Piano di attività

TUTOR
Prof. Roberto De Giorgio
TITOLO DEL PROGETTO
TARGET MOLECOLARI NEL PAZIENTE PARKINSONIANO CON STIPSI CRONICA
SEVERA
DESCRIZIONE DEL PROGETTO
Stato dell’Arte e Razionale
Il sistema nervoso enterico (SNE), in grado di controllare autonomamente tutte le funzioni
intestinali (GI) (Furness, 2006), può essere affetto da varie condizioni patologiche, tra cui il morbo
di Parkinson (MP) (Fasano and Pfeiffer, 2015). Oltre alle alterazioni neurologiche e del movimento,
altre disfunzioni non motorie, inclusi disturbi GI, fanno parte del quadro clinico della MP (Aminoff,
2001). Le alterazioni GI, tra cui la stipsi cronica severa (SC), si manifestano negli stadi precoci
della malattia, precedendo anche di anni la comparsa dei disturbi neurologici centrali (Derkinderen
et al, 2011). La relazione tra MP e SNE ha portato a postulare l’“ipotesi di Braak, secondo cui il
SNE rappresenta “la porta di accesso” a noxae esterne e “il luogo di origine” di alterazioni
neuronali che poi diffondono al sistema nervoso centrale (Braak et al, 2008). Tutte le anomalie che
colpiscono l’integrità morfo-funzionale del SNE, la barriera epiteliale intestinale (BEI) e i
meccanismi modulatori dei processi infiammatori, possono contribuire alla genesi delle alterazioni
GI.
La BEI esercita un essenziale ruolo di protezione per l’ingresso di noxae esterne, oltre al controllo
della secrezione e dell’assorbimento dei fluidi. Per questo, il mantenimento della sua integrità e
l’omeostasi della permeabilità, sono imprescindibili per le funzioni GI. Le tight junction (TJ) sono
una delle principali unità coinvolte nella regolazione della BEI. Le TJ sono costituite
principalmente da proteine di membrana (occludina, claudine, JAM), proteine del complesso
giunzionale (ZO-1, ZO-2, ZO-3) e proteine del citoscheletro (Visser, 2009).
Le cellule gliali, parte integrante del SNE, contribuiscono al mantenimento della BEI, seppur con
meccanismi non definiti (Neunlist et al, 2014). In particolare, la glia enterica risente di stimoli, quali
l’infiammazione, e ne risulta “attivata”, con un aumento di espressione della glial fibrillary acid
protein (GFAP) (De Giorgio et al, 2012). Alterazioni della glia enterica si associano quindi a
risposte infiammatorie e a fenomeni degenerativi che possono modificare il fenotipo neuronale.
Tra le varie sottoclassi di neuroni enterici, i secretomotoneuroni, attraverso la produzione di VIP
(vasoactive intestinal peptide), esercitano a livello sottomucoso sia un’azione immunomodulatoria
che di regolazione della permeabilità della BEI (Chandrasekharan et al, 2013).
Complessivamente, queste evidenze indicano che BEI, cellule gliali e neuroni enterici sono
strettamente interconnessi esercitando un ruolo fondamentale nella fisiologia e fisiopatologia GI.
Tuttavia, le alterazioni della permeabilità intestinale e della glia enterica nei soggetti con SC e MP,
restano, ad oggi, aspetti non completamente chiariti; pertanto la loro definizione potrebbe portare a
importanti conoscenze sulla stipsi del paziente parkinsoniano.
Il presente progetto è volto a identificare target molecolari alla base dei processi fisiopatologici
coinvolti nella stipsi della MP. Per tale ragione verrà impiegata una strategia traslazionale diretta a
studiare sulla biopsia di mucosa colica (routinariamente ottenuta) dei pazienti stitici con MP, le
caratteristiche neurochimiche e neurofisiopatologiche da cui sviluppare nuovi approcci terapeutici.
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
Alterazioni dell’integrità morfo-funzionale del sistema nervoso enterico, della BEI e dei
meccanismi proinfiammatori possono contribuire alla genesi della SC nella MP. La definizione
della relazione tra BEI, glia e neuroni enterici potrebbe portare a sviluppare nuovi approcci
terapeutici per la SC nella MP.
Obiettivi
Il progetto si propone di caratterizzare la struttura della BEI e l’espressione delle cellule gliali in
biopsie di mucosa di colon di pazienti con MP e SC rispetto a pazienti con MP senza SC e controlli.
Nello specifico si vuole:
1. analizzare l'espressione delle proteine chiave delle TJ, ossia occludina (totale e complessata con
le claudine) e ZO-1. Questo approccio consente non solo di valutare l’integrità della BEI ma anche
di dare un significato fisiopatologico al danno riscontrato (i.e., mancata interazione con il
citoscheletro);
2. esaminare l'espressione della GFAP della glia enterica e del VIP, prodotto dai
secretomotoneuroni, per stabilire che tipo di relazione intercorre tra BEI, glia e modulatori della
neurosecrezione;
3. correlare i risultati biochimici e molecolari con i parametri neurologici e GI dei soggetti studiati.
Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…)
Nel presente studio verranno esaminati 3 gruppi di soggetti, di ambo i sessi e età compresa tra 50-75
anni, di cui: 1) pazienti affetti da MP e SC; 2) pazienti affetti solo da SC; 3) controlli asintomatici.
Lo studio prevede: 1) la preparazione di n= 4 biopsie mucose di colon; 2) l’analisi
immunoistochimica della distribuzione delle proteine GFAP, VIP, occludina, claudine e ZO-1; 3)
l’analisi dell’espressione genica e proteica di occludina, claudine, ZO-1 e GFAP; 4) l’analisi
statistica dei risultati sperimentali; 5) le correlazioni tra dati morfo-funzionali e parametri clinici
Risultati attesi
L'evidenza di alterazioni della BEI e dell’attivazione delle cellule gliali nei pazienti con SC e MP
potrebbe mettere in luce uno dei meccanismi responsabili delle alterazioni GI in questi pazienti.
Inoltre, l’approfondimento dei meccanismi molecolari alla base della stipsi, sia nei pazienti con SC
e MP che nei soggetti stitici non-parkinsoniani, potrebbe suggerire nuovi target terapeutici per il
trattamento di una condizione, la stipsi, che affligge una vasta popolazione di soggetti.
DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA
All’assegnista di ricerca sono richieste le seguenti competenze:
conoscenze d’istologia di base;
taglio di tessuti al criostato;
tecniche di immunoistochimica e immunofluorescenza;
analisi dei preparati al microscopio;
tecniche di analisi proteica (ossia western blot);
tecniche di analisi di espressione genica;
analisi statistica di base dei dati.
Il progetto si propone di caratterizzare la struttura della BEI e l’espressione delle cellule gliali in
biopsie di mucosa di colon di pazienti con SC e MP rispetto a pazienti con SC senza MP e controlli.
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
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VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
Nello specifico si vuole:
1. analizzare l'espressione delle proteine chiave delle TJs al fine di valutare l’integrità della BEI e
dare un significato fisiopatologico al danno riscontrato (i.e., mancata interazione con il
citoscheletro);
2. esaminare l'espressione della proteina GFAP della glia enterica e del VIP prodotto dai
secretomotoneuroni, per stabilire che tipo di relazione intercorre tra BEI, glia e modulatori della
neurosecrezione;
3. correlare i risultati biochimici e molecolari con i parametri neurologici e GI dei soggetti studiati.
Sia il proponente che i suoi Collaboratori hanno una competenza specifica sulle problematiche
relative alla stipsi nelle sue varie espressioni cliniche inclusa quella del paziente con MP. Il
personale del Laboratorio di Esplorazione Funzionale GI (Policlinico S. Orsola-Malpighi di
Bologna) possiede una ampia conoscenza delle problematiche inerenti il SNE incluse quelle legate
alla MP. Inoltre, tale laboratorio dispone di una consolidata esperienza tecnica e delle
strumentazioni richieste per lo svolgimento del presente progetto. Pertanto nei primi mesi
l’assegnista riceverà il supporto adeguato per la messa a punto degli esperimenti necessari per lo
svolgimento dell’attività di ricerca.
Il presente progetto è diviso nelle seguenti fasi:
1) 1-4 mesi: Reclutamento consecutivo dei soggetti coinvolti nello studio. Preparazione dei tessuti
per ottenere campioni tissutali adatti alle successive analisi sperimentali; messa a punto delle
tecniche di immunofluorescenza, western blot e real-time PCR quantitativa;
2) 4-6 mesi: esecuzione degli esperimenti di immunofluorescenza e acquisizione dei relativi dati;
3) 6-10 mesi: esecuzione degli esperimenti di espressione proteica e espressione genica;
4) 10-12 mesi: analisi statistica dei dati sperimentali e possibili correlazioni cliniche.
Il piano di attività sarà quindi incentrato sui seguenti esperimenti:
1) Preparazione dei tessuti per ottenere campioni tissutali adatti alle successive analisi sperimentali;
messa a punto delle tecniche di immunofluorescenza, western blot e real-time PCR quantitativa
(RT-qPCR);
2) Esecuzione degli esperimenti di immunofluorescenza sui campioni raccolti;
3) Esecuzione degli esperimenti di western blot e RT-qPCR;
4) Analisi statistica dei dati sperimentali e possibili correlazioni cliniche.
Scheda attività assistenziale (se prevista)
PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA
ATTIVITÀ
N. ORE SETTIMANA
N/A
N/A
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