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www.ijohey.it - Italian Journal of Occupational and Environmental Hygiene
Development of a new analytical method for the biological monitoring of occupational exposure to benzene, Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons and nicotine by HPLC/MS/MS
Studio preliminare per l’analisi simultanea mediante HPLC/MS/MS dei
metaboliti urinari di Benzene, Idrocarburi Policiclici Aromatici e nicotina
Enrico Paci*, Giovanna Tranfo
INAIL Ricerca (ex-ISPESL), Dipartimento di Medicina del Lavoro - Roma
*Corresponding author:
Enrico Paci, INAIL Ricerca (ex-ISPESL), Dipartimento di Medicina del Lavoro, Via Fontana Candida, 1, 00040 Monteporzio Catone
(RM), Italy; Ph. ++39 06 94181509; e-mail: [email protected]
The Biological monitoring of occupational exposure to benzene is currently performed by determination of the urinary
metabolites S-phenyl-mercapturic acid (SPMA) or trans,trans-muconic acid (t,t-MA) in the end shift urine samples; both
biomarkers are fully validated, but still suffer from some problems: in the case of SPMA those are related both to the existence of a precursor that can be turned into SPMA by acidic hydrolysis and to the different human genotypes for the
enzyme glutathione-S-transpherase which, in turn, affects the excretion of this metabolite; t,t-MA, on the other hand, is
not a benzene specific metabolite, as it is also produced after ingestion of sorbic acid, a widespread food preservative,
also contained in fruits. Excluding particular tasks in chemical and petrochemical industry, benzene exposure depends
mainly from traffic, because is a component of gasoline; exposed workers (drivers, policemen, gas station attendants)
are significantly exposed to benzene and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, a large class of substances, some of which
carcinogenic, deriving from organic compounds incomplete combustion, and therefore also from traffic pollution. The
biological monitoring for PAH exposure can be performed by the analysis of urinary 1-hydroxypyrene (1-OHPy), a pyrene metabolite, a non carcinogenic substance always present in PAH mixtures. Moreover cigarettes smoke is a strong
confounding factor, since it is a great source of benzene and PAH exposure. In this study we have developed a new
method for simultaneous analysis of the two benzene exposure biomarkers and of the 1-OHPy, that takes into account
pre-analytic requirements of all the molecules, quantitatively determined in human urine by HPLC/MS/MS; the determination of cotinine, the metabolite of nicotine, is simultaneoulsly performed, in order to evaluate active and passive cigarettes smoke exposure, as confounding factor, even if the assessment of the amount produced by second-hand smoke
could require a further improvement of quantification limits.
Key words: S-phenyl-mercapturic acid, trans,trans-muconic acid, cotinine, 1-Hydroxypyrene, biological monitoring
Il monitoraggio biologico dell’esposizione lavorativa a benzene prevede l’analisi dell’acido S-fenilmercapturico (SPMA)
o dell’acido trans,trans-muconico (t,t-MA) nelle urine di fine turno; entrambi gli indicatori sono ampiamenti validati, ma
sono affetti da alcune problematiche: nel caso dell’SPMA esiste un precursore che si trasforma in SPMA per idrolisi
acida; inoltre il gene che codifica l’enzima glutatione-S-transferasi è un gene polimorfo con conseguente diversa produzione del metabolita; il t,t-MA invece non è un metabolita specifico del benzene, ma anche dell’acido sorbico, un conservante alimentare contenuto anche nella frutta. Al di fuori di particolari mansioni dell’industria chimica e petrolchimica, l’esposizione a benzene deriva in massima parte dal traffico, essendo un costituente delle benzine; i lavoratori
esposti alle emissioni auto veicolari sono esposti in maniera significativa sia a benzene che ad idrocarburi policiclici
aromatici (IPA), il cui monitoraggio biologico prevede l’analisi dell’1-idrossipirene urinario (1-OHPy). In questo studio
è stato messo a punto un nuovo metodo per l’analisi simultanea mediante HPLC/MS/MS di SPMA, t,t-MA e 1-OHPy in
campioni di urina di lavoratori; l’analisi con esposti. L’analisi della cotinina, metabolita della nicotina, viene effettuata
simultaneamente per valutare l’esposizione a fumo di sigaretta attivo e passivo, quale fattore di confondimento. Infatti
il fumo di sigaretta è una notevole fonte di esposizione a benzene ed IPA, anche se la valutazione delle quantità dovute al fumo passivo potrebbero richiedere un ulteriore miglioramento dei limiti di quantificazione.
Introduzione
Il monitoraggio biologico dell’esposizione occupazionale a
benzene, cancerogeno accertato ed inquinante ubiquitario,
viene effettuato mediante analisi dell’acido S-fenilmercapturico (SPMA) o dell’acido trans,trans-muconico (t,t-MA),
metaboliti escreti nelle urine per i quali esistono degli indici biologici di esposizione (BEI) nelle urine di fine turno di
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25 µg/g creat. e di 500 µg/g creat. rispettivamente [ACGIH,
2010]; entrambi gli indicatori sono ampiamente validati,
ma entrambi soffrono di problemi. Nel caso dell’SPMA,
che si forma per coniugazione del benzene epossido con il
glutatione ridotto, l’esistenza di diversi genotipi relativi ai
geni che codificano per la sintesi dell’enzima glutatione Stransferasi, causano una variabilità interindividuale nella
produzione di questo metabolita [Mansi et al., 2011]; alcuItal. J. Occup. Environ. Hyg., 2012, 3(2) | 99 - 102
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ni autori [Carrieri et al., 2006; Fustinoni et al., 2005] riportano inoltre una cattiva correlazione fra il monitoraggio
ambientale del benzene e quello biologico effettuato utilizzando l’SPMA, per cui una possibile ulteriore causa è l’esistenza in urina di un precursore dell’SPMA, l’N-acetylS(1,2-dihydro-2-hydroxyphenyl)-L-cysteine (pre-SPMA),
che può essere però idrolizzato ad SPMA mediante acidificazione [Sabourin et al., 1988; Inoue et al., 2000; Inoue et
al., 2001; Paci et al., 2007]. Il t,t-MA invece non è un metabolita specifico del benzene, ma anche dell’acido sorbico,
un conservante alimentare ampiamente utilizzato e presente anche nella frutta [Weaver et al., 2000]. Il fumo di sigaretta, sia attivo che passivo, essendo una notevole fonte di
esposizione a benzene, è un fattore di confondimento
accertato nel monitoraggio biologico dell’esposizione a
benzene, in particolare se effettuato allo scopo di una valutazione dell’esposizione lavorativa; tuttavia spesso i questionari somministrati ai lavoratori non sono sufficientemente esaurienti da permettere di valutare l’entità del contributo dovuto al fumo: questo può essere realizzato con
un contemporaneo monitoraggio della cotinina, metabolita urinario della nicotina derivante al fumo di tabacco
[Fustinoni et al., 2005]. L’esposizione della popolazione
generale a benzene deriva in massima parte dal traffico veicolare, essendo un costituente delle benzine; i lavoratori
soggetti a tale esposizione (autisti, benzinai, vigili urbani,
etc.) sono tuttavia esposti nello stesso tempo anche ad idrocarburi policiclici aromatici (IPA), una vasta classe di composti alcuni dei quali sono agenti cancerogeni accertati;
essi derivano dalla combustione di composti organici e
perciò anche dalle emissioni dei veicoli, specialmente diesel: il monitoraggio biologico viene effettuato, a questo
scopo, mediante l’analisi dell’1-OHPy urinario, metabolita
del pirene, idrocarburo non cancerogeno ma sempre presente nelle miscele di IPA, e come tale indicatore rappresentativo di una esposizione a tali sostanze [ACGIH, 2011].
Per una valutazione più approfondita dell’esposizione dei
lavoratori citati ai principali inquinanti organici derivanti
dal traffico si suggerisce quindi di effettuare il monitoraggio biologico per benzene, IPA e nicotina: tuttavia i diversi metodi di analisi sinora validati per questi indicatori permettono l’analisi solo di un indicatore alla volta, a causa
delle intrinseche caratteristiche chimico-fisiche dei differenti metaboliti, che sono in parte acidi (SPMA, t,t-MA ed
1-OHPy) ed in parte basici (cotinina), e dal diverso grado
di idrofobicità delle molecole, che rendono difficoltosa
l’estrazione simultanea di essi da un campione biologico.
Il nuovo metodo di analisi HPLC/MS/MS in fase di sperimentazione nel nostro laboratorio permette invece l’analisi simultanea dei due indicatori di esposizione a benzene
SPMA e t,t-MA, dell’1-OHPy e della cotinina, in campioni
di urina umana.
Materiali e metodi
5 ml di urina, conservata congelata a -25 °C dal momento del prelievo, sono acidificati a pH 5 con acido cloridri100 | Ital. J. Occup. Environ. Hyg., 2012, 3(2)
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co 6 N ed incubati per 16 ore a 38 °C con 25 µl di enzima ß-glucuronidasi-arilsolfatasi da Elix Pomatia (Roche
Diagnostics), allo scopo di idrolizzare l’1-OHPy legato
all’acido glucuronico; vengono quindi aggiunti gli standard interni deuterati, Cotinina-D3, t,t-MA-D4, SPMA-D2,
1-OHPy-D9 (CDN Isotopes), ed il campione è ulteriormente acidificato a pH 2 mediante aggiunta di HCl 6 N
(circa 50 µl). Per la successiva purificazione del campione
sono utilizzate cartucce per estrazione in fase solida (SPE)
Sep-pak C18, 360 mg (Waters), condizionate con 3 ml di
metanolo e 3 ml di acido acetico al 2% v/v in acqua con
la seguente procedura: dopo caricamento del campione la
colonnina viene lavata con 3 ml di acido acetico al 2% v/v
in acqua, e l’eluato complessivo ottenuto dal caricamento
e dal lavaggio viene portato a pH 8 mediante aggiunta di
ammoniaca 30% v/v. Le cartucce vengono quindi eluite
con 1,5 ml di metanolo ed a seguire con 1 ml di etile acetato, ottenendo l’eluato “A”, contenente i metaboliti acidi,
ovvero SPMA, t,t-MA e 1-OHPy; la precedente aliquota di
eluato alcalinizzato a pH 8 viene ricaricata sulla cartuccia,
precedentemente ricondizionata con 3 ml di metanolo e 3
ml di acqua; segue un lavaggio con 3 ml di acqua e infine
l’eluizione con 2,5 ml di metanolo, ottenendo l’eluato
“B”, contenente la cotinina. I due eluati sono miscelati,
ottenendo circa 5 ml di campione. Dopo filtrazione su
microfiltri a membrana inorganica Anotop 10 I.C. da 0.2
µm, il campione viene quindi analizzato mediante un
HPLC Perkin Elmer series 200, accoppiato ad un rivelatore MS/MS API-4000 (Applied Biosystem) con sorgente
Turbo Ion Spray. L’analisi mediante HPLC è stata effettuata utilizzando una colonna Synergi Fusion-RP 80A, 150 x
4.6 mm (Phenomenex) mediante un gradiente di acetonitrile (fase A) e acido acetico 1% v/v in acqua (fase B) come
segue: 2 min di equilibratura con 10% di A e 90% di B,
quindi 12 min a gradiente lineare fino a 100% di A; a
seguire 2 min di isocratica, e ritorno con gradiente lineare
alle condizioni iniziali in 2 min. La colonna è stata termostatata a 40 °C. Il flusso è stato mantenuto a 600 µl·min-1
per i primi 12 min, portato a 1000 µl·min-1 per i successivi 2 min, quindi riportato a 600 µl·min-1. Il volume iniettato è stato di 20 µl. Le transizioni ioniche monitorate sono
state: +177.3/80.1 per la cotinina, (+180.3/80.1 per la
cotinina D3); -141/97 per il t,t-MA (-145/100.0 per il t,tMA D4); -238.1/109 per l’SPMA (-240.1/109.1 per l’SPMA
D2); -217.1/189.0 per l’1-OHPy (-226.0/198.1 per l’1OHPy D9); l’analisi MS/MS è costituita da 2 periodi, il
primo di 4 min in modalità positiva per l’analisi della cotinina, il secondo di 12 min in modalità negativa per l’analisi degli altri metaboliti, con tempo totale di 16 min.
Risultati e discussione
L’ACGIH suggerisce come momento corretto per il campionamento delle urine il “fine turno lavorativo” per
SPMA e t,t-MA, mentre il “fine turno lavorativo di fine settimana” per l’1-OHPy. E’ chiaro che gli indicatori hanno
cinetiche molto diverse e quindi per poter applicare que© The Italian Association of Industrial Hygienists - AIDII [2012]
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sto metodo occorrerà effettuare il prelievo delle urine dei La notevole differenza di intensità evidente fra i picchi
lavoratori nel momento giusto, cioè quello suggerito per relativi ai 4 metaboliti è dovuta alle differenze di concenl’1-OHPy (f.t.f.s.l.). Questo chiaramente non è applicabile trazione dei metaboliti aggiunti, che rispecchia quella attenel caso della determinazione di valori di riferimento nella sa nei campioni reali, dove ad esempio la cotinina arriva
popolazione generale. L’acido S-fenilmercapturico è pre- a mostrare una concentrazione oltre 2 ordini di grandezza
sente nelle urine in parte sotto forma del suo precursore maggiore di quella dell’1-OHPy, in soggetti fumatori.
(pre-SPMA), in percentuale dipendente dal pH dell’urina I limiti di rivelabilità sono stati stimati come 3 volte il
stessa; l’acidificazione consente di idrolizzare tale precur- rumore di fondo del cromatogramma a tempi prossimi a
sore trasformandolo in SPMA ed uniformando i valori ana- quello di uscita del picco, mentre il limite di quantificaziolitici ottenuti, altrimenti dipendenti dal diverso pH di ogni ne è stato stimato come 10 volte tale rumore di fondo.
urina. Il metodo di determinazione del solo SPMA preve- I dati sono riportati in Tabella 1.
de una idrolisi con acido solforico 9 M
[Paci et al., 2007] che non può essere
utilizzata in questo metodo, poiché
determinerebbe la rapida degradazione
del t,t-MA; il pH 2 si è dimostrato invece un valido compromesso fra l’esigenza di uniformare i risultati ottenuti per
l’SPMA ed effettuarne la misura insieme
al t,t-MA [Sterz et al., 2009].
Parte essenziale di questo metodo è la
fase preliminare di purificazione mediante SPE, che permette di concentrare i
metaboliti da analizzare, eliminando nel
contempo la maggior parte delle sostanze interferenti. La separazione preliminare mediante SPE si basa sulle diverse
caratteristiche acido-base delle molecole: operando ad un pH adatto è possibile Figura 1: Cromatogramma di campione di urina arricchito con standard
trattenere sulla cartuccia, avente caratte- dei metaboliti in concentrazioni riscontrabili in un soggetto fumatore:
-1
-1
-1
-1
ristiche lipofile, la molecola indissociata Cotinina 500 µg·l , t,t-MA 100 µg·l , SPMA 5 µg·l , 1-OHPy 1 µg·l
(cioè nella forma meno polare); quindi si
Tabella 1: Sensibilità del metodo e concentrazioni attese per ciascun
utilizza nella prima fase un ambiente
biomarcatore
acido per trattenere e poi eluire le moleLimite di
Concentrazione
cole acide (SPMA, t,t-MA e 1-OHPy).
Limite di
media attesa in un
Alcalinizzando l’eluato del primo cari- Indicatore di esposizione rivelabilità (µg·l-1) quantificabilità
(µg·l-1)
fumatore (µg·l-1)
camento contenente la cotinina, che ha
caratteristiche basiche, è possibile nella
Cotinina
0,80
2,00
500
seconda fase trattenerla sulla cartuccia e
0,01
0,03
5
poi mediante un solvente organico in Acido S-fenilmercapturico
grado di desorbire la molecola, eluirla.
0,50
2,00
100
Le due frazioni vengono poi riunite per Acido trans,trans muconico
permettere l’analisi cromatografica in
1-idrossipirene
0,02
0,05
1
simultanea. Nella Figura 1 è mostrato il
cromatogramma relativo ad un campione di urina arricchito con standard puri dei metaboliti in Conclusioni
esame, in concentrazioni riscontrabili in un soggetto
Il metodo presentato si è dimostrato sufficientemente senfumatore: cotinina 500 µg·l-1, t,t-MA 100 µg·l-1, SPMA 5
sibile da consentire il monitoraggio della esposizione a
µg·l-1, 1-OHPy 1 µg·l-1; il campione arricchito è stato sotbenzene ed IPA anche a basse dosi, quali quelle presenti
toposto al procedimento di purificazione SPE ed è stato
a livello della popolazione generale non fumatrice.
analizzato secondo il metodo sopra riportato. I picchi di
I futuri obiettivi di una ulteriore sperimentazione sono:
eluizione risultano ben risolti e separati dai pochi interferenti ancora presenti nel campione purificato: i tempi di • il miglioramento della sensibilità del metodo con particolare riguardo alla rivelazione dell’1-OHPy;
ritenzione sono per la cotinina 3,15 minuti, per l’acido
trans,trans-muconico 5,59 minuti, per l’acido S-fenilmer- • la validazione analitica completa determinando i parametri di riproducibilità, accuratezza, eventuali effetti
capturico 8,23 minuti e per l’1-OHPy 12,40 minuti.
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matrice e calcolo dell’incertezza estesa;
• la valutazione del contributo alla determinazione
quantitativa dei biomarcatori considerati del fumo di
sigaretta, determinato mediante il monitoraggio biologico dell’esposizione a nicotina.
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