Esempi di piante con contento di sostanze nutraceu.che o<enute mediante ingegneria gene.ca Antonella Leone Dipar.mento di Farmacia Università di Salerno Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoA nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. • amido meno digeribile -­‐Transito intes;nale -­‐diabete • barbabietola che produce fru>ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Vitamina A Piante transgeniche di interesse alimentare con contebuto elevato di vitamina e micronutrienti La vitamina A (retinolo) è essenziale alla crescita umana. Il nostro corpo non produce vitamina A, e la possiamo incamerare dalla dieta per due vie: - 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il vitamina A nell’intestino. - ingestione diretta da alimenti animali e supplementi. Tutti i carotenoidi che contendono anelli β possono essere convertiti in retinolo, e una delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi è il β-carotene Biosintesi della vit. A dal beta-­‐carotene 400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in particolare in Asia e Africa. VAD rende I bambini particolarmente suscettibili ad infezioni. 0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa della VAD Il ricorso a supplementi in vitamina A è riuscito a ridurre I problemi del 50% nelle aree soggette, ma ciò risulta molto oneroso e non utilizzabile in tutte le aree. E1 PP IPP PP E2 GGPP-Synthase E3 Phytoene-Synthase Phytoene Synthase Phytoene Desaturase Phytofluene E4 E5 (Cis/trans Isomerase?) ζ-Carotene E6 ζ-Carotene Desaturase E7 Lycopene cis/trans Isomerase E8 α, β-Lycopene Cyclase DMAPP PP GGPP Phytoene Neurosporene Lycopene β-Carotene α-Carotene Sono espressi questi geni nell‘endosperma del riso ?? Biosintesi di terpeni in pinata CYTOPLASM MVA pathway MITOCHONDRIA Ubiquinones FPP Ace.l-­‐Coa AACT x2 Acetoacetyl-­‐CoA HMGS HMG-­‐CoA PMK PMD Cytokinins Thiamine DXR MEP CMS CDP-­‐ME CMK MCS ME-­‐cPP HDS HMBPP MVPP IDS DMAPP IDI IPP IPP IDI DMAPP x3 GGPP x1 x3 x2 FPS Sesquiterpenes DXS DXP CDP-­‐MEP MVP GGPS PLASTID G3P+Pyruvate DMAPP MVA MVK Pyridoxol FPS IPP MHGR MEP pathway FPP Phytosterols Brassinosteroids GPS GPP Monoterpenes Chlorophylls Carotenoids Tocopherols ABA Phylloquinones Plastoquinones Gibberelins Polyprenoids Isoprene GGPS GGPP Diterpenes E1 PP IPP Wild-type rice endosperm PP E2 GGPP-Synthase E3 Phytoene-Synthase Phytoene Desaturase Phytofluene E4 E5 (Cis/trans Isomerase?) ζ-Carotene E6 ζ-Carotene Desaturase E7 Lycopene cis/trans Isomerase E8 α, β-Lycopene Cyclase DMAPP PP GGPP Phytoene Neurosporene Lycopene β-Carotene α-Carotene GGPP, il precursore genrale dei terpeni, è sintetizzato nell‘endosperma di cariossidi di riso...ma nel genoma di riso gli altri geni non sono presenti! E1 PP IPP Wild-type rice endosperm PP E2 GGPP-Synthase E3 Phytoene-Synthase Phytoene Synthase Phytoene Desaturase Phytofluene E4 E5 (Cis/trans Isomerase?) ζ-Carotene E6 ζ-Carotene Desaturase E7 Lycopene cis/trans Isomerase E8 α, β-Lycopene Cyclase DMAPP PP GGPP Phytoene Neurosporene Lycopene β-Carotene α-Carotene Difficile inserire medinate trasformazioe sei geni!!! transformed E. coli Erwinia carotovora carotenoid gene cluster crtE ORF2 ORF3 ORF4 crtX crtY crtI crtB ORF6 CrtI substitutes for 4 plant genes crtZ ORF12 Cyanobacteria e Piante 15-cis-Phytoene E4 E5 Batteri 15-cis-Phytoen PDS Ζ-ISO ?? 9, 15, 9‘-tri-cis-z-Carotene gene CRTI E6 ZDS 9, 9‘-di-cis-z-Carotene E7 CRTISO 7, 9, 9‘, 7‘-tetra-cis-Lycopene all-trans-Lycopene all-trans-Lycopin B Plant Desaturation pathway CrtI shortcut A E1 PP IPP Wild-type rice endosperm PP E2 GGPP-Synthase E3 Phytoene-Synthase Phytoene Desaturase Phytofluene E4 E5 (Cis/trans Isomerase?) ζ-Carotene E6 ζ-Carotene Desaturase E7 Lycopene cis/trans Isomerase E8 α, β-Lycopene Cyclase DMAPP PP GGPP E3 Phytoene CrtI Neurosporene Lycopene E7 β-Carotene α-Carotene ´Tre geni invece di sei!!!! Gt1p 35Sp (1) pZPsC E3 (PSY) aph IV E,4,5,6,7 (tp-CrtI) 35Sp Gt1p (2) pZLcyH Gt1p tp aphIV E8(ß-LCY) promotore glutelina, proteina di riserva dell’endosperma di riso peptide di transito ssRubisco igromicina fosfotransferasi 1.6 µg/g beta-carotene Possibilità di aumentare ulteriormente il contenuto in beta-carotene? …Goldrn rice 1 4,8 – 7,1 µg/g beta carotene aph IV Gt1p 35Sp pB19hpc E3 (PSY) E4,5,6,7 (tp-CrtI) 0.018 0.016 Single transformant hpc 2b 0.008 0.006 α-Carotene Lutein 0.010 Zeaxanthin 0.012 0.004 …why is Golden Rice golden (yellow) instead of red??? 0.002 0.000 -0.002 0 20 40 …Lesson learned: no need for lycopene ß-cyclase ß-Carotene 0.014 60 80 100 Ye et al., 2000; Science 287:303 E1 PP PP IPP E2 GGPP-Synthase E3 Phytoene-Synthase Phytoene Synthase Phytoene Desaturase Phytofluene E4 E5 (Cis/trans Isomerase?) ζ-Carotene Neurosporene E6 ζ-Carotene Desaturase Lycopene E7 Lycopene cis/trans Isomerase DMAPP Wild-type rice endosperm PP E3 GGPP Phytoene CrtI E8 β-Carotene Xanthophylls α, β-Lycopene Cyclase α-Carotene Schaub et al. (2005), Plant Physiol. 138: 441 Fitoene Carotene Licopene α Carotene Luteina Luteina- 5-6 eposside β carotene Zeaxantina Anteraxantina Violaxantina Neoxantina ‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm’. Ye et al., Science 287,303-305 (2000). Due T-DNAs codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore selettivo) sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation LB RB pro Narciso 1 ter pro LB pro pro DaffNarciso 2odil ter2 Daffodil 1 = phytoene synthase Daffodil 2 = lycopene ß-cyclase tp Erwinia Hyg resis ter ter RB With own native transit peptides and endospermspecific promoter from rice glutelin (GT1 promoter) Erwinia = Erwinia double desaturase - with added transit peptide, expressed from 35SCaMV promoter La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante. La migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene RISO DORATO Geranyl-geranyl diphosphate Phytoene Phytoene synthase (gene vegetale) Phytoene desaturase (gene batterico) ζ-carotene lycopene Carotene desaturase (gene batterico) lo stesso gene lycopene cyclase (gene vegetale) β-carotene Nell’uomo Vitamin A Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23:482-487. In molte pathways biosintetiche multi steps esistono degli steps limitanti. Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di PSY (gene codificante per la phytoene synthase) . Dopo aver provato diversi gei PSY provenienti da diverse fonti è stato provato che la combinazione gne del mais e del riso davano la migliore combinazione Golden Rice2 che è stato ottenuto accumulava 37 µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte quello del Golden Rice precedente. GT1pI pSYN12424 tp-CrtI GT1pI ZmPSY ubi1p PMI pZPsC pZLcyH pSYN12424 Golden rice 1 37 mg per kg di cariosside Golden rice 1 1,6 mg/kg cariosside Figura 10.11. Contenuto in provitamina A nel golden rice. a) riso indica non modificato geneticamente e normalmente privo di carotenoidi nella cariosside; b) golden rice 1 con un contenuto in carotenoidi medio di per kg di cariosside; c) golden rice 2 con un contenuto in carotenoidi fino a 37 mg per kg di cariosside. Golden Rice2 che è stato ottenuto accumula 37 µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte quello del Golden Rice precedente. uno degli articoli che presenterete! Ingegneria metabolica dei carotenoidi in piante diverse Ricostruzione della via biosinte.ca dei carotenoidi in E. coli ©2011 by American Society of Plant Biologists Via biosintetica degli antociani nelle piante Molto complessa, molti geni biosintetici coinvolti identificati fattori di trascrizione che controllano in maniera coordinata l’epressione di molti geni di questa via metabolica Antirrhinum majus delila fattore di trascrizione bHLH( basichelix-loophelix) Rosea1 fattore di trascrizione R2R3-MYB Antirrhinum majus E8 promotore frutto-specifico di un gene della biosintesi dell’etilene (ormone della maturazione dei frutti climaterici) Antioxidant capacity of purple compared to red tomatoes Red tomato – supplemented pellets Purple tomato – supplemented pellets p53-/p53- knockout mice Life span, pathology Diet Number of mice Average Lifespan (days) Std Error Maximum Lifespan (days) Standard diet 24 142.0 8.7 211 Diet supplemented with 10% red tomato powder 15 145.9 12.6 213 Diet supplemented with 10% purple tomato powder 20 182.2 8.6 260 Lucilla Titta, Marco Giorgio Via biosinte>ca semplificata della lisina, me>onina, treonina e isolecuicna aspartato DHDP di-­‐idrodipicolinato glicina treonina OPH O-­‐fosfo-­‐omoserina ASD aspartato semialdeide AK apartato chinasi DHDP sintasi lisina TS treonina sinatsi me>onina SAMS adenosin-­‐me>onina isoleucina CGS cista>onina γ sintasi MGL me>onina γ liasi LKR/SDH enzima bifunzionale Lys-ketoglutarate reductase/ saccharopine dehydrogenase SAMS S adenosin-­‐me>onina sintasi Carenza di amminoacidi essenziali Lisina e metionina sono gli amminoacidi essenziali limitanti delle proteine di riserva dei semi cereali e dei legumi Il basso contenuto in Lys e Met diminuisce il valore nutrizionale di queste due colture del 50–75%, rispetto a diete con un contenuto bilanciato di amminoacidi essenziali La carenza di questi aa causa deficienze non specifiche nell’uomo, quali un più alto rischio a contrarre malattie, ritardo mentale e nello sviluppo fisico di bambini/e Sindrome conosciuta come PEM Protein-Energy Malnutrition (PEM) La WHO stima che circa il 30% delle popoalzione dei Paesi in via di sviluppo soffre per queste carenze Carenza di amminoacidi essenziali il gene batterico feedbackinsensitive DHDPS gene (isolato da Corynebacterium glutamicum) sovra-espresso sotto il controllo di un promotore endosperma o embrione-specifico (b32 del gene dell’albumina dell’endosperma)! Una sequenza “invertita e ripetuta” corrispondente alla sequenza parziale del cDNA del gene ! LKR/SDH inserita in un introne di una cassetta di espressione che contiene il cDNA del gene CordapA! L’espressione di questo transgene genera un RNA double-strand e del mRNA del CordapA Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine biosynthesis and catabolism in corn with a single bifunctional expression/silencing transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13– 21. Carenza di amminoacidi essenziali Frizzi, A. et al (2008) Modifying lysine biosynthesis and catabolism in corn with a single bifunctional expression/silencing transgene cassette. Plant Biotechnol. J. 6, 13–21. La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per produrre alimenti, mangimi, amido e alcool. Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la produzione di albumina nei semi presentano un buon bilanciamento aminoacidico 2 costrutti alternativi. Promotore constitutivo o tuberospecifico p35S CaMV AmA1 pGBSS AmA1 Nos 3’ Nos 3’ pSB8 pSB8G l’espressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si utilizza il promotore GBSS promoter piuttosto chi il 35S Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato Contenuto proteico totale incrementato del 35-45% 8- Fold increase 4- 1D E S G H R T A P Y V M C I L F K Amino acid Le piante producono il doppio rispetto al wild-type L’albunia di Amaranthus non è allergenica : - già utilizzata come farina in Messico e Sud America - test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche ©2011 by American Society of Plant Biologists Via biosintetica degli antociani nelle piante Molto complessa, molti geni biosintetici coinvolti identificati fattori di trascrizione che controllano in maniera coordinata l’epressione di molti geni di questa via metabolica Sovraespressione di due geni regolatori di A. majus (MYB Rosea1 e bHLH Della) nel frutto determina accumulo di antocianine nella polpa e nella buccia Promotore frutto-specifico E8 Topi malati di cancro p53-/p53- Dieta Numero di topi Vita media gg Errore standard Vita Massima gg standard 24 142.0 8.7 211 + pomodoro rosso 15 145.9 12.6 213 + pomodoro viola 20 182.2 8.6 260 Butelli et al, 2008 - Nature Biotech 26: 1301-1307 Effect of Chronic Consumption of Anthocyanins on the Sensitivity to ex Vivo IschemiaReperfusion Injury as Assessed by Infarct Size in Rats.Open symbols represent individual values, and closed symbols are means ± 6 se, n = 10/group. *Different from anthocya... Martin C et al. Plantcell 2011;23:1685-1699 ©2011 by American Society of Plant Biologists I FITOESTROGENI Sono sostanze naturali, prodotte dalle piante, che hanno un’azione simile agli estrogeni, gli ormoni femminili. La loro attività biologica, è in media 1000 volte più lieve rispetto agli estrogeni endogeni prodotti dal corpo umano. Principali classi • ISOFLAVONI (legumi, soia, lenticchie, piselli, fagioli) • LIGNANI (cereali, frutta, vegetali) • CUMESTANI (germogli di trifoglio, foraggio) I RECETTORI ESTROGENICI FITOESTROGENI PREVENZIONE DI MALATTIE CARDIOVASCOLARI CANCRO AL SENO OSTEOPOROSI 2 E’ possibile aumentare ulteriormente il contenuto di isoflavoni nelle piante? Ingegneria genetica e metabolica INGEGNERIA METABOLICA DEGLI ISOFLAVANOIDI 35S-CaMV IFS Biosintesi dei flavonoidi Plasmide di A. tumefaciens Piante non trasformate genisteina n IFS1 Piante che sovraesprimono il gene IFS1 Via biosinte.ca degli isoflavoni Sovra-­‐espressione del gene IFS in combinazione con altri geni della via biosinte.ca degli isoflavoni antisenso Sintesi di genisteina in piante transgeniche di petunia, tabacco e la<uga Contenuto in genisteina in fruA di pomodoro che sovraesprimono il gene IFS • Ci vediamo Lunedi’ 25 Novembre Sovra-­‐espressione del gene OsNAS in piante di riso ed aumento del contenuto in ferro e zinco nell’endosperma Nico>anamine (NA), un agente chelante è presente ubiquitariamente nelle piante superiori. Nelle gramininacee è un precursoree dei fitosiderofori, sostanze che sono rilasciate nel suolo dall’apparato radicale e che facilitano l’assorbimento del ferro dal suolo acquisi>on. Il gene (OsNAS1), che codifica una nicotianamine sintasi è stato fuso al promotore di una proteina seme –specifica (la glutelina) ed usato per trasformare piante di riso Concentrazione di ferro e zinco in cariossidi di riso di piante che sovraesprimono il gene OsNAS L’ Apo-lipoproteina A-I è la maggiore componente proteica delle liporpoteine ad alta densità (HDL= nel plasma questa lipoproteina promuove l’efflusso del colesterolo dai tessuti verso il fegato per la secrezione. Piante transgeniche di promodoro che esprimono il peptide mimetico 6F dell’apo-lipoproteina apoA-I. Topi knock-out incapaci di rimuovere lipoproteine di tipo LDL sviluppano infiammazioni e aterosclerosi con dieta ad alto contenuto in grassi ApoA-I mimetics: tomatoes to the rescue J. Lipid Res. 2013 54:(4) 878-880. First Published on March 7, 2013, Questi topi alimentati con pomodori che esprimono il peptide mimetico 6F hanno • più bassi livelli di infiammazione • livelli più alti di HDL • bassi livelli di acido liso-fosfatidico, che promuove e accelera la formazione di placche nelle arterie Omega-­‐3 Canola and Soybean oil Scientific Progress Multi-gene Non-­‐transgenic ω-­‐3 90 80 Fatty Acid (wt%) expression Soybean transformation Omega-3 oil production 100 70 60 50 40 30 Canola Soybean Steari-­‐ New biodonic available acid Omega-3 18:4 Other polyunsaturates Monounsaturates 20 10 0 Saturates Control Biotech Control Biotechin CVD Omega-3 Deficiency Implicated Echium oil, derived from the seeds of Echium Plantagineum, is enriched in stearidonic acid (SDA; 18:4 ω-­‐3), which is the immediate product of Δ-­‐6 desatura.on of 18:3 ω-­‐3 to 18:4 Contenuto in LCP-­‐UFA in salmone e in differen. piante transgeniche Ingegneria genetica e riduzione di allergeni /fattori antinutrizionali Benefici Prodotto genico Specie Target riso allergeni della farina loglio allergene del polline riduzione di asma e febbre da fieno lol p 5 antisenso patata glicoalcaloidi riduzione tossicità tubero solanidina-glucosil trasferasi antisenso proteina allergenica riduzione di di 16 kDa asma ed eczema Tecnologia antisenso Piante transgeniche di pomodoro con rallentata maturazione del fru<o Sintesi dell’e.lene LB isadisso CCA promotore S35-­‐ CaMV nos nptII an.senso piante di pomodoro Giorni Ormone della maturazione del fru<o, induce geni che codificano per enzimi degrada.vi 5’ 3’ mRNA 5’ Formazione di un duplex 3’ mRNA an.senso Traduzione bloccata Giorni 50 57 53 66 55 68 57 70 60 73 63 76 65 79 73 97 GENE GENE E.lene -­‐ + RB Soia Quantità di lisina Quantità di acidi grassi poli-insaturi Colza Contenuto in acido erucico Caffè Contenuto in caffeina Pomodoro aumento di antiossidanti (licopene etc) Sono in corso ricerche per aumentare il contenuto di sostanze nutriceutiche di molte piante alimentari Per la presentazione ppt Usare font arial dimensione 24-28 per i titoli dimensione 18-20 per il testo Scegliere la combinazione colore sfondo /testo evitare diapositive affollate Trasformazione genetica delle piante T-DNA selvatico T-DNA recombinante Organizzazione di un gene Gene Promotore DNA Sequenza codificante l’RNA 5’ 3’ Terminatore 3’ 5’ Sito di inizio della trascrizione Sito di terminazione della trascrizione