attività di riparazione del DNA, funzionando
come cofattore di BRCA2.
Le proteine BRCA sono coinvolte in numerosi processi cruciali per la vita cellulare.
Figura 2: Domini funzionali della proteina BRCA2 e relative interazioni con le proteine.
9
1.4 FUNZIONE DELLE PROTEINE BRCA1 E BRCA2
BRCA1 e BRCA2 sono considerati geni oncosoppressore caretaker, poiché sono
coinvolti nella riparazione del DNA tramite ricombinazione omologa (homolog
recombination - HR), nella regolazione della trascrizione e nel controllo del ciclo cellulare.
Essi effettuano un controllo definito a monte, che comprende il coinvolgimento nei
sistemi di riparazione del DNA ed una regolazione a valle, che si esplica nel controllo
del ciclo cellulare attraverso i vari checkpoints14.
1.4.1 Riparazione del danno al DNA
Per quanto riguarda la ricombinazione omologa, la letteratura suggerisce che BRCA1 e
BRCA2 abbiano ruoli diversi, nonostante si localizzino all’interno di un unico
complesso macromolecolare.
Infatti è stato dimostrato che, mentre BRCA1 svolge un ruolo più generale, fungendo da
tramite tra i segnali di rottura del DNA e gli effettori della riparazione, BRCA2 lega e
controlla l’attività della proteina RAD51.
a) Ruolo di BRCA1
Come conseguenza di una lesione alla doppia elica di DNA, si ha l’immediata marcatura
del sito danneggiato grazie alla fosforilazione dell’istone H2A-X.
BRCA1 viene fosforilata e di conseguenza attivata. Nella forma attiva migra a livello
delle forche di replicazione del DNA, dove si associa coi i complessi proteici specifici
per la riparazione15.
La fosforilazione avviene a livello di diversi residui di serina (Ser1387, Ser1457, Ser988,
Ser1423, Ser1524)16;17 da parte delle chinasi ATM, ATR (ATM-related kinase) e CHK216,17.
Ognuna di queste chinasi, viene attivata da uno stimolo chimico diverso ed ha come
bersaglio uno specifico gruppo di residui di serina. In particolare ATM e CHK vengono
10
attivate in caso di danno da parte di radiazioni ionizzanti, mentre ATR è attivata come
conseguenza all’esposizione a raggi UV o all’arresto della replicazione.
BRCA1 fa parte di molti complessi macromolecolari. Il primo di questi è
MRE11/RAD50/NSB1.
Il primo passo per la riparazione del DNA è la formazione di un DNA a singola elica
sporgente al 3’.
La nucleasi MRE11 genera tratti di ssDNA, che verranno poi legati da RAD51.
Inibendo l’attività nucleasica di MRE11, BRCA1 può regolare la lunghezza e la quantità
dei tratti a ssDNA che si vanno a formare, fungendo così da coordinatore della risposta
al danno genetico17.
BRCA1 interagisce inoltre con il complesso SWI/SWF.
Tale complesso è responsabile del rimodellamento della cromatina che permette un più
libero accesso al DNA danneggiato da parte dei fattori coinvolti nella riparazione.
b) Ruolo di BRCA2
La funzione di riparazione del DNA da parte di BRCA2 viene svolta in modo più
diretto, in quanto lega direttamente RAD51 a livello dei domini BRCT e della coda
carbossi-terminale.
RAD51 è l’omologo eucariotico della proteina batterica RecA, che ha un’attività
catalitica fondamentale per il funzionamento della ricombinazione omologa.
Questa proteina, infatti, è in grado di legarsi al DNA a singolo filamento (ssDNA),
formando un filamento nucleo proteico che va ad appaiarsi con la sua regione omologa
nel DNA a doppio filamento del cromatidio fratello e promuove lo scambio dei
filamenti giustapposti18,19. Un modello proposto per il funzionamento in vivo del
complesso BRCA2-RAD51 prevede la presenza di uno stato inattivo in cui RAD51 non
può legare il DNA e di uno stato attivo nel quale RAD51 effettua la ricombinazione.
11
Il dominio BRC di BRCA2 è infatti in grado di bloccare la formazione dei filamenti
nucleo proteici, nonché di scindere quelli già formati.
Il mantenimento dello stato inattivo è necessario per prevenire un’attivazione non
richiesta della ricombinazione durante la replicazione del DNA; contrariamente la
scissione fra BRCA2 e RAD51 è fondamentale per il compimento del processo di
riparazione.
Il passaggio fra lo stato inattivo a quello attivo (e viveversa) non è dato dalla scissione
del legame fra BRCA2 e RAD51, bensì da modificazioni post-traduzionali quali la
fosforilazione/defosforilazione di una o entrambe le proteine, in risposta alle lesioni del
al DNA.
1.4.2 Regolazione della trascrizione
BRCA1 regola la trascrizione di numerosi geni coinvolti nei meccanismi di riparazione
del DNA.
BRCA1, in associazione con ZBRK1 e KRAB, forma un complesso in grado di inibire
la trascrizione del gene oncosoppressore GADD45 che è un bersaglio a valle della via di
p5320,21.
Quello che è evidente è che BRCA1 è in grado d’interagire con l’apparato trascrizionale
della cellula, complessandosi con l’RNA polimerasi II attraverso l’interazione con
l’elicasi.
E’ stato dimostrato che le cellule in cui BRCA1 viene inattivato, sono deficitarie nella
riparazione del DNA associata alla trascrizione22,23, un processo secondo cui le basi
danneggiate a causa di un danno ossidativo, sono rimosse dal filamento di DNA
trascritto.
12
In accordo con questa teoria, è l’associazione di BRCA1 con le proteine del Mismatch
repair MSH2 e MSH6.
Inoltre BRCA1 sembra essere coinvolto nel controllo del processamento dell’RNA in
seguito al danno al DNA, grazie alla formazione de complesso BRCA1/BARD ed il
fattore di poliadenilazione CstF50.
Gli mRNA nascenti, prima di venire poliadenilati, devono essere tagliati al 3’da un
endonucleasi. Questa reazione può essere inibita dal complesso BRCA1/BARD in caso
il DNA abbia subito un danno.
Il meccanismo dell’inibizione non è per ora conosciuto, anche se si pensa che possa
coinvolgere l’attività ubiquitino ligasica dell’eterodimero BRCA1/BARD, che esplica la
sua attività sulle proteine coinvolte nel processamento dell’RNA.
Inoltre BRCA1 controlla in maniera indiretta la trascrizione attraverso l’interazione con
l’istone deacetilasi. Infatti rende la cromatina più o meno accessibile ai fattori di
trascrizione.
1.4.3 Controllo del ciclo cellulare
Se il controllo a monte è fondamentale per prevenire la formazione di copie di DNA
errate, la regolazione a valle è altrettanto importante.
Il ciclo cellulare, ovvero l’insieme degli eventi molecolari che portano una cellula a
dividersi in due cellule geneticamente identiche, è un processo altamente controllato.
Il ciclo cellulare è costituito da una serie di eventi coordinati e correlati tra loro, dai quali
dipende la corretta crescita e proliferazione delle cellule eucariotiche. Gli eventi
molecolari che controllano il ciclo cellulare sono ordinati e direzionali: ogni processo è
la diretta conseguenza dell'evento precedente ed è la causa di quello successivo.
13
Vi sono due momenti chiave nel controllo del ciclo: il passaggio dalla fase G1 alla fase S
(checkpoint G1/S o start) e il passaggio dalla fase G2 alla mitosi (checkpoint G2/M)24.
I checkpoint sono essenziali per la sopravvivenza della cellula, poiché impediscono la
propagazione del DNA danneggiato.
BRCA1 svolge la sua funzione di controllo a livello dei checkpoint come parte del
complesso BASC.
Di questo complesso fanno parte il complesso di riparazione MRE11/RAD50/NSB1, la
chinasi ATM, i complessi MLH1-PMS2, MSH2-MSH6, l’elicasi BML e il fattore C di
replicazione del DNA.
L’espressione di BRCA1, durante il ciclo cellulare, non è costante ma varia; in
particolare incrementa nel passaggio tra fase G1 e S e nella mitosi.
Studi hanno dimostrato che sia BRCA1 sia la chinasi ATM sono richieste nella fase S e
nel checkpoint G2/M; ciò suggerisce che la fosforilazione da parte della proteina ATM sia
indispensabile per la risposta ai danni del DNA che avvengono solitamente in questa
fase16.
Altri lavori hanno indicato come questa risposta avvenga grazie l’attivazione, da parte di
BRCA1, della chinasi Chk1, inducendo quindi la cascata dei segnali a valle della Chk125.
Si è scoperto, inoltre, che BRCA1, in presenza di DSBs (Double Strand Breaks), funge da
coattivatore di p5326.
Attivando, infatti, i cofattori p21 (inibitore del ciclo cellulare) e BAX (attivatore
apoptotico), BRCA1 e p53 arrestano il ciclo cellulare nella fase S, impedendo l’inizio
della duplicazione del DNA.
Non è ancora chiaro, contrariamente a BRCA1, il ruolo di BRCA2, nel processo di
regolazione del ciclo cellulare.
14
Un modello proposto è quello in cui la sua interazione con BRAF35 (BRCA2-Associated
Factor 35) controlli il checkpoint G2/M. Il ruolo di BRCA2 e BRAF35 di controllare il
passaggio dalla fase G2 alla metafase, dipenderebbe dalla capacità del complesso di
legarsi alla cromatina fortemente condensata, ovvero ai cromosomi in via di
formazione27.
1.5 I TUMORI EREDITARI
Il tumore è una malattia dovuta ad una crescita incontrollata ed invasiva di un clone
cellulare, che ha accumulato un certo numero di alterazioni genetiche.
Nella maggior parte dei casi le mutazioni geniche avvengono casualmente durante la vita
e colpiscono le cellule somatiche.
Le mutazioni somatiche non sono ereditabili e possono dare origine a tumori definiti
“sporadici”.
In una piccola percentuale di casi (5-10%) la mutazione avviene nelle cellule germinali e
può essere trasmessa da una generazione alla successiva, secondo i criteri mendeliani
dell’ereditarietà.
E’ importante sottolineare che, le persone che ereditano la mutazione germinale non
ereditano il tumore, ma solamente la predisposizione a sviluppare più facilmente quella
neoplasia rispetto alla popolazione generale. Il fatto che la malattia si sviluppi oppure no,
è infatti condizionato, il più delle volte, da altri fattori sia ereditari che esterni, primo tra
tutti lo stile di vita8.
15
1.5.1 La sindrome HBOC e rischio cancro
Quando in più famiglie si hanno molteplici casi di tumore al seno e all’ovaio, insorti in
giovane età ed in più generazioni, si parla di sindrome HBOC (Hereditary breast-ovariancancer ).
L’ alterazione può essere trasmessa da una generazione alle successive, sia da parte
materna sia da parte paterna.
Questa sindrome è identificata in famiglie il cui pedigree presenta componenti sia con
tumore al seno sia all’ovaio ed è caratterizzata da:
-
presenza di più casi all’interno di una stessa famiglia
- insorgenza precoce del tumore al seno,
- sviluppo di cancro ovarico in qualsiasi età,
- cancro al seno bilaterale,
- cancro al seno e alle ovaie nello stesso individuo
-
cancro al seno maschile9
Mutazioni nella linea germinale di uno dei due geni BRCA sono state associate alla
sindrome HBOC.
Nei soggetti portatori di una mutazione germinale nei geni BRCA1 e BRCA2 il rischio
di sviluppare una neoplasia mammaria ed ovarica aumenta notevolmente.
In particolare possedere un gene BRCA mutato significa avere dal 40% all’80% di
rischio di sviluppare un tumore alla mammella.
Il rischio è aumentato da 3 a 7 volte rispetto a quello della popolazione generale, che si
aggira intorno al 12%28.
Per quanto riguarda i carcinomi ovarici, il rischio passa dal 1-2% della popolazione
generale al 30%-70% per mutazioni BRCA1 e al 15%-20% per mutazioni BRCA228.
16
Inoltre il rischio di cancro ovarico non è lo stesso per tutti i tipi di mutazione BRCA2,
ma differisce a seconda della posizione in cui questa si trova.
Precisamente, mutazioni nella parte centrale del gene BRCA2, denominata OOCR
(Ovarian Cancer Cluster Region of exon 11), sono associate ad un più elevato rischio di
cancro ovarico piuttosto che mammario, rendendo i soggetti che ne sono portatori
maggiormente predisposti alla malattia, rispetto a quelli che hanno una mutazione in
altre regioni del gene29.
BRCA2 è coinvolto, inoltre, nello sviluppo di neoplasie mammarie maschili: nella
popolazione generale, il tumore alla mammella maschile è raro e costituisce solamente
l’1% dei tumori maschili30. Per i portatori di mutazioni in BRCA2, il rischio nell’arco
della vita di sviluppare tale neoplasia è approssimativamente 80-100 volte maggiore29.
Mutazioni nei geni BRCA predispongono, anche se in percentuale minore, ad un
aumentato rischio di tumore al colon nel caso in cui l’alterazione sia in BRCA1; e ad un
aumentato rischio di neoplasie alla prostata, linfoma, melanoma, cancro al pancreas e
stomaco nel caso di mutazioni in BRCA228.
A)
B)
Figura 3: Rischio cumulativo di sviluppare neoplasie mammarie (A) ed ovariche (B) relativo ai
portatori di mutazione in BRCA1
17
1.5.2 Incidenza delle mutazioni germinali nei geni BRCA
Il numero ed il tipo di mutazioni germinali di BRCA1 e BRCA2 sono catalogate dal
1995 nel BIC (Breast Cancer Information Core), un database disponibile su Internet
(http://research.nhgri.nih.gov/bic/), nel quale sono state fino ad oggi riportate e raccolte più
di 800 mutazioni.
Le mutazioni sono distribuite lungo l’intera sequenza del gene e non presentano una
topografia definita, infatti non esiste alcuna correlazione fra sito della mutazione e
fenotipo tumorale; per cui i dati clinici non sono in grado di fornire alcuna indicazione
circa la regione da indagare.
La maggior parte delle alterazioni della sequenza nucleotidica sono di tipo frameshift e
non-senso, che portano alla formazione di una proteina tronca.
Sono frequenti anche mutazioni missenso di cui, però, non sempre si è in grado di
stabilire se siano semplici polimorfismi o se invece siano deleterie per la funzionalità
della proteina.
L’incidenza delle mutazioni, nella popolazione generale, è stimata tra 1/150 e 1/80031,32.
Questa aumenta nei casi di famiglie in cui si siano presentati più di due casi di neoplasia
mammaria sviluppata in giovane età e almeno due casi di tumore ovarico.
Vari studi hanno inoltre messo in evidenza, in alcuni gruppi etnici, la presenza di un
“effetto fondatore”, cioè il ricorrere di una mutazione ereditata da un antenato comune.
Nella popolazione ebrea Askenazita, ad esempio, “l’effetto fondatore” è rappresentato
dalle mutazioni 185delAG e 5382insC di BRCA1 e dalla mutazione 6174delT di
BRCA233,34.
Il Consorzio italiano per i tumori ereditari della mammella ed ovaio ha esaminato 1.758
famiglie italiane. Di queste, il 23% sono portatrici di mutazioni patogenetiche negli
oncosoppressori BRCA1 o BRCA2.
18
In Italia l’effetto “founder mutations” è stato descritto in aree geograficamente limitate
della penisola; in particolare per alcune regioni è stato dimostrato un effetto fondatore
per le mutazioni BRCA1 5083del19 e BRCA2 8765delAG35,36,37 .
1.6 IL TEST GENETICO
Il test genetico viene definito dalle linee guida, pubblicate nel 1998, dall’Istituto
superiore di Sanità come “ l’analisi a scopo clinico di DNA, RNA, cromosomi, proteine,
metaboliti o altri prodotti genici per evidenziare genotipi, mutazioni, fenotipi o cariotipi correlati o meno
con patologie ereditabili umane. Questa definizione include gli screening prenatali, neonatali e dei
portatori, così pure i test sulle famiglie a rischio. I risultati di queste indagini si possono applicare alla
diagnosi ed alla prognosi di malattie ereditarie, alla predizione del rischio-malattia, all’identificazione
dei portatori sani, alle correlazioni fenotipo-genotipo.38”
Sono state individuate diverse tipologie di test genetici, che vengono classificati in base
alla loro finalità.
Si parla di test diagnostico quando consente di confermare un sospetto clinico in un
individuo già affetto o di definire la diagnosi.
Per test preclinici o presintomatici s’intende quei test mirati a stabilire se un soggetto
asintomatico abbia o meno ereditato un allele mutato e quindi possa manifestare in
futuro la malattia ad essa associata. Questo è il caso delle malattie geniche di tipo
autosomico dominante, dove il disturbo non compare alla nascita ma può comparire
tardivamente.
I test di valutazione della suscettibilità genetica permettono, invece, d’identificare
genotipi che non sono di per sé causa della malattia, ma comportano un aumento del
rischio di sviluppare la patologia in seguito all’esposizione a fattori scatenanti. Esempi
19
sono i cosiddetti genotipi caratteristici delle neoplasie ereditare o i difetti enzimatici
congeniti come ipertensione, diabete o ictus.
La consulenza onco-genetica si rivolge a quelle persone con una familiarità ereditaria
sospetta, tale da poter nascondere, a sua volta, una suscettibilità ereditaria per lo
sviluppo di specifiche neoplasie ricorrenti all'interno della famiglia39, con fine di rendere
i pazienti consapevoli della propria condizione genetica. La consulenza richiede un
" approccio multidisciplinare ", che coinvolge genetisti, oncologi e psicologi; ciascuno
con un ruolo ben preciso all'interno del programma di counseling40.
La ricostruzione della storia familiare del paziente è un elemento fondamentale del
processo di consulenza genetica, in quanto, una chiara comprensione dell'albero
genealogico può orientare una diagnosi e consentire una migliore predizione dell’ outcome
della malattia. Questi dati presi nell’insieme, fornisco indicazioni importanti circa la
futura gestione della patologia9.
Nonostante la sua importanza sia stata riconosciuta solo negli ultima anni, in questo
contesto, la figura dello psicologo è essenziale: infatti il test genetico può causare un
grave stress psicologico, non solo legato al risultato, ma anche al cambiamento di vita e
all’alterazione delle dinamiche familiari che ne conseguono.
Il risultato del test può essere positivo, negativo o non informativo.
Quest’ultimo caso si manifesta quando in un soggetto malato, appartenente ad una
famiglia ad alto rischio, non si riesce a trovare alcuna mutazione nei geni BRCA.
Tale risultato non è di per sé sufficiente ad escludere la natura ereditaria del tumore, che
potrebbe avere come causa un gene differente da quelli analizzati.
Il risultato negativo si verifica nel caso un cui un soggetto sano non presenti la
mutazione che, invece, è stata riscontrata nella famiglia d’appartenenza.
20
Il test positivo si ha ogni qual volta si riveli una mutazione. In questo caso il soggetto
può decidere se sottoporsi ad interventi preventivi quali mastectomia od ooferectomia
profilattica.
1.6.1 Selezione dei pazienti
La ricostruzione accurata dell'albero genealogico richiede la raccolta dei dati clinicopatologici riguardanti ciascun membro della famiglia, che risalga per almeno tre
generazioni dal "probando", sia da parte materna sia da parte paterna.
Il sospetto che il paziente sia un soggetto a rischio deriva, innanzitutto, da alcuni fattori
di carattere clinico come: l’insorgenza precoce, la bilateralità, la presenza di tumore alla
mammella maschile, la presenza della stessa famiglia di molteplici casi di carcinoma
mammario o ovarico (forte aggregazione) e l’interessamento di più generazioni
(verticalità).
Come supporto ai criteri clinici, si associa l’utilizzo di modelli informatici, che calcolano
la probabilità di un soggetto di essere portatore di una mutazione.
Questa valutazione viene effettuata attraverso l’utilizzo si software informatici che si
basano su specifici modelli matematici.
Uno dei programmi maggiormente usato è il CancerGene con applicazione BRCAPRO.
Questo software calcola, in base alla storia famigliare della prima e seconda generazione, il
rischio di un soggetto di essere portatore di mutazione.
Per il calcolo della probabilità vengono prese in considerazione le caratteristiche
autosomali dominanti dei geni, compresa la prevalenza e la penetranza, nonché le
probabilità statistiche basate sui sistemi mendeliani e sul teorema di Bayes41. Il risultato è
espresso come valore percentuale: i soggetti con uno score maggiore del 10% sono
considerati ad alto rischio.
21
Il software BRCAPRO è strutturato sottoforma di questionario; per il probando e per
ciascun parente di primo e secondo grado, vengono inserite informazioni riguardanti il
sesso, l’origine etnica, l’età, l’età d’insorgenza della neoplasia mammaria e/o ovarica e
l’eventuale bilateralità della neoplasia mammaria, la presenza e l’ età d’insorgenza di altre
neoplasie correlate.
Esiste una versione italiana del programma che permette di adattare i parametri del
software BRCAPRO alle caratteristiche della popolazione italiana.
Il programma, pur essendo molto utile, presenta anche dei limiti42,43:
-
l’impiego dei dati di prevalenza e penetranza, che potrebbero essere inaccurati
rispetto alla popolazione in esame,
-
il fatto di tenere in considerazione solo i parenti di primo e secondo grado,
-
il fatto di prendere in esame solo i due geni per la suscettibilità al cancro
conosciutici( BRCA1 e BRCA2).
Un altro modello di recente sviluppo è il Manchester Scoring System, che è stato elaborato
partendo dal fatto che i preesistenti modelli manuali ignorano importanti informazioni
riguardanti la storia familiare, mentre i software richiedono troppo dispendio di tempo.
Il Manchester Scoring System è, infatti, un modello cartaceo costruito a “modo” di tabella,
che considera i familiari del probando fino al terzo e quarto grado e prende in
considerazione, non solo il carcinoma mammario e/o ovarico, ma anche neoplasie
correlate come prostata, pancreas e carcinoma della mammella maschile.
Ad ogni neoplasia viene assegnato un punteggio, che aumenta al diminuire dell’età
d’insorgenza. La somma dei punti, determina il rischio di essere portatori. Ad un
punteggio pari a 10 viene correlata una probabilità del 10% per ogni gene.
Modello informatico ancora in fase di sperimentazione è il BOADICEA( Breast and
Ovarian Analysis of Desease Incidence and Carrier Estimation Algorithm). Questo
22
programma permette all'utente di valutare la probabilità di essere portatore di una
mutazione in base ad un modello poligenico. Si differenzia dagli altri sistemi poiché
prende in considerazione, per il calcolo del rischio, non solo i geni ad alta penetranza (es.
BRCA), ma anche altri geni a bassa penetranza, la maggior parte non ancora identificati
(quindi poligenica).
23
Capitolo 2
SCOPO DELLO STUDIO
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare, in un gruppo di pazienti con
familiarità per neoplasie mammarie e/o ovariche, l’incidenza di mutazioni germinali dei
geni BRCA1 e BRCA2.
Parallelamente si è stimata la probabilità di ogni singolo paziente di essere portatore di
mutazione nei due geni presi in considerazione, mediante l’utilizzo del Software
BRCAPRO e del Manchester Scoring System.
Lo studio si è articolato in due fasi distinte, la prima parte di natura clinica
comprendente la selezione dei pazienti sulla base dei criteri clinici; la seconda parte di
natura biologico/molecolare, effettuata tramite tecniche di sequenziamento diretto ed
MLPA ( Multiplex Ligation Probe Amplifacation).
24
Capitolo 3
PAZIENTI E METODI
3.1 CRITERI DI SELEZIONE
3.1.1 Criteri clinici
La selezione dei pazienti, inclusi nel progetto di ricerca della Clinica di Oncologia
Medica dell’Università Politecnica delle Marche, è stata realizzata prendendo in
considerazione i seguenti criteri:
a) paziente maschio con diagnosi di tumore alla mammella;
b) paziente con tumore mammario od ovarico diagnosticato prima dei 40 anni d’età;
c) paziente con seconda neoplasia mammaria ( sincrona o metacrona, omo o
controlaterale);
d) paziente affetta da neoplasia ovarica e mammaria (sincrona o metacrona);
e) paziente con anamnesi familiare positiva per tumore mammario od ovarico.
Ai soggetti selezionati è stato richiesto il consenso informato ed è stata garantita la
riservatezza dei dati.
3.1.2 Criteri informatici
a) BRCAPRO
Per i pazienti reclutati nello studio è stato costruito l’albero genealogico della famiglia
includendo, dove possibile, tre generazioni e collaterali fino al terzo grado di parentela.
I dati raccolti sono stati inseriti nel software BRCAPRO ed elaborati in modo da ottenere
la probabilità di ogni soggetto di essere portatore di una mutazione in BRCA1 e in
BRCA2.
25
I soggetti la cui probabilità di mutazione è risultata maggiore del 10% sono stati
classificati come “BRCAPRO positivi”; viceversa i soggetti con una probabilità inferiore
al 10% sono stati classificati come “BRCAPRO negativi”.
b) Manchester Scoring System
Il Manchester Scoring System è stato utilizzato in associazione al software BRCAPRO per
ottenere un quadro più accurato della storia familiare del paziente, estesa oltre il secondo
grado di parentela.
Se la probabilità di essere portatore di mutazione è risultata alta secondo i parametri del
Manchester Scoring System, ovvero superiore a 20 (come risultato della somma dei punteggi
singoli attribuiti ad ogni neoplasia correlata all’interno della famiglia in studio), il
soggetto è stato ritenuto idoneo allo studio, anche se la probabilità per lo stesso soggetto,
calcolata tramite BRCAPRO, è risultata inferiore al 10%.
3.2 STUDIO DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 E BRCA2
Per il test genetico, da ogni paziente sono stati prelevati 20 ml di sangue periferico,
utilizzato per l’estrazione del DNA genomico.
3.2.1 Estrazione del DNA genomico
L’estrazione del DNA genomico dal sangue è stata realizzata con il Kit “Flexigene 3 ml
Blood ”, seguendo il protocollo fornito dal kit stesso.
In una falcon da 15 ml, etichettata col numero d’identificazione del paziente, sono stati
aliquotati 2 ml di sangue e 5 ml del buffer di lisi FG1.
Al campione, dopo che è stato centrifugato per 5 min. a 2000xg, viene scaricato il
sovranatante e aggiunto 1ml di buffer FG2 e 10μl di proteasi. La provetta,
26
immediatamente agitata al vortex fino ad ottenere una soluzione omogenea, è stata posta
in un termo block a 65º C per 10 min..
L’azione di digestione della proteasi è evidenziabile grazie ad un netto viraggio del
colore della miscela contenente il campione, da rosso a verde oliva. Successivamente è
stato aggiunto alla miscela 1 ml di isopropanolo al 100%, miscelando per inversione,
fino alla comparsa della “medusa” di DNA.
Il campione è stato centrifugato a 2000xg per 3 min. ed è stato poi scaricato il
sovranatante.
Infine il DNA è stato lavato con 1 ml di etanolo al 70 % e centrifugato a 2000xg per 3
min. Dopo aver eliminato il sovranatante, la falcon è stata capovolta su di un foglio di
carta assorbente, per far evaporare tutto l’etanolo.
Successivamente il DNA viene risospeso o in 300 μl del buffer di eluizione FG3 (10 mM
Tris-HCl, pH 8.5), se l’analisi da eseguire è il sequenziamento o in TE (10 mM Tris-HCl
pH 8.2 + 0.1 mM EDTA) se l’analisi da eseguire è l’ MLPA.
3.2.2 Reazione a Catena della Polimerasi
La PCR (Polymerase Chain Reaction), è una tecnica che consente di produrre un numero
estremamente elevato di copie di una regione specifica di DNA, mediante un processo
denominato amplificazione.
Sfrutta alcune peculiarità della duplicazione del DNA ad opera della DNA polimerasi,
quali: 1) la necessità di un DNA a singolo filamento, come stampo per la sintesi del
filamento complementare; 2) la necessità di un piccolo DNA innesco per iniziare la
sintesi e 3) sintesi del DNA solo in direzione 5’-3’.
Per l’allestimento della PCR è necessario avere a disposizione:
27
- il DNA (genomico, plasmidico o complementare) dal quale si amplificherà il
frammento d’interesse;
- due oligonucleotidi, di circa 20 bp, denominati primer senso e primer antisenso,
costruiti in modo da ibridare la sequenza complementare alle estremità del
frammento da amplificare;
- l’enzima DNA polimerasi, termoresistente
- i cofattori che coadiuvano al buon funzionamento dell’enzima stesso, quali buffer
(200nM Tris-HCl, pH 8.4, 500mM KCl) e Magnesio Cloruro. Il primo viene
usato per mantenere il pH e la concentrazione salina costanti durante la reazione,
il secondo per avere la minor quantità possibile di prodotti aspecifici;
- i dessossiribonucleotidi trifosfato liberi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) per
l’allungamento dei primer.
In generale gli step caratteristici di una reazione d’amplificazione sono:
- denaturazione del DNA
- annealing DNA/primers
- allungamento della catena
La reazione inizia con una fase di denaturazione a 95°C, poiché la DNA polimerasi
necessita di uno stampo di DNA a singolo filamento.
A queste temperature, l’utilizzo di una DNA polimerasi termoresistente risulta
indispensabile, poiché la temperatura di denaturazione del DNA inattiva la maggior
parte degli enzimi. Per questo motivo viene usata la Taq polimerasi: una DNA
polimerasi, isolata dal batterio termofilo Termus aquaticus, .resistente alle alte temperature
che rimane attiva anche dopo i passaggi di denaturazione.
28
La seconda fase è quella di annealing, in cui i primers si appaiano alle sequenze
complementari del DNA genomico generando un’estremità 3’-OH, necessaria alla
polimerasi per iniziare la sintesi del nuovo filamento.
La temperatura di annealing, ovvero d’ibridazione, è d’importanza fondamentale per l’
astringenza della reazione.
Nella fase di allungamento, entrambi i filamenti del DNA fungono da stampo per i due
primers utilizzati; la sintesi avviene grazie all’ aggiunta di deossinucleotidi liberi ai due
primers in direzione 5’-3’.
Un termociclatore opera automaticamente cicli successivi di denaturazione, annealing ed
allungamento, in modo da avere una sintesi esponenziale di molecole di DNA. Dopo n
cicli la miscele di reazione conterrà potenzialmente 2n molecole di dsDNA.
Nel nostro studio la PCR è stata realizzata in un volume finale di 50 μl; le quantità
utilizzate per ogni reagente sono state di:
- 5 μl di Buffer 1 X;
- 1,5 μl di MgCl2 1,5 mM;
- 1 μl di dNTPs 10 mM;
- 1 μl di primer senso 50 pmol/μl ;
- 1 μl di primer antisenso 50 pmol/μl;
- 2,5 U di Taq-polimerasi ;
- 2 μl di DNA.
Le amplificazioni sono state ultimate in eppendorf da 200 μl, adottando i seguenti
parametri termici:
1) primo step:
a. denaturazione a 95°C per 3 minuti
29
2) secondo step (30 cicli):
a. denaturazione a 95°C per 30 secondi
b. annealing con una temperatura specifica per ogni coppia di primer per 30 secondi
c. estensione a 72°C per 1 minuto
3) terzo step:
a. estensione a 72°C per 7 minuti.
Questo programma di PCR viene adottato per amplificare tutti gli esoni di BRCA1 e
BRCA2 fatta eccezione dell’esone 11 di entrambi i geni.
Infatti data la dimensione di questo esone la sua amplificazione viene suddivisa in
frammenti parzialmente sovrapponibili e con un protocollo specifico:
- 5 μl di Buffer 1 X
- 2 μl di MgCl2 1,5mM
- 1 μl di dNTPs 10mM
- 0,5 μl di primer senso 50 pmol/μl
- 0,5 μl di primer antisenso 50 pmol/μl
- 1 μl di Taq polimerasi
- 4 μl di DNA
per un volume finale di 50 μl ottenuto aggiungendo acqua deionizzata sterile.
I parametri termici adottati sono stati:
1) primo step:
a. denaturazione a 95°C per 3 minuti
2) secondo step (30 cicli):
a. denaturazione a 94°C per 30 secondi
b. annealing a 58°C per 1 minuto
c. estensione a 72°C per 30 secondi
30
3) terzo step:
a. estensione a 72°C per 7 minuti.
Gli amplificati ottenuti sono stati analizzati mediante elettroforesi sul gel d’agarosio
all’1,5%, contenente, come intercalante del DNA il colorante GelRed e come tampone di
corsa il TAE 1X (0,04% M-Tris-acetato, 0,001 M EDTA, pH 8.0).
Le bande corrispondenti ai frammenti di DNA amplificato sono state visualizzate
tramite esposizione a luce ultravioletta.
L’analisi su gel d’agarosio ci ha consentito di stabilire se la reazione di PCR dava origine
ad un solo frammento di DNA delle dimensioni attese e che non fossero presenti altri
amplificati aspecifici, che avrebbero potuto contaminare la reazione.
ESONE
2-C S
2-C AS
2-D S
2-D AS
3S
3 AS
5S
5 AS
6S
6 AS
7S
7 AS
8S
8 AS
9S
9 AS
10 S
10 AS
11 (A) S
11 (A) AS
11 (B) S
11 (B) AS
11 (C) S
11 (C) AS
12 S
12 AS
13 S
13 AS
LUNGHEZZA
144 bp
161 bp
338 bp
235 bp
206 bp
354 bp
267 bp
211 bp
241 bp
1381 bp
1466 bp
1242 bp
265 bp
320 bp
SEQUENZA PRIMERS
5'-GAAGTTGTCATTTTATAAACCT-3'
5'-ATTTTCTGCATAGCATTAATGA-3'
5'-CTTCGCGTTGAAGAAGTAC-3'
5'-TGTCTTTTCTTCCCTAGTATGT-3'
5'-TCCTGACACAGCAGACATTTA-3'
5'-TTGGATTTTTCGTTCTCACTTA-3'
5'-CTCTTAAGGGCAGTTGTGAG-3'
5'-TTCCTACTGTGGTTGCTTCC-3'
5'-CTTATTTTAGTGTCCTTAAAAGG-3’
5'-TTTCATGGACAGCACTTGAGTG-3’
5'-CACAACAAAGAGCATACATAGGG-3'
5'-AGGCAGGAGGACTGCTTCT-3'
5'-TGTTAGCTGACTGATGATGGT-3'
5'-ATCCAGCAATTATTATTAAATAC-3'
5'-CCACAGTAGATGCTCAGTAAATA-3'
5'-TAGGAAAATACCAGCTTCATAGA-3'
5'-TGGTCAGCTTTCTGTAATCG-3'
5'-GTATCTACCCACTCTCTTTTCAG-3'
5'-GACAATTCAGTTTTTGAGTACCTTG-3'
5'-ATGAGTTGTAGGTTTCTGCTGTG-3'
5'-TCCACAATTCAAAAGCACCTAAAAAG-3'
5'-AACCCCTAATCTAAGCATAGCATTC-3'
5'-CCACCACTTTTTCCCATCAAGTC-3'
5'-TTGTAAAATGTGCTCCCCAAAAGC-3'
5'-GTCCTGCCAATGAGAAGAAA-3'
5'-TGTCAGCAAACCTAAGAATGT-3'
5'-AATGGAAAGCTTCTCAAAGTA-3'
5'-ATGTTGGAGCTAGGTCCTTAC-3'
31
TM
48°C
48°C
54°C
60°C
52°C
53°C
50°C
56°C
56°C
58°C
58°C
58°C
60°C
53°C
14 S
14 AS
15 S
15 AS
16 S
16 AS
17 S
17 AS
18 S
18 AS
19 S
19 AS
20 S
20 AS
21 S
21 AS
22 S
22 AS
23 S
23 AS
24 S
24 AS
312 bp
338 bp
450 bp
187 bp
352 bp
249 bp
401 bp
298 bp
297 bp
335 bp
280 bp
5'-CTAACCTGAATTATCACTATCA-3'
5'-GTGTATAAATGCCTGTATGCA-3'
5'-TGGCTGCCCAGCAAGTATG-3'
5'-AACCAGAATATCTTTATGTAGGA-3'
5'-AATTCTTAACAGAGACCAGAAC-3'
5'-AAAACTCTTTCCAGAATGTTGT-3'
5'-TTCTGAGCTGTGTGCTAGAG-3'
5'-ATGCAGCAGATGCAAGGTATTC-3'
5'-GGCTCTTTAGCTTCTTAGGAC-3'
5'-GAGACCCATTTTCCCAGCATC-3'
5'-CTGTCATTCTTCCTGTGCTC-3'
5'-CATTGTTAAGGAAAGTGGTGC-3'
5'-CATTGAAGGAGGCTTCTCT-3'
5'-GATTTTTGTCAACTTGAGG-3'
5'-AAGCTCTTCCTTTTTGAAAGTC-3'
5'-GTAGAGAAATAGAATAGCCTCT-3'
5'-TCCCATTGAGAGGTCTTGCT-3'
5'-GAGAAGACTTCTGAGGCTAC-3'
5'-GAGATGGAAGGATTGCTTGAG-3'
5'-ACTGTGCTACTCAAGCACCA-3'
5'-ATGAATTGACACTAATCTCTGC-3'
5'-GTAGCCAGGACAGTAGAAGGA-3'
53°C
53°C
53°C
60°C
58°C
56°C
54°C
54°C
58°C
60°C
54°C
Tabella 1: Primers usati per l’amplificazione degli esoni di BRCA1
ESONE
2S
2 AS
3S
3 AS
4S
4 AS
5/6 S
5/6 AS
7S
7 AS
8S
8 AS
9S
9 AS
10 (1)S
10 (1) AS
10 (2)S
10 (2) AS
10 (3)S
10 (3) AS
10 (4)S
10 (4) AS
11 (A) S
11 (A) AS
11 (B) S
LUNGHEZZA
311 bp
424 bp
249 bp
454 bp
214 bp
238 bp
200 bp
343 bp
365 bp
324 bp
290 bp
1367 bp
1157 bp
SEQUENZA PRIMERS
5'-CCAGGAGATGGGACTGAATTAG -3'
5'-CTGTGACGTACTGGGTTTTTAGC -3'
5'-GATCTTTAACTGTTCTGGGTCACA -3'
5'-CCCAGCATGACACAATTAATGA -3'
5'-AGAATGCAAATTTATAATCCAGAGTA -3'
5'-AATCAGATTCATCTTTATAGAACAAAT -3'
5'-TGTGTTGGCATTTTAAACATCA -3'
5'-TCAGGGCAAAGGTATAACGCT -3'
5'-CCTTAATGATCAGGGCATTTC-3'
5'-CAACCTCATCTGCTCTTTCTTG-3'
5'-GTACTTGAATCAATTCATTTTGTTTCAAA-3'
5'-CATTCCAAAATTGTTAGCAATTTCAAC-3'
5'-GGGACTACTACTATATGTGC-3'
5'-GTTCAACTAAACAGAGGACT -3'
5'-GTGCTTCTGTTTTATACTTT-3'
5'-CTACATTTGAATCTAATGG-3'
5'-CTCATTTGTATCTGAAGTGG-3'
5'-GATGCTGCTCTTCATCTCTC-3'
5'-GCCATTAAATGAGGAAACAG-3'
5'-GCTGGCCAGCTTCCATTATC-3'
5'-CTGTTTGCTCACAGAAGGAG-3'
5'-GACAGAGGTACCTGAATC-3'
5'-CATAGAGTCATGGTCTCACTA-3'
5'-ATGTTCAGAGAGCTTGATTTC-3'
5'-CAGGACTCTTAGGTCCAAT-3'
32
TM
54°C
56°C
52°C
53°C
54°C
58°C
52°C
44°C
50°C
50°C
52°C
58°C
58°C
11 (B) AS
11 (C) S
11 (C) AS
11 (D) S
11 (D) AS
11 (E) S
11 (E) AS
12 S
12 AS
13 S
13 AS
14 S
14 AS
14.2 S
14.2 AS
15 S
15 AS
16 S
16 AS
17 S
17 AS
18 S
18 AS
18.2 S
18.2 AS
19 S
19 AS
20 S
20 AS
21 S
21 AS
22 S
22 AS
23 S
23 AS
24 S
24 AS
25 S
25 AS
26 S
26 AS
27 (A) S
27 (A) AS
27 (B) S
27 (B) AS
1160 bp
1164 bp
909 bp
387 bp
310 bp
391 bp
297 bp
314 bp
380 bp
305 bp
457 bp
384 bp
296 bp
293 bp
228 bp
455 bp
290 bp
365 bp
427 bp
378 bp
593 bp
342 bp
5'-CTGAGTGTTTCCCTCCTTCA-3'
5'-CCAGTAGAAATTCTCATAACTTA-3'
5'-ATTTCCTACATAATCTGCAGTAT-3'
5'-AGTCCTGCAACTTGTTACACA-3'
5'-TTCTGGAGTACGTATAGCAGT-3'
5'-CAGGTATCAGATGCTTCATTA-3'
5’-CACGAAAGGTAAAAATGAACACT-3’
5'-AGTGGTGTTTTAAAGTGGTCAAAA -3'
5'-GGATCACCTGAGGTCAGAATA -3'
5'-GCATCTGTTACATTCACTGAAA -3'
5'-ACGGGAAGTGTTAACTTCTTAACG -3'
5'-ACCATGTAGCAAATGAGGGTCT -3'
5'-GCTTTTGTCTGTTTTCCTCCAA -3'
5'-CACAGAGTTGAACAGTGTGTTAGG -3'
5'-GGGCTTTAAAATTACCACCACC -3'
5'-GGCCAGGGGTTGTGCTTTTT -3'
5'-TAGATACTAGTTAATGAAATA-3'
5'-TTTGGTAAATTCAGTTTTGGTTTG -3'
5'-AGCCAACTTTTTAGTTCGAGAG -3'
5'-CAGAGAATAGTTGTAGTTGTTGAA -3'
5'-AGAAACCTTAACCATACTGC -3'
5'-GATCCACTATTTGGGGATTGC -3'
5'-GATCTAACTGGGCCTTAACAGC-3'
5'-GCAGATACCCAAAAAGTGGC -3'
5'-TCTGGACCTCCCAAAAACTG -3'
5'-AAGTGAATATTTTTAAGGCAGTT -3'
5'-TATATGGTAAGTTTCAAGAAT -3'
5'-CCTGGCCTGATACAATTAAC-3'
5'-AAAAATGTTAAATTCAAAGTCTC-3’
5'-CAGTTTAGTGAATTAATAATCC-3’
5'-AGAGAGTCTAAAACAGCTTCT-3’
5'-AACCACACCCTTAAGATGAGC -3'
5'-GGGCATTAGTAGTGGATTTTGC -3'
5'-ACTTCTTCCATTGCATCTTTCTCA -3'
5'-AAAACAAAACAAAAATTCAACATA -3'
5'-GCAGCGACAAAAAAAACTCA -3'
5'-ATTTGCCAACTGGTAGCTCC -3'
5'-GCTTTCGCCAAATTCAGCTA -3'
5'-TACCAAAATGTGTGGTGATGC-3'
5'-GTCCAAACTTTTCATTTCTGC-3'
5'-GGAGCCACATAACAACCACA-3'
5'-GGGGAGGGAGACTGTGTGTA-3'
5'-GTGGGAGCAGTCCTAGTGGA-3'
5'-TGACGAAGAACTTGCATTGA-3'
5'-CTCATTGTGCAACATAAGTAC-3'
Tabella 2: Primers usati per l’amplificazione degli esoni di BRCA2
33
58°C
58°C
58°C
56°C
48°C
56°C
56°C
50°C
54°C
50°C
56°C
56°C
46°C
50°C
50°C
56°C
50°C
58°C
54°C
58°C
56°C
56°C
3.2.3 Purificazione dell’amplificato
La purificazione degli amplificati è stata effettuata utilizzando il QIAquick PCR
purification kit, seguendo il protocollo per la purificazione con micro centrifuga.
I buffer e la membrana di silice contenuta nelle colonnine, sono ottimizzati per l’efficiente
recupero del DNA e la rimozione dei contaminanti come l’eccesso di primers, sali, enzimi,
nucleotidi non incorporati.
E’ stato aggiunto un volume di 250 μl di buffer PB ai 50 μl di prodotto di PCR e la
miscela è stata posta nella colonnina contenente la membrana di silice, fornita dal kit.
E’ stata effettuata una centrifuga a 13000 rpm per un minuto e sono stati aggiunti 750 μl
di buffer PE.
Sono state quindi effettuate due centrifughe, la prima a 13000 g per un minuto e la
seconda a 14000 rpm per un minuto, ottenendo il lavaggio del campione e la completa
rimozione del buffer PE.
Infine sono stati aggiunti 50 μl di buffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5). e la colonnina è
stata posta in un eppendorf da 1,5. E’ stata quindi effettuata una centrifuga a 13000 rpm
per un minuto.
Il buffer EB è in grado, essendo una soluzione di eluizione, di legare il DNA, che passerà
quindi, attraverso il filtro della colonnina per finire nell’eppendorf.
Il purificato è stato quantizzato tramite migrazione sul gel d’agarosio all’1,5%. Oltre i
campioni, nel gel è stato caricato un marcatore del peso molecolare (Low DNA Mass
ladder), in modo da poter confrontare l’intensità luminosa del marker con quella dei
campioni e risalire così, alla concentrazione di quest’ultimi.
34
3.2.4 Reazione di sequenza
Il sequenziamento del DNA è una della tecniche più usate in biologia molecolare poiché
permette di determinare l’esatta successione di basi che costituiscono l’acido nucleico.
Dal largo uso che si fa di questa tecnica, si sono sviluppate tecnologie che non
prevedono l’uso di sostanze radioattive o tossiche. Inoltre si sono create macchine
automatiche che hanno reso possibile il sequenziamento di grandi tratti di DNA in
tempi relativamente brevi.
Molteplici sono i metodi di sequenziamento, di questi fanno parte il metodo chimico di
Maxam-Gilbert, il metodo enzimatico di Sanger, il metodo automatico ed il
pirosequenziamento.
Nel nostro caso i campioni purificati di DNA sono stati sottoposti a sequenziamento
automatico tramite l’utilizzo del sequenziatore automatico 3500 Dx System ( Applied
Biosystems).
Questa metodica utilizza lo stesso principio del sequenziamento manuale di Sanger.
Tale processo, richiede una molecola ibrida costituita da DNA a singolo filamento e da
un oligonucleotide, costruito in modo che la sua estremità 3 ’sia a monte della sequenza
di DNA di interesse. L’oligonucleotide agisce come primer e la sua elongazione avviene,
utilizzando il frammento di Klenow della DNA polimerasi I, privo di attività
esonucleasica 5’-3’.
Nel sequenziamento di Sanger sono richieste quattro diverse reazioni ognuna delle quali
contiene: DNA a singolo filamento, il primer specifico per l’esone da sequenziare, i
quattro nucleotidi trifosfato, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, l’enzima DNA polimerasi ed
un differente nucleotide dideossi (ddNTP) per ogni reazione. La differenza fra nucleotidi
dideossi ed i desossinucleotidi, usati normalmente nella sintesi di DNA, è che il primo
presenta un’estremità 3’ H nello zucchero desossiribosio anziché un’estremità 3’ OH.
35
Una volta che il nucleotide dideossitrifosfato (ddNTP) viene incorporato nella catena di
DNA in crescita, la sintesi di DNA si arresta, per la mancanza di un 3’ OH
indispensabile per la formazione del legame fosfodiesterico con il successivo nucleotide.
Il rapporto tra ddNTP e dNTP è solitamente 1/200 per miscele di A e T, 1/100 per G e
C, in modo da garantire sia la formazione di catene sufficientemente lunghe, da coprire
tutta la regione dell’amplificato, sia la presenza di un numero sufficiente di terminazioni
della catena.
Le varie catene, di lunghezza differente, sono separate nel sequenziamento manuale,
mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante ad alta risoluzione e la
localizzazione delle bande di DNA è rilevata per autoradiografia.
Nel sequenziamento automatico, invece, la reazione di sequenza avviene in un’unica
provetta, utilizzando ddNTP marcati con fluorocromi.
I prodotti di reazione, sono separati ed ordinati, in base alla lunghezza crescente, tramite
elettroforesi su un capillare ad alta risoluzione. Nel corso dell’elettroforesi i fluorocromi
sono rilevati dal laser, che provoca l’emissione di una radiazione luminosa a diversa
lunghezza d’onda (Smith L.M. et al.,1996), ciascuna caratteristica per ogni ddNTP
fluorocromato.
La lunghezza d’onda è poi rilevata da un fotomoltiplicatore (CCD camera), che produce
diversi picchi di emissione, corrispondenti al ddNTP fluorocromato che è stato
incorporato.
Nel nostro studio la reazione di sequenza è stata condotta in un volume finale di 20 μl
contenente:
- 2,5μl di buffer di reazione BigDye Terminator v3.1
- 2 μl di buffer di reazione 5X Sequencing Buffer,
- 1,2 μl di un singolo primer (gli stessi della PCR )
36
- DNA in quantità di variabile in base alla concentrazione e lunghezza
dell’amplificato.
La miscela è stata sottoposta a 25 cicli di amplificazione, costituiti dalle seguenti fasi
termiche:
1. 96° C per 10 secondi
2. 60° C per 30 secondi
3. 60° C per 4 minuti.
Il prodotto così ottenuto, è stato purificato con metodo cromatografico, usando le
colonnine DyeExe 2.0 SpinKit (QIAGEN), seguendo le istruzioni del fornitore.
I frammenti purificati, prima di essere caricati al sequenziatore, sono stati miscelati con
la formammide, denaturati per 3 minuti a 98°C e posti in ghiaccio per impedire il
riappaiamento dei filamenti.
FR.
AR (AS)
AR2 (AS)
AF (S)
BR (AS)
BR4 (AS)
BR3 (AS)
BF (S)
CR (AS)
CF2 (S)
CF (S)
CR3 (AS)
CF4 (S)
SEQUENZA PRIMERS ESONE 11 BRCA1
5’-ATT AAC TTT CTG AAT GCT GCT ATT TA-3’
5’-AGG AGT CTT TTG AAC TGC CAA ATC TGC-3’
5’-GCC TTC ATC CTG AGG ATT TTA TCA A-3’
5’-CTG CTA CTC TCT ACA GAT CTT TCA-3’
5’-CCT TCC CTA GAG TGC TAA C-3’
5’-GAG CCT CCT TTG ATA CTA CAT-3’
5’-CAG TTA ATA TCA CTG CAG GCT TTC C-3’
5’-CTG AAC TAC TTC TTC ATA TTC TTG C-3’
5’-TCC TGG AAG TAA TTG TAA GCA TCC TGA AAT-3’
5’-ATT TGG CTC AGG GTT ACC GAA GAG GGG-3’
5’-TTA TTT TCT TCC AAG CCC GTT CC-3’
5’-GAA TTG GTT TCA GAT GAT GAA GAA AGA-3’
Tabella 3: Primers per il sequenziamento dell’esone 11 di BRCA1
FR.
AR (AS)
AF2 (S)
AF (S)
BR (AS)
BR2 (AS)
BF (S)
CR (AS)
CR2 (AS)
CF (S)
DR (AS)
DF2 (S)
DF (S)
ER (AS)
EF (S)
SEQUENZA PRIMERS ESONE 11 BRCA2
5’-TAA TTG TTA CCT TTG AGC TTG TCT GAC-3’
5’-ATG ATT TCT AGA GGC AAA GAA TCA T-3’
5’-CAG ACT CTG AAG AAC TTT TCT CA-3’
5’-CCT CAG AAG TGG TCT TTA AGA TA-3’
5’-GCT TCA GTA GAA ACA TTC AGT TTT-3’
5’-TTT AGG GGC TTT TAT TCT GCT CAT-3’
5’-CAG TAT TTT GTG TTT AAC TAT GTC-3’
5’-TTG CCC ATT GAT GGC TAA AAC TGG-3’
5’-AAG AGC AAG GTA CTA GTG AAA TCA-3’
5’-GTC ACA AGT TCC TCA ACG CAA ATA T-3’
5’-CAA ATG CAT ACC CAC AAA CTG TAA A-3’
5’-GTA ATT AAG GAA AAC AAC GAG AA-3’
5’-TTT CTG AAG AAC CAC CTT CAA CAT-3’
5’-GCA CTG TGT AAA CTC AGA AAT GGA A-3’
Tabella 4: Primers per il sequenziamento dell’esone 11 di BRCA2
37
3.2.5 Lettura della sequenza
L’elettroferogramma elaborato dal sequenziatore rappresenta la sequenza nucleotidica
del DNA e si presenta sotto forma di una successione di picchi di colore diverso per
ogni nucleotide.
La ricerca delle mutazioni è stata effettuata analizzando l’elettroferogramma di ogni
esone (comprese le regioni contenenti i siti di splicing 5’ e 3’) e confrontandolo con la
sequenza di riferimento per lo stesso esone, disponibile sui database in Internet (BRCA1
GenBank Accesion Number U14680 Miki Y et al.,1994; BRCA2 Number U43746)
Graficamente, la sostituzione di un aminoacido con un altro si presenta sotto forma di
due picchi sovrapposti aventi intensità simile e quindi non confondibili con il rumore di
fondo; anche i polimorfismi si presentano alla stessa maniera. Le mutazioni frameshift
sono invece riconoscibili per lo scorrimento della cornice di lettura.
Figura 5: Elettroferogramma relativo all’esone 15 di BRCA1 del paziente 169; si evidenzia il
pattern di corsa alterato.
38
3.3 STUDIO DI GRANDI RIARRANGIAMENTI GENICI IN BRCA1 E
BRCA2: MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)
La metodica del sequenziamento diretto non è, in grado di identificare riarrangiamenti
genetici di maggior entità come delezioni o inserzioni di ampie porzioni del gene.
Da qualche anno, è stata messa a punto una metodica innovativa chiamata MLPA
(Multiplex Ligation Probe Amplification), che permette di osservare un grande
riarrangiamento genico, ovvero un difetto di 'dose' indicativo della presenza di una
delezione o di una duplicazione.
Questa tecnica identifica alterazioni in circa il 10 % dei casi risultati negativi al
sequenziamento.
L’MLPA offre notevoli vantaggi all’operatore: è estremamente sensibile in quanto riesce
a discriminare sequenze che differiscono tra loro per un solo nucleotide, ha un elevato
gradi di riproducibilità ed è relativamente semplice44.
La caratteristica peculiare di questa tecnica è che non necessita di un amplificazione
preparativa della sequenza d’interesse. Infatti l’amplificazione dei vari esoni è data da un
sistema combinato di sonde, specifiche per ogni esone, che ibridano il DNA target del
campione e una sola coppia di primer, di cui uno marcato col FAM, che riconosce la
medesima sequenza target presente in tutte le sonde.
Ciò che viene amplificato durante la PCR non è, quindi, il DNA del campione ma le
sonde ibridate ad esso.
In particolare le sonde MLPA consistono di due oligonucleotidi separati, complementari
al sito bersaglio, in cui gli ultimi 20 nucleotidi sono complementari ad un primer
universale M13. Inoltre una sola delle due sonde possiede una sequenza aspecifica
chiamata stuffer sequence avente lunghezza ben precisa. La funzione della stuffer sequence è
39
quella di permettere il riconoscimento, in base alla sua lunghezza, dei vari frammenti
marcati che verranno prodotti alla fine dell’esperimento.
Figura 6: Struttura generale di ogni coppia di sonde MLPA.
La reazione MLPA può essere suddiviso in cinque fasi principali:
1) denaturazione del DNA e ibridazione di sonde MLPA;
2) reazione di ligazione;
3) reazione di PCR;
4) separazione dei prodotti di amplificazione mediante elettroforesi
5) analisi dei dati .
Durante la prima fase, il DNA viene denaturato e incubato over night con una miscela di
primer e di sonde MLPA, quest’ultime specifiche per i geni che si vogliono analizzare. La
denaturazione del DNA genomico serve per permettere la successiva ibridazione
specifica tra ogni coppia di sonda ed il sito bersaglio sul DNA genomico del paziente.
In ogni coppia di sonde, le estremità si devono ibridare in modo consecutivo sul DNA.
Solo se l’ibridazione ha avuto successo, una ligasi può intervenire ed unire tra loro le due
mezze sonde in un’ unica sonda.
L’enzima ligasi è inattivato per trattamento termico nei passaggi successivi.
La reazione di ibridazione genera una serie di frammenti (sonde intere) dalla lunghezza
variabile, che hanno in comune le estremità, a loro volta complementari alla stessa
coppia di primers universali M13.
40
Figura 7: Ibridazione di ogni coppia di sonde sul DNA genomico bersaglio.
Nella terza fase, quella di PCR, le sonde ligate saranno esponenzialmente amplificate,
grazie all’aggiunta, nella miscela di reazione, dei primers universali M13 e della polimerasi.
Figura 8: La ligasi unisce le sonde ibridate al DNA bersaglio in posizione adiacente.
Inoltre, poiché solo le sonde ligate saranno amplificate, il numero delle copie prodotto
corrisponde al numero di sequenze bersaglio nel campione. Le sonde che non vengono
ligate, possiedono solo una sequenza complementare al primer. Di conseguenza, non
possono essere amplificate in modo esponenziale e quindi non genereranno alcun
segnale. Per questo motivo, la rimozione delle sonde non legate (purificazione) non è
necessaria e rende il metodo MLPA facile da eseguire.
I prodotti di amplificazione risultanti, hanno una lunghezza compresa tra 130 nt e
480 nt e vengono analizzati mediante elettroforesi capillare.
Il confronto fra i picchi ottenuti dal campione ed i picchi di un campione di riferimento
mostra quali esoni hanno un numero di copie aberrante.
41
Figura 9: La sonda intera è complementare nelle estremità ad una stessa coppia di primers
universali M13, di cui uno è marcato con un fluoroforo.
L’MPLA è stata effettuata partendo da genomico diluito in TE (10 mM Tris-HCl pH 8.2
+ 0.1 mM EDTA), sono stati impiegati i Kit in commercio: SALSA MLPA KIT P002C2
e P087-B1 per BRCA1 e SALSA MLPA KIT P045-B3 BRCA2/CHEK2 per BRCA2,
forniti dalla MRC-Holland (Amsterdam, Holland), seguendo il protocollo commerciale.
Le fasi della reazione di MLPA si distribuiscono in 2 giorni: il primo giorno si procede
con la denaturazione del campione e la reazione di ibridazione, il secondo giorno si
realizzano le reazioni di ligazione e PCR.
In particolare, 5 μl di DNA, per una concentrazione totale di 100ng, sono stati
denaturati a 98°C per 5 minuti in un termociclatore.
Al DNA denaturato vengono aggiunti 3 μl di mix d’ibridazione costituita da: 1.5 μl di
SALSA MPLA Buffer (KCl, Tris-HCl, EDTA and PEG-6000. pH 8.5)e 1.5 μl di sonda,
specifica per il gene da analizzare.
I campioni sono stati riscaldati per 1 minuto a 95°C ed incubati a 60°C per 18 ore
(primo giorno). Il secondo giorno si esegue la reazione di ligazione, che avviene
aggiungendo, a 54°C, 32 μl di Ligase-65 master mix al campione ibridato.
42
Per la realizzazione della Ligase-65 master mix sono necessari: 25 μl di H2O, 3 μl di Ligase
Buffer A (NAD (bacterial origin), pH 3.5), 3 μl di Ligase Buffer B (Tris-HCl, non-ionic
detergents, MgCl2. pH 8.5), 1 μl di enzima Ligasi-65.
Il campione viene incubato a 54°C per 15 minuti (per la ligazione della sonda al DNA
target), riscaldato poi a 98°C per 5 minuti, al fine d’inattivare termicamente la Ligase-65, e
infine raffreddato a 20°C.
Si procede, quindi, con la reazione di PCR: alle sonde ligate si aggiungono 10 ml
polymerase master mix costituita da: 7.5 μl di H2O, 2 μl SALSA PCR primer mix
(oligonucleotidi sintetici, uno dei quali marcato fluorescentemente col FAM, dNTPs,
Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ (0.04 %). pH 8 ) e 0.5 μl di SALSA Polymerase.
I parametri termici della reazione sono: 95°C per 30 secondi, 60°C per 30 secondi, 72°C
per 1 minuto ripetuti per 35 cicli; si prosegue con uno step a 72°C per 20 minuti e infine
si raffredda il campione a 15°C. (Tabella)
1) Denaturazione DNA (Giorno 1)
1. 98°C 5 minuti
2. 25°C pausa
2) Reazione d’ibridazione
3. 95°C 1 minuto
4. 60°C 18 ore
3) Reazione di ligazione (Giorno 2)
5. 54°C pausa
6. 54°C 15 minuti
7. 98°C 5 minuti
8. 20°C pausa
4) Reazione di PCR
9. 35 cicli:
• 95°C 30 secondi
• 60°C 30 secondi
• 72°C 60 secondi
10. 72°C 20 minuti
11. 15°C pausa
Tabella 5: Programma termico per la reazione di MLPA
43
Infine, I prodotti di amplificazione sono stati separati su capillare elettroforetico del tipo
ABI PRISM 310. Per l’elettroforesi capillare è stata preparata una miscela contenente
0,75 μl di reazione PCR, 0,75 μl di acqua, 0,5 μl di standard interno (ROX-500 Genescan)
e 13.5 μl di formammide HiDi, incubata per 2 minuti a 80°C e poi iniettata nel capillare.
Contemporaneamente sono stati fatti correre dei DNA di controllo.
L’analisi dei risultati è stata effettuata utilizzando il software Genescan ed i fogli di lavoro
Excel.
I risultati, traducibili in un elettroferogramma, mostrano picchi specifici in
corrispondenza di ogni esone per ciascun gene BRCA.
Una diminuzione, compresa fra il 40% ed il 55%, dell’altezza di un picco, dedotta dal
confronto con i picchi dei campioni di controllo, è stata considerata come indicativa di
perdita di eterozigosi di quell’esone.
A)
B)
Figura 10: Rilevamento degli esoni del gene BRCA1. Il profilo dei frammenti amplificati di un
controllo sano (riquadro A) è messo a confronto con il profilo di un paziente
(riquadro B). E’ evidente l’anomala altezza del picco per l’esone 13 che potrebbe
rivelare una possibile delezione eterozigote nel DNA del paziente.
44
Capitolo 4
RISULTATI
4.1 SOGGETTI ESAMINATI
Lo studio delle neoplasie eredo-familiari di mammella ed ovaio. ha avuto inizio, nel
laboratorio della Clinica di Oncologia Medica dell’ Università Politecnica delle Marche,
nel 1996.
Nel corso degli anni, il laboratorio è stato riconosciuto come Centro Regionale di
riferimento per la Genetica Oncologica.
Fino ad oggi, sono stati invitati a prendere parte allo studio 693 famiglie, dato che
l’analisi della storia famigliare permetteva di ipotizzare una forma ereditaria di tumore
mammario e/o ovarico.
Lo scopo dello studio è stato illustrato in dettaglio ai pazienti ed è stato chiesto loro un
consenso informato per la realizzazione dei test genetici, volti alla ricerca di mutazioni
probabilmente responsabili dell’insorgenza della malattia. Inoltre è stata garantita, ad
ognuno, la riservatezza dei dati.
Dei 741 pazienti entrati in studio, 692 erano di sesso femminile e 49 di sesso maschile,
con un età mediana d’insorgenza della neoplasia di 44 anni (range 16-84).
Nello studio sono stati inclusi anche 256 soggetti sani, parenti dei pazienti esaminati, di
cui 188 femmine e 68 maschi.
NUMERO
PAZIENTI
TIPOLOGIA TUMORE
626
Carcinoma mammella
74
31
Carcinoma ovarico
Carcinoma ovarico e mammario
10
Carcinoma pancreas/prostata
Tabella 6: Caratteristiche dei pazienti con mutazione BRCA
45
I pazienti sono stati suddivisi in 6 gruppi in base alla familiarità, all’ istotipo e all’ età
d’insorgenza del tumore:
1. FHBC (Familial Hereditary Breast Cancer): famiglie con almeno tre casi di
BC (tumore mammario) insorti in due differenti generazioni; parentela di primo
grado (o di secondo grado con interposizione di un uomo) tra un caso e gli altri
due; almeno uno dei casi insorto prima dei 40 anni o bilaterale. Di questo
gruppo fanno parte 376 pazienti ( 50,7%) aventi un età media di 45 anni (range
24-84);
2. FHBOC (Familial Ereditary Breast Overian Cancer): almeno tre casi di BC
(tumore mammario) o di OC (tumore ovarico) insorti in due differenti
generazioni; parentela di primo grado ( o di secondo grado con la presenza di un
maschio malato) tra un caso e gli altri due; almeno uno dei casi insorto prima dei
40 anni o bilaterale (se BC). In questo gruppo rientrano 130 pazienti ( 17,5 %)
con un età media di 48 anni (range 16-81);
3. EOBC (Early Oneset Breast Cancer) ed EOOC (Early Onset Ovarian
Cancer): soggetti con insorgenza della neoplasia mammaria od ovarica prima
dei 35 anni d’età, in assenza di familiarità. Questa categoria include 136 pazienti
(18,3%) aventi un età media di 34 anni (range 22-58);
4. BBC (Bilateral Breast Cancer): soggetti con carcinoma bilaterale della
mammella a prescindere dalla familiarità. Questo gruppo racchiude 27 pazienti
dei 741 esaminati (3,6%) con un età media di 46 anni (range 36-80);
5. BOC (Breast Ovarian Cancer): soggetti con carcinoma sia della mammella sia
dell’ovaio. Ne fanno parte 31 pazienti (6,6 %) aventi un età media di 49 anni
(range 27-74);
46
6. MBC (Male Breast Cancer): soggetti maschili con tumore alla mammella.
Sono compresi in questo gruppo tutti i 49 soggetti maschili analizzati (7%) con
un età mediana di 62 anni (range 39-84)
4.2 BRCAPRO
Grazie all’utilizzo del programma BRCAPRO è stata ricavata la stima percentuale del
rischio mutazionale dei pazienti rientrati nello studio:
1. i soggetti appartenenti al gruppo FHBC avevano una probabilità mediana di
essere portatori di mutazione del 8,2% (range 0,1-99,4%);
2. gli individui facenti parte della classe FHBOC manifestavano una probabilità
mediana di riscontrare la mutazione pari al 35,7% (range 0-100%);
3. nei pazienti rientranti nel gruppo EOBC ed EOOC, il BRCAPRO mediano è
stato del 6,9% (range 0,1-93,1%);
4. i soggetti inseriti nella classe BBC mostravano una probabilità mediana di rilevare
la mutazione del 21,8% (range 0,3-98%);
5. gli individui classificati come BOC evidenziavano un BRCAPRO mediano del
31,9% (range 0,3-99,9%);
6. i pazienti maschili appartenenti al gruppo MBC avevano una probabilità mediana
di essere portatori di mutazione pari al 33,5% (range 0,3-100%).
47
4.3 ANALISI DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 e BRCA2
L’analisi dei geni BRCA1 e BRCA2 è stata completata su 725 pazienti, dei 741 inseriti
nello studio.
In totale sono state individuate 110 differenti mutazioni, di cui 53 a carico del gene
BRCA1 e 57 a carico di BRCA2.
Per entrambi i geni le mutazioni più frequentemente riscontrate sono state:
- mutazioni frameshift: in cui una o più basi azotate vengono aggiunte o delete, per
cui la fase di lettura dell’mRNA risulta cambiata dal punto della mutazione;
- mutazioni missenso: in cui la sostituzione di una coppia di basi causa un
cambiamento nel codone dell’mRNA, con il risultato che nella proteina viene
inserito un aminoacido differente;
- mutazioni nonsenso: in cui la sostituzione di una coppia di basi genera
nell’mRNA un cambiamento da un codone che codifica per un aminoacido ad
un codone di terminazione (UAG, UGA o UAA);
- mutazioni silenti o sinonime: si verificano quando la sostituzione di una base
azotata all’interno di un codone, non determina la variazione la variazione del
corrispondente amminoacido nella proteina interessata;
- mutazioni introniche;
- mutazione del sito di splicing;
- riarrangiamenti.
4.3.1 Studio di BRCA1
Nel gene BRCA1 sono state identificate, tramite sequenziamento automatico ed MLPA,
53 mutazioni, di cui 20 frameshift, 17 missenso, 3 nonsenso, 7 varianti introniche, 2
mutazioni nel sito di splicing e 4 grandi riarrangiamnti genici.
48
Le frameshift trovate sono state:
1.
la delezione di un’adenina al nucleotide 1207 (ex. 11), con la formazione di un
segnale di stop prematuro al codone 373;
2.
l’inserzione di una citosina al nucleotide 5382 (ex.20 ), con la creazione di un
segnale di stop prematuro al codone 1829;
3.
l’inserzione di una guanina al nucleotide 2072 (ex. 11), con l’inserimento di un
segnale di stop prematuro al codone 672;
4.
la delezione di un CT a livello del nucleotide 4744 (ex. 15), con la produzione di
un segnale di stop prematuro al codone 1572;
5.
la delezione di 4 nt (C-T-C-A) a livello del nucleotide 962 (ex. 11), con la
generazione di un segnale di stop al codone 297;
6.
la delezione di 4 nt (G-T-C-T) a livello del nucleotide 3875 (ex. 11), con la
formazione di un segnale di stop prematuro al codone 1263;
7.
la delezione di A-G al nucleotide 2415 (ex. 11), con la creazione di un segnale di
stop prematuro al codone 766. Questa mutazione è stata caratterizzata nel
paziente 478 (BIL), insieme ad una variante missenso: transizione A>G al
nucleotide 4158 con la sostituzione dell’aminoacido 1347 da arginina in glicina;
8.
la delezione di una citosina al nucleotide 4510 (ex. 14), con l’inserimento di un
segnale di stop prematuro al codone 1465;
9.
la delezione di 10 nt (G-C-C-C-A-C-C-T-A-A), al nucleotide 2014 (ex. 11), con
la produzione di un segnale di stop prematuro al codone 650;
10.
la delezione di una timina al nucleotide 3901 (ex. 11), con la generazione di un
segnale di stop prematuro al codone 1263;
11.
inserzione di una citosina al nucleotide 5438 (ex. 21), con la formazione di un
segnale di stop prematuro al codone1829;
49
12.
inserzione di una timina al nucleotide 4171 (ex. 11), con l’inserimento di un
segnale di stop prematuro al codone 1355;
13.
delezione del di nucleotide A-G al nucleotide 185 (ex.2), con la generazione di
un segnale di stop prematuro al codone 39;
14.
delezione di 5 nt (C-T-A-A-T) al nucleotide5154 (ex.17), con la formazione di un
segnale di stop prematuro al codone 1680;
15.
delezione di 4 nt al nucleotide 4184 (ex. 11), con l’inserimento di un segnale di
stop prematuro al codone1364;
16.
delezione di 5 nt al nucleotide 2985 (ex. 11), con la generazione di un segnale di
stop prematuro al codone 968;
17.
delezione di una guanina al nucleotide 1416 (ex. 11), con la formazione di un
segnale di stop prematuro al codone 440;
18.
delezione di 2 nt (A-G) al nucleotide 2511 (ex. 11), con l’inserimento di un
segnale di stop prematuro al codone 808;
19.
delezione di una citosina al nucleotide 633 (ex. 8), con la generazione di un
segnale di stop prematuro al codone 233;
20.
delezione di 2 nt (A-G) al nucleotide 482 (ex. 7), con la formazione di un segnale
di stop prematuro al codone 140.
Le mutazioni missenso trovate sono state:
1.
sostituzione T>C al nucleotide 5401 (ex. 21), porta allo scambio della
fenilalanina con una serina (F1761S);
2.
sostituzione T>G al nucleotide 300 (ex. 5), porta allo scambio della cisteina con
la glicina (C61G). Questa mutazione è riportata nel BIC come patogenetica;
50
3.
sostituzione C>A al nucleotide 5242 (ex.18), porta alla scambio dell’ alanina con
l’acido glutammico (A1708E). Questa mutazione è riportata nel BIC come
patogenetica;
4.
sostituzione T>G al nucleotide 5326 (ex.20), porta allo scambio della valina con
la glicina (V1736G);
5.
sostituzione C>A al nucleotide 2596 (ex 11), porta allo scambio della treonina
con la lisina (T826K);
6.
sostituzione C>T al nucleotide 2640 (ex.11), porta allo scambio dell’arginina con
il triptofano (R841W);
7.
sostituzione G>A al nucleotide 4155 (ex.11), porta allo scambio dell’acido
glutammico con la lisina (E1346K);
8.
sostituzione G>A al nucleotide 5075 (ex.16), porta allo scambio della metionina
con l’isoleucina (M1652I);
9.
sostituzione G>A al nucleotide 2641 (ex.11), porta allo scambio dell’arginina
con la glutammina (R841Q);
10.
sostituzione C>T al nucleotide 710 (ex.9), porta allo scambio della cisteina con
un'altra cisteina (C197C);
11.
sostituzione G>C al nucleotide 2531 (ex.11), porta allo scambio della
gluttammina con l'istidina (Q804H);
12.
sostituzione G>C al nucleotide 186 (ex.2), porta allo scambio dell' acido
glutammico con la gluttammina (E23Q);
13.
sostituzione A>G al nucleotide 655 (ex.8), porta allo scambio della tirosina con
la cisteina(Y179C);
14.
sostituzione G>A al nucleotide4755 (ex.15), porta allo scambio dell' acido
aspartico con l'asparagina (D1446N);
51
15.
sostituzione A>G al nucleotide 5655 (ex.24), porta allo scambio della
gluttammina con l'arginina (Q1846R);
16.
sostituzione C>A al nucleotide 5647 (ex.24), porta allo scambio dell' alanina con
l'acido gluttammico (A1843E);
17.
sostituzione A>G al nucleotide 4158 (ex.11), porta allo scambio dell' arginina
con la glicina (R1347G).
Le mutazioni nel sito di splicing individuate sono state:
1.
sostituzione, nell' introne 6, di una guanina con un' adenina, che porta allo splicing
dell' esone 7 ( IVS6-1 G>A);
2.
sostituzione, nell' introne 11, di una guanina con un'adenina, che porta allo
splicing dell' esone 12.
La mutazione nonsenso identificate sono state:
1.
sostituzione C>T al nucleotide 1806 (ex.11), con conseguente sostituzione dell'
aminoacido glutammina con un codone di stop (Q563X),
2.
sostituzione C>T al nucleotide 5472 (ex.22), con conseguente sostituzione dell'
aminoacido glutammina con un codone di stop (Q1785X)
3.
sostituzione G>T al nucleotide 3633 (ex.11), con conseguente sostituzione dell'
acido glutammico con un codone di stop (E1172X).
Inoltre sono state trovate anche 7 varianti introniche, con significato sconosciuto:
1.
IVS20+60ins12;
2.
IVS2-12insC;
3.
IVS6+7G>A;
4.
IVS17+6C>G;
5.
IVS18-85delT;
6.
IVS19+35T>C;
52
7.
IVS21+13G>T.
Tramite MLPA, sono stati individuate 4 ampi riarrangiamenti genici:
1.
delezione dall’ esone 18 all’esone 20 ritrovata nel paziente 158 (BOC);
2.
delezione degli esoni 1 e 2 individuata nei pazienti 319 (FHBC), 1188 (BC+OC);
1432 (BC+OC), 1433 (BC+OC), 1472 (BC+OC), 1415 (HBC);
3.
delezione dall’esone 8 all’esone 13 determinata nel paziente 492 (BOC), non
riportata in letteratura;
4.
Duplicazione dell’ esone 13 nel paziente 314 (MBC).
N
N
N...pppzzz
N
N
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fffaaam
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E
E
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dddiiiaaagggnnnooosssiii
C
C
Crrriiittteeerrriii
ddd’’’iiinnncccllluuusssiiiooonnneee
90
27
44
BC+OC
675
27
44
BC+OC
85
411
39
HBC-1
917
421
29
HBOC
1375
609
32
BC+OC
188
74
38
FHBC
199
74
45
FHBC
212
74
46
FHBC
253
105
43
BC+OC
469
200
56
BC+OC
959
433
34
EOBC
1108
480
48
BC+OC
334
140
42
BC + OC
335
140
38
BC + OC
1250
546
57
BC + OC
478
204
44
BIL
1220
529
41
BC + OC
553
239
54
BC + OC
689
305
42
BC + OC
776
362
49
BC + OC
R
R
Riiisssuuullltttaaatttiii
BRCA1 ex 20
5382insC stop 1829
BRCA1 ex 20
5382insC stop 1829
BRCA1 ex 20
5382insC stop 1829
BRCA1 ex 20
5382insC stop 1829
BRCA1 ex 20
5382insC stop 1829
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
962del4 stop 297
BRCA1 ex 11
3875del4 stop1262
BRCA1 ex 11
3875del4 stop1262
BRCA1 ex 11
3875del4 stop1262
BRCA1 ex 11
2415delAG stop766
MISSENSO
4158 A>G R1347G
BRCA1 ex 11
2415delAG stop766
BRCA1 ex 11
2415delAG stop766
BRCA1 ex 11
3901delT stop1263
BRCA1 ex 11
3901delT stop 1263
53
B
B
R
C
A
R
O
BR
RC
CA
APPPR
RO
O
M
M
Maaannnccchhheeesssttteeerrr
ssscccooorrreee
B
B
R
C
A
BR
RC
CA
A111
M
M
Maaannnccchhheeesssttteeerrr
SSScccooorrreee
B
B
R
C
A
BR
RC
CA
A222
0.884
18
10
0.894
19
16
0.74
29
29
0.802
17
13
0.559
29
22
0.297
10
10
0.297
10
10
0.297
10
10
0.885
20
7
0.559
14
2
0.207
8
8
0.082
12
9
0.969
29
8
0.971
29
8
0.045
9
8
0.591
11
11
0.415
11
13
0.946
27
21
0.729
22
20
0,9
21
18
923
313
41
BC + OC
1240
362
41
BC + OC
780
366
37
BOC
781
366
56
BC + OC
52
12
56
BC + OC
130
45
4 0 /5 2
BC + OC
169
61
4 2 /5 3
BOC
838
395
54
FHBOC
1260
552
44
SHBC
1407
626
51
BC + OC
773
360
40
BC + OC
599
258
26
FHBC
611
267
46
FHBC
844
400
43
FHBC
(HBC-1)
972
438
43
HBOC
930
424
40
BC + OC
1152
498
43
BC + OC
1515
666
37
FHBC
1244
540
39
BC + OC
1373
607
34
HBC
481
207
55
FHBC
700
319
40
FHBC
701
319
39
FHBC
FHBC
(HBC-1)
FHBC
(HBC-1)
794
372
52
1072
467
40
1102
475
75
BC + OC
1118
484
35
BC + OC
1193
515
50
SHBC
1381
613
52
BC + OC
224
95
3 8 /4 7
FHBC
685
310
43
BC + OC
1402
622
30
HBC
1403
622
28
HBC
158
53
24/47
BOC
319
133
40
FHBC
BRCA1 ex 11
3901delT stop 1263
BRCA1 ex 11
3901delT stop 1263
BRCA1 ex 21
5438insC stop 1829
BRCA1 ex 21
5438insC stop 1829
BRCA1 ex 11
1207delA stop373
BRCA1 ex 11
2071insG stop672
BRCA1 ex 15
4744delCT
stop1572
BRCA1 ex 11
417insT stop 1355
BRCA1 ex 11
417insT stop 1355
BRCA1 ex 11
417insT stop 1355
BRCA1 ex 2
185delAG stop 39
BRCA1 ex 14
4510delC stop 1465
BRCA1 ex 11
2014del10 stop 650
BRCA1 ex 17
5154del5 stop 1680
BRCA1 ex 11
4184del4 stop 1364
BRCA1 ex 11
2985del5 stop 968
BRCA1 ex 11
1416delG stop 440
BRCA1 ex 11
2530delAG stop808
BRCA1 ex 8
633delC stop 233
BRCA1 ex 7
482delAG stop 140
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 5
T300G C61G
BRCA1 ex 11
1806C>T Q563X
BRCA1 ex 22
5472C>T Q1785X
BRCA1 ex 11
3633G>T E1172X
BRCA1 ex 11
3633G>T E1172X
BRCA1
Del. 18-20
BRCA1
Del. 1-2
54
0.414
22
20
0.359
21
18
0.998
38
27
0.926
38
27
0.92
16
0
0.926
24
8
0.537
11
3
0.857
24
15
0.09
16
16
0.536
18
13
0.604
14
11
0.983
31
26
2
32
29
0.59
11
13
0.369
24
18
0.067
11
8
0.867
19
17
0.274
35
32
0.485
12
9
0.525
12
11
0.088
12
12
0.049
12
12
0.036
12
12
0.016
14
13
0.363
9
9
0.037
18
12
0.897
14
14
0.039
5
5
0.224
16
11
0.991
11
11
0.454
14
11
0.797
13
12
0.801
13
12
0.999
18
14
0.864
13
13
1188
512
36
BC + OC
1432
636
51
BC + OC
1433
636
61
BC + OC
1472
656
64
BC + OC
1415
629
42
HBC
492
212
49
BOC
690
314
61
MBC
179
68
47/60
BOC
180
68
37/53
BC + OC
802
68
52
BC + OC
1435
638
39
BC + OC
1478
659
41
FHBC
541
233
32/41
FHBC
567
269
49
FHBC
272
115
37
FHBC
863
402
42
FHBC
990
441
33
EOBC
762
350
50
FHBC
1119
485
40
FHBC
1162
498
51
BC + OC
1190
513
44
SFBC
1203
523
55
SFBC
1227
467
62
SFBC
1376
610
50
SHBC
1452
647
48
SFBC
961
343
60
FHBC
572
253
39
BC + OC
587
285
36
BIL
989
440
47
HBC
1344
591
50
SHBC
1529
688
35
BIL
1129
489
31
EOBC
766
353
50
FHBC
1451
646
37
FHBC
1507
679
48
BOC
BRCA1
Del. 1-2
BRCA1
Del. 1-2
BRCA1
Del. 1-2
BRCA1
Del. 1-2
BRCA1
Del. 1-2
BRCA1
Del. 8-13
BRCA1
Dupl. 13
IVS6- 1G>A
splice ex 7
IVS6- 1G>A
splice ex 7
IVS6- 1G>A
splice ex 7
IVS11-1G>A
Splice ex 12
BRCA1 ex 18
5254C>A A1708E
BRCA1 ex 21
5401T>C F1761S
BRCA1 ex 20
5326T>G V1736G
BRCA1 ex 20
5326T>G V1736G
BRCA ex 11 2596
T826K
BRCA1 ex 11
2640C>T R841W
BRCA1 ex 11
4155G>A E1346K
BRCA1 ex 16
5075G>A M1652I
BRCA1 ex 11
2641G>A R841Q
BRCA1 ex 9
710C>T C197C
BRCA1 ex 11
2531G>C Q804H
BRCA1 ex 2
186G>C E23Q
BRCA1 ex 8
655A>G Y179C
BRCA1 ex 15
4755G>A D1446N
BRCA1 ex 24
5655A>G Q1846R
BRCA1 ex 24
5647C>A A1843E
IVS20+60
ins12
IVS2-12
insC
IVS2-12
insC
IVS6+7
G>A
IVS17+6
C>G
IVS18-85
delT
IVS19+35
T>C
IVS21+13
G>T
0.771
14
15
0.073
6
6
0.28
6
6
0.373
31
22
0.924
25
25
0.967
29
13
0.987
10
12
0.944
21
5
0.954
21
5
0.7
34
26
0.922
20
17
0.25
9
9
0.956
13
12
0.744
31
27
0.787
5
13
0.66
11
11
0.385
11
11
0.032
9
9
0.053
10
11
0.048
18
15
0.015
3
3
0.23
14
14
0.002
5
5
0.048
12
12
0.008
3
3
0.088
9
12
0.073
17
15
0.218
15
12
0.363
14
16
0.014
3
3
0.252
7
8
0.931
10
7
0.011
4
4
0.031
5
5
0.594
15
12
Tabella7: Elenco completo delle mutazioni trovate nel gene BRCA1.
55
4.3.2 Studio di BRCA2
Nel gene BRCA2 sono state individuate, tramite sequenziamento automatico, 58
mutazioni, di cui 21 frameshift, 4 nonsenso, 21 missenso, 5 silenti, 2 mutazioni nel sito di
splicing e 5 varianti introniche.
Le frameshift trovate sono state:
1.
delezione del dinucleotide C-T al nucleotide 5945 (ex.11), con la formazione di
un segnale di stop prematuro al codone 1909;
2.
delezione di una citosina al nucleotide 2912 (ex.11), con la creazione di un
segnale di stop prematuro al codone 904;
3.
delezione di una citosina al nucleotide 8803 (ex.20), con la produzione di un
segnale di stop prematuro al code 2862;
4.
delezione di un TC al nucleotide 2275 (ex.11), con la generazione di un segnale
prematuro di stop al codone 686;
5.
delezione di un G-T al nucleotide 886 (ex.8), con la formazione di un segnale di
stop prematuro al codone 223;
6.
delezione di 7 nt (A-A-A-T-G-T-T) al nucleotide 6636 (ex.11), con la creazione
di un segnale di stop prematuro al codone 2167;
7.
delezione di 4 basi azotate: AGTC al nucleotide 6132 (ex.11), con la produzione
di un segnale di stop prematuro al codone 2002;
8.
delezione di un C-T al nucleotide 6696 (ex.11), con la generazione di un segnale
di stop prematuro al codone 2174;
9.
delezione della timina al nucleotide 1466 (ex.10), con la formazione di un segnale
di stop prematuro al codone 429;
10.
delezione di un C-T al nucleotide 3908 (ex.11), con la creazione di un segnale di
stop prematuro al codone 1231;
56
11.
delezione dell’adenina al nucleotide 5776 (ex.11), con la produzione di un
segnale di stop prematuro al codone 1862;
12.
inserzione di una citosina al nucleotide 4510 (ex.11), con la generazione di un
segnale di stop prematuro al codone 1437;
13.
delezione del T-C al nucleotide 1827 (ex.10), con la formazione di un segnale di
stop prematuro al codone 563;
14.
inserzione di un’adenina al nucleotide 1549 (ex.10), con la creazione di un
segnale di stop prematuro al codone 449;
15.
delezione di un C-A al nucleotide 7476 (ex.14), con la produzione di un segnale
di stop prematuro al codone 2419;
16.
delezione di 4 nt (A-T-T-T) al nucleotide 5444 (ex.11), con la generazione di un
segnale di stop prematuro al codone 1739;
17.
delezione di 4 nt al nucleotide 9996 (ex.27A), con la formazione di un segnale di
stop prematuro al codone 3274;
18.
delezione di 4 nt al nucleotide 6714 (ex.11), con la creazione di un segnale di stop
prematuro al codone 2166;
19.
inserzione di 6 nt (T-G-A-G-G-A) al nucleotide 4359 (ex.11), con la produzione
di un segnale di stop prematuro al codone 1377;
20.
inserzione di un C-T al nucleotide 8507 (ex.18), con la generazione di un segnale
di stop prematuro al codone 2776;
21.
delezione della guanina al nucleotide 9235 (ex.23), con la formazione di un
segnale di stop prematuro al codone 3077.
Le mutazioni nonsenso trovate sono state:
1.
sostituzione G>A al nucleotide 8085 (ex.17), con conseguente sostituzione del
triptofano con un codone di stop (W2619X);
57
2.
sostituzione nell’ esone 22 della glutammina con un codone di stop (Q2960X),
3.
sostituzione nell’ esone 11 della glutammina con un codone di stop (Q1987X);
4.
sostituzione A>T al nucleotide 6265 (ex.11), con conseguente sostituzione della
lisina con un codone di stop (K2013X).
Le mutazione missenso trovate sono state:
1.
sostituzione T>C al nucleotide8987 (ex.22), porta allo scambio della tirosina con
l’istidina (Y1446H);
2.
sostituzione C>G al nucleotide 2192 (ex.11), porta allo scambio della prolina
con arginina (P655R);
3.
sostituzione A>C al nucleotide 1342 (ex.10), porta allo scambio dell’istidina con
l’asparagina (H372N);
4.
sostituzione T>C al nucleotide 5972 (ex.11), porta allo scambio della metionina
col triptofano (M1915T);
5.
sostituzione T>G al nucleotide 8552 (ex.18), porta allo scambio della metionina
con l’arginina (M2775R);
6.
sostituzione A>G al nucleotide 8242 (ex.18), porta allo scambio dell’isoleucina
con la leucina (I2672V);
7.
sostituzione C>T al nucleotide 8614 (ex.19), porta allo scambio della prolina con
la serina (P2796S);
8.
sostituzione G>A al nucleotide 7235 (ex.13), porta allo scambio dell’arginina
con l’istidina (R2336H). Questa mutazione è riportata nel BIC come
patogenetica;
9.
sostituzione A>G al nucleotide 353 (ex.3), porta allo scambio della tirosina con
la citosina (Y42C);
58
10.
sostituzione G>A al nucleotide6214 (ex.11), porta allo scambio dell’ alanina con
la serina (A1996S);
11.
sostituzione C>T al nucleotide 5426 (ex.11), porta allo scambio della serina con
la fenilalanina (S1733F);
12.
sostituzione C>G al nucleotide 9778 (ex.26), porta allo scambio dell’alanina con
la valina (A3184V);
13.
sostituzione A>G al nucleotide 3724 (ex.11), porta allo scambio della valina con
l’ isoleucina (V1166I);
14.
sostituzione T>C al nucleotide 2026 (ex.10), porta allo scambio della tirosina
con l’ istidina (Y600H);
15.
sostituzione A>G al nucleotide 353 (ex.3), porta allo scambio della tirosina con
la guanina (Y42G);
16.
sostituzione G>A al nucleotide 10338 (ex.27), porta allo scambio dell’arginina
con un’altra arginina (R3370R);
17.
sostituzione G>C al nucleotide 6359 (ex.11), porta allo scambio della guanina
con l’alanina (G2044A);
18.
sostituzione A>G al nucleotide 10462 (ex.27), porta allo scambio dell’isoleucina
con la valina (I3412V);
19.
sostituzione C>T al nucleotide 7762 (ex.15), porta allo scambio della leucina con
la fenilalanina (L2512F);
20.
sostituzione T>C al nucleotide 9520 (ex.25), porta allo scambio della tirosina
con l’istidina (Y3098H);
21.
sostituzione C>T al nucleotide 8386 (ex.19), porta allo scambio della prolina con
la serina (P8614S).
59
Le mutazioni silenti identificate sono state:
1.
G>A al nucleotide 9345 (ex.23), P3039P. Questa sostituzione è riportata nel BIC
come patogenetica;
2.
G>A al nucleotide 3744 (ex.11), S1172S;
3.
G>A al nucleotide 4296 (ex.11), L1356L;
4.
T>G al nucleotide 8331 (ex.18), S2701S;
5.
G>A al nucleotide 9078 (ex.22), K2950K.
Le mutazioni del sito di splicing trovate sono satate:
1.
sostituzione, nell' introne 1, di una timina con un' adenina, che porta allo splicing
dell' esone 2 ( IVS2+2T>A);
2.
sostituzione, nell' introne 21, di una guanina con un' adenina, che porta allo
splicing dell' esone 22 ( IVS21-1G>A).
Le varianti introniche riscontrate sono state:
1.
IVS25-12 T>C;
2.
IVS24-16 T>C;
3.
IVS26+76 TA>AG;
4.
IVS2+62 C>G;
5.
IVS7-14 delT.
N
N
N...pppzzz
N
N
N...
fffaaam
m
miiigggllliiiaaa
E
E
Etttàààaaallllllaaa
dddiiiaaagggnnnooosssiii
C
C
Crrriiittteeerrriii
ddd’’’iiinnncccllluuusssiiiooonnneee
177
66
35/35
FHBC
217
66
58
MBC
1255
550
32
EOBC
1396
550
36
FHBC
369
153
47
BOC
R
R
Riiisssuuullltttaaatttiii
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
60
B
B
R
C
A
R
O
BR
RC
CA
APPPR
RO
O
M
M
Maaannnccchhheeesssttteeerrr
ssscccooorrreee
B
B
R
C
A
BR
RC
CA
A111
M
M
Maaannnccchhheeesssttteeerrr
SSScccooorrreee
B
B
R
C
A
BR
RC
CA
A222
0.994
12
20
0.994
12
20
0.316
8
8
0.215
8
8
0.294
10
10
1444
641
57
BOC
190
76
33
EOBC/EOOC
680
306
70
MBC
688
312
42
FHBC
798
376
51
BOC
812
383
51
MBC
938
376
58
BO+OC
767
354
40
FHBC
909
354
40
FHBC
926
354
49
FHBC
927
354
50
FHBC
352
147
37
FHBC
668
147
40
FHBC
471
202
34
EOBC/EOOC
1445
642
55
SHBC
535
229
50
FHBC
1275
557
44
FHBC
1458
651
29
BO+OC
554
240
54
SHBC
765
240
32
FHBC
606
269
42
FHBC
805
379
61
BC+OC
912
419
49
BOC
920
422
39
HBC
127
42
47
MBC
1088
42
37
FHBC
1179
505
47
BOC
1254
549
43
SFBC
1302
568
36
EOBC
1370
604
47
HBC
1498
672
33
EOBC
BRCA2 ex 11
5945delCT
stop 1909
BRCA2 ex 11
2912delC stop 904
BRCA2 ex 11
2912delC stop 904
BRCA2 ex 11
2912delC stop 904
BRCA2 ex 11
6696delCT
stop 2174
BRCA2 ex 11
6696delCT
stop 2174
BRCA2 ex 11
6696delCT
stop 2174
BRCA2 ex 10
1466delT stop 429
BRCA2 ex 10
1466delT stop 429
BRCA2 ex 10
1466delT stop 429
BRCA2 ex 10
1466delT stop 429
BRCA2 ex 20
8803delC stop 2862
BRCA2 ex 20
8803delC stop 2862
BRCA2 ex 11
2275delTC
stop 686
BRCA2 ex 11
3908delTG
stop 1231
BRCA2 ex 8
886delGT stop 223
BRCA2 ex 8
886delGT stop 223
BRCA2 ex 8
886delGT stop 223
BRCA2 ex 11
6636del7 stop 2167
BRCA2 ex 11
6636del7 stop 2167
BRCA2 ex 11
6132del4 stop 2002
BRCA2 ex 11
5776delA stop 1862
BRCA2 ex 11
4510insC stop 1437
BRCA2 ex 10
1827delTG
stop 536
BRCA2 ex 10
1549insA stop 449
BRCA2 ex 10
1549insA stop 449
BRCA2 ex 14
7476delCA
stop 2419
BRCA2 ex 11
5444del4
stop 1739
BRCA2 ex 27A
9996del4 stop 3274
BRCA2 ex 11
6714del4 stop2166
BRCA2 ex 11
4359ins6 stop1377
61
0.377
9
9
0.046
4
4
0.058
5
5
0.022
5
9
0.809
17
16
0.929
10
13
0.702
17
16
0.614
11
11
0.601
16
16
0.567
11
11
0.56
11
11
0.939
8
13
0.93
12
17
0.064
6
6
0.014
4
6
0.442
8
10
0.238
10
10
0.463
12
9
0.533
23
17
0.055
15
16
0.604
14
14
0.584
15
12
0.102
8
8
0.691
13
13
0.544
5
8
0.889
9
12
0.24
12
9
0.015
4
4
0.052
4
4
0.906
20
20
0.107
7
8
1473
657
1477
658
91
28
60/60
MBC
117
37
32
FHBC
165
57
40
BC+OC
311
129
65
MBC
457
191
41
FHBC
468
199
65
MBC
743
341
64
FHBC
1204
524
56
BC+OC
1409
592
61
SFBC
175
65
40/40
FHBC
485
65
73
FHBC
423
175
46
FHBC
707
316
51
BC+OC
734
335
35
FHBC
901
413
68
BOC
905
416
39
BC+OC
971
437
26
EOBC
424
176
38
BC+OC
1346
592
44
SFBC
195
80
37/59
BC+OC
999
444
22
EOBC
122
40
36
FHBC
123
40
58
MBC
708
326
56
MBC
840
397
23
FHBC
612
274
34
FHBC
697
317
72
FHBC
1138
494
50
FHBC
1251
547
58
SFBC
1275
557
44
FHBC
1280
560
68
SHBC
1471
655
67
FHBC
639
285
41
FHBC
26
EOBC
BRCA2 ex 18
8507insCT
stop 2776
BRCA2 ex 23
9235delG stop 3077
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 17
8085G>A W2616X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 22
9106C>T Q2960X
BRCA2 ex 11
6265A>T Q1987X
BRCA2 ex 11
6265A>T Q1987X
BRCA2 ex 2
IVS2+2T>A splice
BRCA2 ex 2
IVS2+2T>A splice
BRCA2 ex 22
IVS21-1 G>A
BRCA2 ex 23
9345G>A P3039P
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 11
5972T>C M1915T
BRCA2 ex 18
8552T>G M2775R
BRCA2 ex 18
8242A>G I2672V
62
0.394
10
10
0.1
7
17
0.952
5
13
0.886
20
19
0.958
10
16
0.667
18
18
0.89
0
10
0.011
9
9
0.242
13
10
0.561
7
10
0.994
20
19
0.853
19
19
0.836
16
16
0.77
18
12
0.706
5
6
0.436
16
16
0.577
16
16
0.201
8
7
0.522
17
14
0.23
7
10
0.904
24
8
0.197
6
5
0.587
15
28
0.994
15
28
0.992
24
23
0.092
10
10
0.002
11
11
0.004
3
3
0.024
5
5
0.238
10
10
0.012
6
6
0.01
5
6
0.22
15
15
0.
645
289
33
FHBC
670
300
64
SHBOC
869
403
34
EOBC
824
390
38
FHBC
1018
453
50
MBC
1039
457
47
FHBC
1326
583
69
BC+OC
1096
473
73
HBC
1228
473
43
HBC
1083
468
64
FHBC
1084
468
55
FHBC
1067
466
58
FHBC
1135
492
63
BC+OC
1191
514
42
BOC
1303
514
46
BC+OC
1418
631
38
BC+OC
572
253
39
BC+OC
580
255
39/44
BOC
585
256
47
BC+OC
1484
662
44
BIL
1299
566
49
SFBC
1300
567
56
BC+OC
1292
648
30
SFBC
1497
671
43
BIL
567
249
49
FHBC
475
343
39
FHBC
782
367
54
BC+OC
1323
581
69
SFBC
1422
633
40
SHBC
BRCA2 ex 10
1342A>C H372N
BRCA2 ex 19
8614C>T P2796S
BRCA2 ex 13
7235G>A R2336H
BRCA2 ex 3
353A>G Y42C
BRCA2 ex 11
6214G>A A1996S
BRCA2 ex 11
5426C>T S1733F
BRCA2 ex 26
9778C>G A3184V
BRCA2 ex 11
3724A>G V1166I
BRCA2 ex 11
3724A>G V1166I
BRCA2 ex 10
2026T>C Y600H
BRCA2 ex 10
2026T>C Y600H
BRCA2 ex 3
353A>G Y42G
ex27 10338G>A
R3370R
BRCA2 ex 11
6359G>C G2044A
BRCA2 ex 27B
10462A>G I3412V
BRCA2 ex 27B
10462A>G I3412V
BRCA2 ex 15
7762C>T L2512F
BRCA2 ex 22
8987T>C Y2920H
BRCA2 ex 11
2192C>G P655R
BRCA2 ex 25
9520T>C Y3098H
BRCA2 ex 19
8386C>T P8614S
BRCA2 ex 11
3744G>A S1172S
BRCA2 ex 11
4296G>A L1356L
BRCA2 ex 18
8331T>G S2701S
BRCA2 ex 22
9078G>A K2950K
BRCA2 IVS25-12
T>C
BRCA2 IVS24-16
T>C
BRCA2 IVS26+76
BRCA2 IVS2+62
C>G
BRCA2 IVS7-14
delT
0.05
5
6
0.043
12
13
0.053
4
4
0128.
13
12
0.418
12
18
0.055
7
8
0.043
11
11
0.047
8
10
0.093
8
10
0.018
4
5
0.022
4
5
0.033
12
9
0.034
5
5
0.656
22
16
0.917
22
16
0.052
8
5
0.073
17
15
0.434
26
20
0.066
8
8
0.
10
11
0.016
4
5
0.078
10
7
0.033
5
5
0.031
9
9
0.774
31
27
0.046
9
10
0.729
29
20
0.005
6
8
0.112
5
5
Tabella8: Elenco completo delle mutazioni trovate nel gene BRCA2
63
4.3.3 Studio dei parenti sani
All’interno del gruppo dei 181 parenti sani, sono state individuate complessivamente 40
mutazioni, di cui 23 a carico di BRCA1 e 17 a carico di BRCA2.
Nel gene BRCA1 sono caratterizzate 12 frameshift, 3 mutazioni nonsenso, 6 missenso ed
una variante intronica e un grande riarrangiamento genico.
Nel gene BRCA2 sono state individuate 9 frameshift, 4 mutazioni nonsenso, una
alterazione del sito di splice e 3 missenso.
N
N..
ppzz
1020
1026
152
411
667
431
432
526
527
528
533
1163
1164
980
924
925
985
986
987
1004
1170
1001
461
1036
1488
1506
550
556
571
940
1028
1461
1217
1398
N
N..
ffaam
miigglliiaa
133
133
12
45
61
140
140
199
199
199
199
480
480
239
313
313
313
313
313
313
362
399
545
457
666
678
234
234
245
432
432
485
485
621
R
Riissuullttaattii
BRCA1del 1-2
BRCA1del 1-2
BRCA1 ex 11 1206 del A Stop 363
BRCA1 ex 11 2072 ins G Stop 672
BRCA1 ex 15 4744 del CT Stop 1572
BRCA1 ex 11 3875 del GTCT Stop 1262
BRCA1 ex 11 3875 del GTCT Stop 1262
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex11 962 del CTCA Stop 296
BRCA1 ex 11 2415 del AG stop 766
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 3901 del T stop 1263
BRCA1ex 11 4117 ins T stop 1355
BRCA1 ex 11 1479 del AG stop 455
BRCA1 ex 20 5382 ins C stop 1829
BRCA1 ex 11 2530 del AG stop 808
BRCA1 ex 11 962 del 4 stop 297
BRCA1 ex 13 4446 C>T R1443X
BRCA1 ex 13 4446 C>T R1443X
BRCA1 ex 11 2061 G648X
BRCA1 ex 11 3748 G>T E1250X
BRCA1 ex 11 3748 G>T E1250X
BRCA1 ex 16 5074 G>A M1652I
BRCA1 ex 16 5074 G>A M1652I
BRCA1 ex 18 5242 C>A A1708E
64
1019
1081
1058
1146
1147
1149
1426
1449
1184
1460
1461
574
162
319
320
372
372
372
613
613
484
485
485
202
BRCA1 ex 11 2781 C>T H888Y
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 5 300 T>G C61G
BRCA1 ex 16 5075 G>A M1652I
BRCA1 ex 16 5075 G>A M1652I
BRCA1 UTR3’ C>A Ser to Arg
Tabella 9: Elenco completo delle mutazioni di BRCA1, riscontrate nei parenti sani
N
N..
ppzz
1050
1051
993
960
975
1037
1395
1439
1462
1476
1747
1490
1523
1524
366
1099
1112
1122
1173
1174
1154
1232
1411
1412
1413
1204
846
1062
967
968
1453
N
N..
ffaam
miigglliiaa
312
312
380
381
381
382
550
604
604
604
657
667
642
642
80
175
175
175
437
437
444
444
444
444
444
524
406
400
332
332
124
R
Riissuullttaattii
BRCA2 ex 11 2912 del C stop 904
BRCA2 ex 11 2912 del C stop 904
BRCA2 ex 11 6696 del CT stop 2174
BRCA2 ex 11 6696 del CT stop 2174
BRCA2 ex 11 6696 del CT stop 2174
BRCA2 ex 11 5776 del A stop 1862
BRCA2 ex 11 5945 del CT stop 1909
BRCA2 ex 11 6714 del 4 stop2166
BRCA2 ex 11 6714 del 4 stop2166
BRCA2 ex 11 6714 del 4 stop2166
BRCA2 ex 18 8507 ins CT stop 2776
BRCA2 ex 10 1466 del T stop 429
BRCA2 ex 11 3908 del TG stop 1231
BRCA2 ex 11 3908 del TG stop 1231
BRCA2 ex 11 6187 C >T
BRCA2 ex 22 9106 C>T Q2960X
BRCA2 ex 22 9106 C>T Q2960X
BRCA2 ex 22 9106 C>T Q2960X
BRCA2 ex 22 9106 C>T Q2960X
BRCA2 ex 22 9106 C>T Q2960X
BRCA2 ex 11 6265 A>T Q1987X
BRCA2 ex 11 6265 A>T Q1987X
BRCA2 ex 11 6265 A>T Q1987X
BRCA2 ex 11 6265 A>T Q1987X
BRCA2 ex 11 6265 A>T Q1987X
BRCA2 ex 17 8085 G>A W2616X
BRCA2 IVS21-1 G>A
BRCA2 ex 23 9345 G>A P3039P
BRCA2 6550 C>T
BRCA2 6550 C>T
BRCA2 ex 13 7235 G>A R2336H
Tabella 9: Elenco completo delle mutazioni di BRCA2, riscontrate nei parenti sani
65
Capitolo 5
DISCUSSIONE
I portatori di mutazioni, nei geni BRCA1 e BRCA2, possiedono un rischio molto
elevato (50-80%) di sviluppare neoplasie mammarie e/o ovariche, nel corso della vita.
Il numero complessivo dei test di genetica molecolare (248.691) segna un significativo
aumento rispetto ai dati del 2004 (190.610), come risulta dall’ultimo censimento SIGU
(Società Italiana di Genetica Umana) nel 2007.
I soggetti da sottoporre al test, sono scelti in una casistica di pazienti già presentanti la
malattia ( a causa della bassa frequenza delle mutazioni dei geni oncosoppressore BRCA
nella popolazione generale), la reale informazione si ha delineando le famiglie ad alto
rischio, ovvero quelle in cui sono presenti individui sani che potrebbero avere ereditato
la mutazione.
Il numero di portatori di mutazione identificati nel nostro studio, comprendente 741
pazienti e 181 soggetti sani, parenti dei pazienti portatori di mutazione,sembrano
coerenti con i dati di letteratura, che assegnano alla forme ereditarie dei mammella e/o
ovaio una percentuale compresa fra il 5% ed il 10%.
Le mutazioni sono distribuite lungo l’intera sequenza genica e non presentano una
topografia definita. Per questa ragione, la ricerca mirata di mutazioni hotspot, non è
adottabile come procedura per l’ esecuzione del test genetico.
La maggior parte delle alterazioni trovate sono mutazioni frameshift e nonsenso, che
portano alla formazione di una proteina tronca, ed hanno quindi un chiaro risultato
patogenetico.
Di più difficile caratterizzazione sono, invece, le numerose missenso, così come le
alterazioni a livello dei siti di splicing.
66
Infatti, non sono disponibili dei test funzionali standardizzati che possano verificare la
funzionalità delle proteine BRCA. Non sì è ancora in grado, quindi, di valutare; per ogni
mutazione missenso, se la sostituzione di un aminoacido o la presenza di uno splicing
alternativo, possano compromettere la funzionalità della proteina.
Contrariamente, per due missenso in BRCA1( T300G e C5242A) e una mutazione
silente (G9345A) in BRCA2, la patogenicità è stata accertata attraverso studi funzionali.
Nel gene BRCA2 è stata rilevata, con maggior frequenza, la mutazione nonsenso a
carico del nucleotide 8085 (esone 17), che introduce un segnale di stop al posto di un
codone codificante per l’ aminoacido triptofano.
Tale mutazione è stata individuata in otto diversi pazienti, non facenti parte della stessa
famiglia. Si ipotizza quindi, di essere di fronte ad una founder mutation, ma sono necessari
ulteriori studi per confermare tale eventualità.
Tra gli 8 pazienti recanti questa mutazione, tre erano maschi. Come loro, anche gli altri
casi di MBC (Male Braest Cancer), presentano una mutazione gene BRCA2.
Il fatto che nella quasi totalità dei pazienti di sesso maschile le alterazioni siano state
ritrovate a carico dell’ oncosoppressore BRCA2, sottolinea l’importanza di questo gene
nello sviluppo del tumore alla mammella maschile.
Nell’ ultimo anno, grazie alla messa a punto della tecnica MLPA, sono stati rilavati
grandi riarrangiamenti genici in una parte dei pazienti in cui, nonostante una percentuale
di rischio elevata, il test risultava non informativo con la metodica del sequenziamento
diretto.
Questo a dimostrazione del fatto che, l’integrazione delle 2 tecniche è essenziale nello
studio mutazionale dei geni BRCA1 e BRCA2, per fornire ai pazienti, che si rivolgono al
Centro di Genetica Oncologica, un risultato che sia il più accurato e preciso possibile.
67
Per quanto riguarda l’uso dei programmi informatici, l’utilizzo combinato del
BRCAPRO e del Manchester Scoring System fornisce dati di grande supporto ai criteri
clinici; soprattutto il secondo software, grazie alla sua capacità di estendere lo studio
dell’albero genealogico di ogni singolo paziente ai parenti di grado superiore al secondo
e di poter tenere in considerazione la presenza di altri tipi di tumore, oltre a quello
mammario ed ovarico.
I dati forniti dai due sistemi sono stati, nella maggior parte di casi, congrui tra loro. Lo
screening per l’individuazione dei portatori di mutazione risulta quindi avere un’efficienza
molto elevata.
L’utilità del test genetico riguarda quindi la diagnosi precoce e le strategie mediche
preventive, applicabili naturalmente solo ai parenti sani, portatori di mutazione, dei
pazienti analizzati.
Attualmente, uno dei problemi che ci si presenta, è l’interpretazione delle varianti
introniche a significato sconosciuto poiché, se da una parte non è accertato il loro
coinvolgimento nello sviluppo della malattia, dall’altra non si hanno evidenze per
escluderne la patogenicità.
Per questa ragione sono in fase di allestimento, con opportune metodiche, dei saggi che
permetteranno di chiarire il loro eventuale coinvolgimento nell’insorgenza della
neoplasia.
68
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