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INTRODUZIONE FARMACI PEPTIDICI Più di 7000 peptidi presenti in natura sono stati identificati, e questi hanno spesso un ruolo cruciale nella fisiologia umana, tra cui azioni come ormoni, neurotrasmettitori, fattori di crescita……. Hanno come bersaglio specifici recettori della superficie cellulare, come i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) o canali ionici, che una volta stimolati scatenano effetti intracellulari. I peptidi di origine naturale spesso non sono direttamente utilizzabili in terapia perché hanno carenze intrinseche, come una certa instabilità chimico fisica e una limitata emivita plasmatica. Dato il loro promettente profilo farmacologico i peptidi rappresentano un ottimo punto di partenza per la progettazione di nuovi farmaci dotati di eccellente sicurezza e tollerabilità. FARMACI PEPTIDICI Nessun altro tipo di molecola biologica offre uno spettro più ampio di quello dei peptidi + proteine. Queste sostanze inoltre non sono tossiche per l’organismo. Per molto tempo i peptidi sono stati relegati al trattamento dei tumori ormono dipendenti (tipico esempio è la sandostatina), essendo inoltre molto costosi, con emivita molto breve e con nessuna possibilità di un trattamento orale. OCTREOTIDE Già negli anni ’80 l’introduzione di formulazioni a rilascio prolungato di peptidi come l’ormone della crescita e la somatostatina, incapsulati in polimeri biodegradabili che vengono somministrati in iniezioni mensili, ha permesso a queste sostanze di essere sfruttate maggiormente in clinica. Con le nuove tecnologie inoltre si stanno abbassando i costi di produzione con l’immissione sul mercato di farmaci sempre più mirati ed a costi contenuti, anche se sempre molto elevati. Il costo è correlato al numero di aminoacidi collegati fra loro da un legame peptidico per cui farmaci con 30 aminoacidi risultano molto costosi anche se, essendo molto potenti, ne bastano dosi minime. SMALL MOLECULE DRUG Lipinski's rule of five Per definizione, le small molecules sono molecole organiche di piccolo peso molecolare (inferiore a 800-1000 Dalton). Esse possiedono un’attività biologica determinata dal fatto di legarsi al sito attivo di una proteina responsabile della malattia, chiamato “target molecolare”. La regola di Lipinski si basa su quattro semplici fondamenti: • le molecole non devono avere una massa molecolare maggiore di 500 Dalton (PM < 500). Infatti se le molecole fossero troppo voluminose e pesanti sarebbero difficilmente assimilabili ed incontrerebbero troppa difficoltà nel processo di diffusione; • non ci devono essere più di 5 donatori di ponti idrogeno: troppi ponti idrogeno rendono la molecola eccessivamente polare, impedendone la diffusione nelle parti lipofile; • non ci devono essere più di 10 accettori di ponti idrogeno (di solito atomi di ossigeno, azoto); • la molecola deve avere un log P (il logaritmo del coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua) che deve essere minore di 5 (log P < 5). SMALL MOLECULE DRUG Lipinski's rule of five CICLOSPORINA Formula C62H111N11O12 Molar mass 1202.61 g/mol PEPTIDI TERAPEUTICI: definizione I 'peptidi terapeutici' sono definiti come corte catene di aminoacidi che hanno un potenziale nella gestione dei sintomi di una malattia, e in alcuni casi nella vera e propria cura della stessa. L'industria definisce peptidi come molecole più breve di 100 aminoacidi; mentre le catene aminoacidiche più lunghi possono essere anticorpi monoclonali e proteine. Secondo la Peptide Therapeutics Foundation è considerate peptide una catena di meno di 50 residui amminoacidici (PM < 10 kDa). PEPTIDI/PROTEINE TERAPEUTICHE FARMACO PEPTIDICO FARMACO BIOTECNOLOGICO FARMACO TRADIZIONALE SMALL MOLECULE FARMACO BIOTECNOLOGICO PM = 180 FARMACI PEPTIDICI: Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules S Strengths •Good efficacy, safety, and tolerability •High selectivity and potency •Predictable metabolism •Shorter time to market •Lower attrition rates •Standard synthetic protocols W Weaknesses •Chemically and physically instable •Prone to hydrolysis and oxidation •Tendency for aggregation •Short half-life and fast elimination •Usually not orally available •Low membrane permeability O Opportunities T Threats •Immunogenicity •Price and reimbursement environment •Discovery of new peptides, •Focused libraries •Optimized designed sequences •Formulation development •Alternative delivery routes besides parental •Multifunctional peptides FARMACI PEPTIDICI e BIOTECNOLOGICI: Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules FARMACI PEPTIDICI: Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules FARMACI PEPTIDICI: Il mercato Attualmente, ci sono più di 60 farmaci peptidici approvati dalla US Food and Drug Administration (FDA) sul mercato e questo dato è destinato a crescere in modo significativo, con circa 140 farmaci peptidici attualmente in sperimentazione clinica e più di 500 peptidi terapeutici in fase preclinica. Negli ultimi dieci anni, i peptidi hanno conquistato una vasta gamma di applicazioni nel campo della medicina e delle biotecnologie, e il settore sta sperimentando una rinascita anche per ragioni commerciali. LupronTM (Abbott Laboratories, cancro della prostata, un fatturato globale di oltre 2.3 miliardi US $ nel 2011) LantusTM (Sanofi, diabete, un fatturato di 7,9 miliardi US $ nel 2013). LA LUNGA STRADA VERSO UN NUOVO FARMACO 10-18 anni Numbers of New Small Molecule Drug Approvals per Year Compared to New Biologic Drug Approvals 1998-2008. FARMACI PEPTIDICI: Il mercato FARMACI PEPTIDICI: Il mercato FARMACI PEPTIDICI APPROVATI NEL BIENNIO 2012-2014 (USA O EU) FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI Un gran numero di peptidi attivi sono stati isolati e caratterizzati da un'ampia varietà di fonti biologiche. I peptidi coinvolti nella difesa dell’ospite e nella cattura delle prede sono tra i migliori candidati farmaci a causa del loro meccanismo ad azione rapida. FONTI BIOLOGICHE • BATTERI • PIANTE • ANIMALI BATTERI COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI I batteri sono una ricca fonte di peptidi con potenziali applicazioni farmaceutiche. La nisina, approvato dalla FDA, e con attività contro gli agenti patogeni di origine alimentare. La nisina ha anche applicazioni promettenti nel trattamento delle infezioni da Helicobacter (ulcere) e recentemente è stato studiata come anti-cancro. La nisina è entrata in studi preclinici come antibiotico. NISINA E’ un polipeptide policiclico costituita da 34 amminoacidi. È una batteriocina prodotta da Lactococcus lactis. BATTERI COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI PEPTIDI ANTIMICROBICI DA FONTI NATURALI Gli anfibi secernono peptidi con proprietà antimicrobiche dalla loro pelle come parte del loro sistema di difesa. MAGAININ II Le magainine sono di particolare interesse in quanto hanno una potente attività antimicrobica, ad ampio spettro con attività emolitica. Pexiganan, un analogo di 22 è entrato in studi clinici di fase III per il trattamento topico delle ulcere diabetiche. L'interesse per le magainine è rivolto alla ricerca di nuovi antimicrobici, antitumorali e attività antivirali . PEPTIDI ANTIMICROBICI DA FONTI NATURALI Bombina variegata Rana Temporaria PIANTE COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI Le piante producono peptidi per difendersi contro i predatori erbivori. Piante contenenti ciclotidi sono utilizzate per scopi medicinali nella regione del Congo. I ciclotidi presentano una ciclizzazione testa-coda che li rende particolarmente stabile e quindi adatti nel drug design. I ciclotidi hanno varie attività biologiche di rilevanza farmacologica, compresa la tossicità contro le cellule tumorali e le proprietà anti-HIV. Uno studio recente ha evidenziato il potenziale di queste molecole nel rallentare il decorso della sclerosi multipla. Nel complesso, ciclotidi sono peptidi affascinanti che hanno la costituzione chimica delle proteine, ma le proprietà di stabilità di prodotti chimici organici. Oldenlandia affinis CICLOTIDI FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI Gli organismi velenosi (rettili, pesci, anfibi, mammiferi, molluschi, aracnidi e insetti) producono sostanze per catturare le prede o come un meccanismo di difesa. I veleni sono tipicamente prodotti come i cocktail mortali, composto da miscele di peptidi adattati per selezione naturale. Queste tossine compromettono i sistemi cardiovascolari e neuromuscolari alterando l'attività di enzimi, recettori e canali ionici. FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI I gasteropodi marini della specie Conus magus sono nativi dell’Oceano Indiano e dell’Oceano Pacifico, dove si nutrono di piccoli pesci. Le loro prede sono spesso molto più veloci di loro, e per questo i molluschi usano potenti neurotossine nel loro veleno, per immobilizzare le prede. Il loro veleno si trova in una ghiandola all’interno di un “dente”, che viene sparato contro una preda o un nemico come un arpione. Questi piccoli animali producono centinaia di diverse conotossine, ciascuna delle quali ha specifici target molecolari: una caratteristica che rende questi molluschi una delle più interessanti fonti di possibili nuovi farmaci. Una singola conotossina si lega soltanto a un tipo specifico di canale ionico nelle cellule nervose. Per questo le conotossine rappresentano uno strumento molto preciso ed efficace per la ricerca scientifica. FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI Ziconotide (nome commerciale di Prialt®), è stato approvato dalla FDA nel 2004 ed è usato come trattamento per il dolore cronico. Altre conotossine sono attualmente in corso di valutazione in studi clinici e preclinici. FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI Melittina isolata dal veleno d’api in grado di interferire con il processo di replicazione del virus HIV PEPTIDI BIOATTIVI DI INTERESSE TERAPEUTICO WO2004011485: STABILIZED BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS OF IDENTIFICATION, SYNTHESIS, AND USE PEPTIDI BIOATTIVI DI INTERESSE TERAPEUTICO WO2004011485: STABILIZED BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS OF IDENTIFICATION, SYNTHESIS, AND USE AMMINOACIDI PROTEINOGENICI STRUTTURA DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI • Ogni amminoacido possiede un carbonio centrale, chiamato carbonio α, al quale sono legati quattro differenti gruppi: • un gruppo amminico basico (-NH2) • un gruppo carbossilico acido (-COOH) • un atomo di idrogeno (-H) • una catena laterale, diversa per ciascun amminoacido (-R) CLASSIFICAZIONE AMMINOACIDI Gli amminoacidi possono essere classificati in base alle proprietà chimico-fisiche delle loro catene laterali che si differenziano considerevolmente per 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Dimensioni Polarità Acidità-basicità Aromaticità Flessibilità conformazionale Reattività chimica Tendenza a formare legami idrogeno. AMMINOACIDI CON GRUPPI -R ALIFATICI (NON POLARI) • Le loro catene laterali sono costituite da una catena idrocarburica satura: sono idrofobici. • La metionina è uno dei due amminoacidi contenenti zolfo. • La prolina ha una caratteristica struttura ad anello, formato dalla catena laterale e dal suo gruppo amminico. GLICINA ALANINA VALINA LEUCINA PROLINA METIONINA ISOLEUCINA AMMINOACIDI CON GRUPPI -R AROMATICI (RELATIVAMENTE NON POLARI) TRIPTOFANO FENILALANINA TIROSINA • Le loro catene laterali sono aromatiche • Sono relativamente non polari (idrofobici) • Possono partecipare tutti ad interazioni idrofobiche • I gruppi -OH della tirosina ed NH del triptofano possono formare legami a idrogeno AMMINOACIDI CON GRUPPI -R POLARI, NON CARICHI SERINA TREONINA CISTEINA ASPARAGINA GLUTAMMINA • Sono polari ma in condizioni fisiologiche sono privi di carica elettrica. • I loro gruppi -R sono più idrofilici di quelli degli AA non polari: contengono gruppi funzionali che formano legami idrogeno con l’acqua. • La polarità di serina e treonina è dovuta al gruppo ossidrilico (-OH), quella della cisteina al gruppo sulfidrilico (-SH), quella di asparagina e glutammina ai gruppi ammidici (-CONH2). LA CISTEINA PUÒ FORMARE PONTI DISOLFURO LA CISTEINA PUÒ FORMARE PONTI DISOLFURO AMMINOACIDI CON GRUPPI -R CARICHI POSITIVAMENTE (BASICI) ISTIDINA LISINA ARGININA • Sono accettori di protoni. • Le loro catene laterali, contenenti gruppi amminici, a pH fisiologico sono ionizzate ed hanno carica positiva AMMINOACIDI CON GRUPPI -R CARICHI NEGATIVAMENTE (ACIDI) ACIDO ASPARTICO ACIDO GLUTAMMICO • Sono donatori di protoni. • I gruppi carbossilici delle loro catene laterali, al pH fisiologico, sono ionizzati ed hanno carica negativa. PROTEINE ACIDE E BASICHE Le proteine nelle quali il rapporto: (lys + arg ) / (asp + glu ) >1 sono basiche. Quando tale rapporto (lys + arg ) / (asp + glu ) <1 sono acide. NOMENCLATURA AMMINOACIDI ACRONIMO INIZIALE CODONE NOME ACRONIMO INIZIALE CODONE NOME Ala A GCU, GCC, GCA, GCG alanina Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG leucina Arg R arginina Asn Asp Cys N D C CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG AAU, AAC Lys K AAA, AAG lisina asparagina Met Phe Pro M F P AUG metionina GAU, GAC aspartico UUU, UUC fenilalanina UGU, UGC cisteina CCU, CCC, CCA, CCG prolina Gln Q CAA, CAG glutammina Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC serina Glu E GAA, GAG glutammico Thr T ACU, ACC, ACA, ACG treoninba Gly G GGU, GGC, GGA, GGG glicina Trp W UGG triptofano His H CAU, CAC istidina Tyr Y UAU, UAC tirosina Ile I AUU, AUC, AUA isoleucina Val V GUU, GUC, GUA, GUG valina CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI • Sono tutti chirali (eccetto la glicina) • Presentano tutti stereochimica L (il C chirale ha la stessa configurazione del C chirale della L-gliceraldeide) • Il C chirale ha una configurazione assoluta S (ad eccezione della cisteina, che è R) CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI: LA CISTEINA Nel caso della cisteina il gruppo R (-CH2SH) ha priorità rispetto al carbossile e questo residuo pur appartenendo alla serie sterica L, ha stereochimica assoluta R. CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI: LA TREONINA CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI: LA ISOLEUCINA L’INTERAZIONE FARMACO RECETTORE PUO’ ESSERE STEREOSPECIFICA LEGAMI PEPTIDICI IL DIPEPTIDE È IL PIÙ SEMPLICE PEPTIDE FORMATO DALL’UNIONE DI DUE AMMINOACIDI I peptidi si indicano scrivendo i simboli dei due residui amminoacidici che li costituiscono PEPTIDI CONVENZIONI Per convenzione, i peptidi sono rappresentati ponendo a sx l'amminoacido con il gruppo amminico libero (a.a. N-terminale) e all'estremità di dx quello con il gruppo carbossilico libero (a.a. C-terminale) CONFORMAZIONE BIOATTIVA NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO Il legame peptidico si comporta per il 40% come un doppio legame, esso è perciò rigido e non può ruotare liberamente, limitando notevolmente i vari tipi di conformazioni proteiche possibili. I quattro atomi del legame peptidico giacciono nello stesso piano così come i Cα dei due amminoacidi che lo formano NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO La geometria del legame peptidico nella sua forma di risonanza planare è sempre trans ad eccezione dei legami instaurati dalla Pro. NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO Lo scheletro di una catena polipeptidica può essere rappresentato come una serie di piani rigidi ANGOLI DI TORSIONE NEI PEPTIDI Ogni piano delle unità peptidiche ha due rotazioni possibili Il legame Cα-C di un aminoacido definisce un angolo di rotazione detto Y "psi“. Il legame N-Cα di un amminoacido definisce un angolo di rotazione F "phi". ANGOLI DI TORSIONE NEI PEPTIDI Non tutte le combinazioni degli angoli diedri Ψ (psi) e Φ (phi) dei residui amminoacidici sono ammesse all'interno di una struttura polipeptidica. Questo impone un limite alle conformazioni assumibili. Ramachandran plot shows which & Y angles are allowed for proteins ALA GLY PRO Il legame peptidico è un legame rigido, d’altro canto i due legami contigui ad esso (il Cα-C e il NH-Cα) possono compiere rotazioni, formando due angoli, rispettivamente Ψ (Psi) e φ (phi); questi due angoli teoricamente possono variare da -180◦ a + 180◦ , anche se in pratica alcuni di questi valori sono proibiti per delle interferenze che si possono venire a creare tra le catene laterali degli aminoacidi. Questi elementi di rigidità contribuiscono a limitare lo spazio conformazionale accessibile alla catena peptidica Il grafico di Ramachandran dimostra che solo certe conformazioni spaziali a bassa energia sono disponibili per la maggior parte degli α-aminoacidi (eccetto la glicina) STRUTTURA SECONDARIA Gli studi di Ramachandran evidenziano che le conformazioni accessibili a bassa energia sono, le α eliche e i β sheets che definiscono la struttura secondaria delle proteine STRUTTURA TERZIARIA Oltre alle proprietà specifiche dei legami intra-aminoacidici, vi sono un insieme di forze deboli (non covalenti) che guidano il processo di ripiegamento della proteina nella sua conformazione nativa; questi legami sono: legami H, legami ionici, attrazioni di Van der Waals. La stabilità complessiva della struttura dipende dalla somma delle suddette forze agenti. FOLDING PROTEICO E’ il processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale. A dispetto della loro complessità, le proteine presentano un ben preciso STATO NATIVO che assumono mediante un rapido processo di ripiegamento (1µs – 1s). Questo rappresenta la conformazione più stabile cui compete la più bassa energia libera. CONFORMAZIONE BIOATTIVA La struttura tridimensionale delle proteine, più della loro sequenza, definisce la loro funzione biologica. La struttura tridimensionale dei farmaci peptidici/proteici, più della sequenza, definisce la loro funzione terapeutica. La CONFORMAZIONE BIOATTIVA è quella che il farmaco peptidico/proteico deve assumere per essere riconosciuto dal proprio target farmacologico ed è quindi quella che promuove una risposta terapeutica CONFORMAZIONE BIOATTIVA Conoscere la struttura 3D della conformazione bioattiva aiuta a capire come un peptide interagisce con il proprio target e fornisce indicazioni utili alla progettazione di nuovi farmaci peptidici con potenziale biotecnologico o utilizzo farmaceutico. Non è facile determinare la struttura 3D di un peptide a partire dalla sola sequenza amminoacidica. METODI DI DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE La struttura di una proteina può essere determinata sperimentalmente mediante: SPETTROSCOPIA DI RISONANZA MAGNETICA (NMR) Permette di esaminare una proteina in soluzione e di generare anche un quadro della sua dinamica ma è applicabile solo a proteine che non superano i 250-300 residui. DIFFRAZIONE AI RAGGI X (RX). Offre dati molto precisi ma le strutture costrette in cristalli non sempre rappresentano immagini fedeli di proteine nella loro conformazione attiva. METODI DI PREDIZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE In alternativa ai metodi sperimentali, si sono sviluppati dei METODI COMPUTAZIONALI aventi lo scopo di predire la struttura tridimensionale di una proteina, data la sua sequenza primaria e di comprendere come le proteine si ripiegano nelle strutture native. Attualmente ci sono vari metodi di predizione di struttura secondaria delle proteine e di struttura terziaria: 1) MODELLAMENTO PER OMOLOGIA 2) METODI AB-INITIO MODELLAMENTO PER OMOLOGIA Proteine con sequenza aminoacidica simile (struttura primaria) hanno anche una disposizione spaziale degli atomi simile (sequenza secondaria e terziaria). E’ il metodo computazionale più affidabile per ottenere una predizione della struttura tridimensionale di una proteina ed è applicabile quando la percentuale di identità di sequenza tra la proteina da modellare e quella di riferimento è compresa tra il 20-40%. Occorre considerare che sono conosciute molte proteine che, pur avendo un valore di omologia di sequenza molto basso, hanno strutture tridimensionali molto simili. METODI AB-INITIO Gli approcci ab-initio utilizzano le sole informazioni fornite dalla natura degli aminoacidi costituenti la proteina da ripiegare Si basano sulla valutazione teorica di tutti i contributi energetici coinvolti nel calcolo dell’energia conformazionale: FATTORI INTRAMOLECOLARI (legami chimici, interazioni di van der Waals, legami idrogeno, interazioni coulombiane, entropia conformazionale) INTERAZIONE CON IL SOLVENTE (polarizzazione del mezzo, formazione di cavità, interazioni soluto-solvente, variazioni di struttura del solvente) Gli strumenti computazionali e bioinformatici sono di grande aiuto, anche se essi devono essere considerati naturalmente complementari e non alternativi alle normali tecniche sperimentali L’approccio computazionale combinato a quello sperimentale ha contribuito a progettare nuovi peptidi potenzialmente utili per il trattamento di CANCRO HIV ALZHEIMER IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PROTEICO? “lo stato nativo di una proteina è codificato nella sua sequenza primaria”. Proteina allo stato nativo Denaturazione pH Temperatura Forza ionica Proteina denaturata Rinaturazione Proteina allo stato nativo IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PEPTIDICO? Generalmente peptidi di piccole/medie dimensioni (< 30 aa) sono molto flessibili e non strutturati. Questi esistono in una varietà di conformazioni in equilibrio dinamico tra loro. IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PEPTIDICO? IRRIGIDIMENTO GLOBALE IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO Incorporazione di amminoacidi non naturali conformazionalmente vincolanti AMMINOACIDI METILATI AMMINOACIDI CICLICI SINTESI PEPTIDICA PRODUZIONE DI PEPTIDI/PROTEINE La dimensione delle molecole da sintetizzare determina la miglior tecnologia per la relativa produzione. PRODUZIONE DI PEPTIDI TERAPEUTICI 1. VIA SINTETICA 2. ESTRAZIONE DA FONTI NATURALI 3. VIA BIOTECNOLOGICA (DNA RICOMBINANTE) PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUICHE 1. ESTRAZIONE DA FONTI NATURALI 2. VIA BIOTECNOLOGICA (DNA RICOMBINANTE) SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI TERAPEUTICI VANTAGGI 1. La sintesi chimica è più veloce e più economica rispetto alle tecniche biotecnologiche di clonaggio e overespressione di geni in Escherichia coli. 2. Il peptide che si ottiene è ben determinato dal punto di vista strutturale. 3. Consente l’incorporazione di amminoacidi artificiali. SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI TERAPEUTICI I peptidi possono essere sintetizzati legando tra loro, nella giusta sequenza, gli amminoacidi di cui sono composti. La sintesi di peptidi può essere un'operazione complessa anche se consiste nel realizzare sempre un solo tipo di legame, quello ammidico, tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e quello amminico del successivo. Gli amminoacidi infatti sono molecole bifunzionali, e quindi non è sufficiente realizzare il legame ammidico desiderato, ma è necessario che non si formi nessuno degli altri legami possibili. La sintesi risulta poi ancora più difficile per la presenza di gruppi funzionali nelle catene laterali degli amminoacidi e per la necessità di conservare l'attività ottica dei carboni chirali in posizione α. SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI TERAPEUTICI La sintesi di un dipeptide, ad es. alanina-valina, Ala-Val, permette di comprendere il problema della formazione del legame peptidico. Se si cercasse di ottenere questo dipeptide per semplice riscaldamento di una miscela dei due amminoacidi, alanina e glicina, si otterrebbe una miscela complessa di dipeptidi, tripeptidi e oligopeptidi con sequenze casuali. H N H2N CO2H - H2O + - H2O H2N CO2H H2N O Val - Ala (V - A) Ala Val CO2H H N H2N O Ala - Val (A - V) CO2H GRUPPI PROTETTORI NELLA SINTESI DI PEPTIDI Per sintetizzare correttamente il dipeptide Ala-Val è necessario che siano liberi di reagire solo due gruppi funzionali: il gruppo carbossilico dell'alanina e quello amminico della valina. Gli altri due gruppi funzionali non devono reagire durante la formazione del legame ammidico e per questo devono essere legati a molecole chiamate gruppi protettori. Val-Pc Pn-Ala Pn-Ala-Val-Pc Ala-Val GRUPPI PROTETTORI NELLA SINTESI DI PEPTIDI Pn + OH N H peptide coupling Pn OPc H2N N H Ala - Val (A - V) Val Ala H N H2N peptide coupling (-H2O) O OPc Ala - Val (A - V) Pn Ph O Pn OPc selectively remove Pn O - H2O O O O H N N H H N Ph O N H H N O OPc Repeat peptide synthesis O OH O Phe (F) Phe - Ala - Val (F - A - V) USO DI GRUPPI PROTETTORI ORTOGONALI: il gruppo protettore del carbossilato deve essere stabile alle condizioni di reazione in cui si rimuove il gruppo protettore del gruppo amminico e viceversa SINTESI DEL PEPTIDE H-Leu-Phe-Ala-Gly-OH GRUPPI PROTETTORI NELLA SINTESI DI PEPTIDI CARATTERISTICHE GENERALI DI UN BUON GRUPPO PROTETTORE 1. Deve essere facilmente introdotto sul gruppo funzionale di interesse; 2. Deve essere stabile ad un ampio range di condizioni di reazione; 3. Deve essere rimosso facilmente alla fine del processo sintetico o quando il gruppo funzionale richiede manipolazione in condizioni che non degradino i legami peptidici neoformati; 4. La sua rimozione dovrebbe portare a sottoprodotti facilmente rimovibili; NELLA SINTESI PEPTIDICA I GRUPPI PROTETTORI SI SUDDIVIDONO IN: Gruppi protettori della FUNZIONE AMMINICA Gruppi protettori della FUNZIONE CARBOSSILICA Gruppi protettori delle FUNZIONI IN CATENA LATERALE GRUPPI PROTETTORI DELLA FUNZIONE AMMINICA Poiché la maggior parte delle sintesi peptidiche sono condotte nella direzione C → N, i gruppi protettivi del gruppo α-amino vengono rimossi diverse volte durante la sintesi, e quindi, la rimozione deve essere fatta in condizioni blande in modo da non intaccare i restanti gruppi protettivi. GRUPPI PROTETTORI DELLA FUNZIONE AMMINICA Boc Uno dei più usati protettori del gruppo amminico in α è il tert-Butil-ossi-carbonile, Boc. E' un protettore di tipo uretanico che inibisce la reattività del gruppo amminico trasformandolo in una ammide. La Boc-alanina ha la seguente struttura: IL GRUPPO PROTETTORE BOC è ACIDO LABILE Introduzione del gruppo Boc Boc2O Rimozione del gruppo Boc Il Boc è labile in ambiente acido e viene staccato con acido trifluoroacetico, TFA. La sua labilità agli acidi dipende dal fatto che sono presenti due ottimi gruppi uscenti: la CO2, che si sottrae all'equilibrio come gas, e il catione tert-butilico. A A B GRUPPI PROTETTORI DELLA FUNZIONE AMMINICA metile ossi Fmoc carbonile Fmoc-Gly fluorenil Il gruppo protettore Fmoc viene rimosso per trattamento con una soluzione al 20% di piperidina in DMF (ha una emivita calcolata di 6 secondi in questa soluzione) Introduzione del gruppo Fmoc Rimozione del gruppo Fmoc Dibenzofulvene GRUPPI PROTETTORI DELLA FUNZIONE AMMINICA ossi Z o Cbz benzil carbonile La rimozione avviene per idrogenolisi (che rimuove il gruppo benzilossi) e successiva decomposizione spontanea del carbammato a CO2 + R-NH2. Introduzione del gruppo Z Rimozione del gruppo Z GRUPPI PROTETTORI DELLA FUNZIONE CARBOSSILICA Uno dei più usati protettori del gruppo carbossilico terminale è il gruppo benzilico, Bzl. Questo inibisce la reattività del carbossile trasformandolo in un estere benzilico. La glicina protetta come Gly-OBzl ha la seguente struttura L'estere benzilico è stabile nelle condizioni di sblocco del Boc con TFA / DCM (1:1), ma viene scisso in HF liquido anidro a 0 °C, ambiente in cui il legame ammidico è stabile, o tramite idrogenolisi. GRUPPI PROTETTORI DELLA CATENE LATERALI Commonly applied amino acid side chain protecting groups. Trt: trityl, Pbf: pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl. RIMOZIONE FINALE DI TUTTE LE PROTEZIONI AMMINOACIDO PROTETTO ORTOGONALMENTE The benzyl ester can be removed by hydrogenolysis, the fluorenylmethylenoxy group (Fmoc) by bases (such as piperidine), and the phenolic tert-butyl ether cleaved with acids (e.g. with trifluoroacetic acid). FORMAZIONE DEL LEGAME AMMIDICO E’ INDISPENSABILE ATTIVARE IL GRUPPO CARBOSSILICO AFFINCHÈ SI FORMI IL LEGAME PEPTIDICO STRATEGIE PER LA FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO • • • • Carbodiimmidi Esteri attivi Sali di fosfonio Sali di amminio/uronio ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON CARBODIIMMIDI DCC N,N'-dicicloesil carbodiimide WSC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON CARBODIIMMIDI ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON CARBODIIMMIDI ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON CARBODIIMMIDI e HOBt HOBt N-idrossi benzotriazolo Usato come additivo nelle condensazioni mediate da carbodiimmidi determina un aumento dell’efficienza della sintesi peptidica ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON CARBODIIMMIDI e HOBt ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON SALI DI FOSFONIO I sali di fosfonio sono reagenti di accoppiamento potenti e permettono la generazione in situ di esteri attivi. BOP ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON SALI DI FOSFONIO Mechanism of BOP-mediated coupling reagent. ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON SALI DI URONIO HBTU HATU ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO CON SALI DI URONIO Mechanism of HATU-mediated coupling reagent. FASI DELLA SINTESI PEPTIDICA 1. PROTEZIONE DEGLI AMMINOACIDI 2. ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO 3. FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO 4. RIMOZIONE DEI GRUPPI PROTETTORI SINTESI DIVERGENTE E SINTESI CONVERGENTE Nella SINTESI DIVERGENTE di procede step by step aggiungendo un amminoacido per volta. Essa porta all’allungamento graduale della catena che consiste nell'incorporare nel peptide un amminoacido alla volta a partire dal terminale carbossilico. La SINTESI CONVERGENTE è anche detta sintesi a blocchi e prevede la sintesi indipendente di frammenti del peptide target che vengono condensati solo in un’ultima fase SINTESI DI PEPTIDI IN FASE SOLIDA Robert Bruce Merrifield (July 15, 1921 – May 14, 2006) was an American biochemist who won the Nobel Prize in Chemistry in 1984 for the invention of solid phase peptide synthesis. Rockefeller University Representation of protein and peptide synthesis by biochemical and chemical methods. Durante la biosintesi le proteine non si trovano in soluzione, ma sono ancorate ad una molecola di RNA transfer il quale, a sua volta, è legato al complesso ribosoma-RNA messaggero. Questo costituisce una sorta di supporto solido dal quale le proteine si staccano solo quando sono state completate . VR Pattabiraman & JW Bode Nature 480, 471-479 (2011) doi:10.1038/nature10702 + polymerization RESINA DI MERRIFIELD/ Boc-CHEMISTRY Ph ator Ph nitiator erization Ph divinylbenzene (crosslinker, H ~13COCH %) 2Cl Ph Ph H3COCH2Cl Ph Ph Ph ZnCl Ph Ph 2 Ph Ph lymerization Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph H3COCH2Cl ZnCl2 CHPh 2Cl Ph O BOC R Ph Ph CF3CO2H O O O R H N Ph Ph Ph O Ph CH2Cl _ Ph Ph ZnCl2 Ph O NH BOC NH2 R CF3CO2H O O O R NH BOC O NH2 R O l’uso di Boc amminoacidi e la rimozione finale del peptide con HF Prevedeva in origine La rimozione O ripetitiva via TFA può portare ad alterare alcuni peptidi sensibili 114 Fmoc-CHEMISTRY Questo tipo di sintesi prevede la crescita di catene peptidiche ancorate ad un supporto polimerico insolubile in presenza di un linker adeguato che permette l'attacco e il distacco del peptide e di una strategia di protezione/deprotezione di tipo ortogonale per i singoli monomeri. In questo modo i reagenti in eccesso e i sottoprodotti della sintesi possono essere rimossi per semplice filtrazione e lavaggio del polimero al quale è legato il peptide. REQUISITI DI UN SUPPORTO SOLIDO 1. Deve contenere delle funzioni reattive 2. Deve essere stabile nelle condizioni di sintesi 3. Deve permettere un rapido e libero contatto tra i reagenti 4. Deve essere facilmente separabile dalla fase liquida VANTAGGI DELLA SINTESI PEPTIDICA IN FASE SOLIDA 1. Processi di purificazione più semplici. È sufficiente per ogni stadio di reazione una semplice filtrazione. 2. Tempi di reazione più brevi. Gli amminoacidi vengono introdotti al ritmo di uno ogni ora. 3. Minori problemi legati alla solubilità (quando il numero di amminoacidi è maggiore di 3-4 il peptide può essere poco solubile nei normali solventi organici) 4. Inoltre, data la semplicità delle operazioni richieste, l'intero processo può essere automatizzato. Un sintetizzatore automatico di peptidi in fase solida può introdurre fino a dodici amminoacidi al giorno. SINTESI MANUALE SINTETIZZATORE AUTOMATICO INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO I farmaci biosimilari presentano diversi elementi di criticità legati alla loro • INSTABILITÀ CHIMICA • INSTABILITÀ FISICA • FOTOSENSIBILITÀ INSTABILITÀ CHIMICA DI PEPTIDI E PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO Una serie di reazioni possono essere responsabili dell’instabilità delle proteine 1. 2. 3. 4. 5. 6. IDROLISI DEAMIDAZIONE RACEMIZZAZIONE FORMAZIONE DI PIROGLUTAMMATO IN POSIZIONE N-TERMINALE FORMAZIONE E SCAMBIO DI PONTI DISOLFURO OSSIDAZIONE • NELLE FASI DI SINTESI • IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE • NELLE FORMULAZIONI IDROLISI Per svolgere la loro funzione negli organismi viventi le proteine devono essere relativamente stabili in soluzione. Si è constatato che, in generale, la reazione a pH neutro è estremamente lenta, con cinetiche di centinaia di anni. Negli organismi viventi l'idrolisi è catalizzata da enzimi idrolitici come la tripsina e la chimotripsina, entrambi specifici per alcune sequenze amminoacidiche. Gli anticorpi monoclonali sono soggetti a frammentazione non enzimatica nella regioni cerniera. La frammentazione si osserva nelle regioni flessibili ed esposte al solvente di una proteina. Ad esempio regioni ricche di Gly (in particolare la sequenza Gly-Gly) sono soggette frequentemente a scissione. Inoltre, buona parte delle frammentazioni in anticorpi monoclonali si verifica in prossimità di alcuni residui amminoacidici: Asp, Gly, Ser, Thr, Cys or Asn. Le catene laterali di questi residui possono facilitare la scissione del legame peptidico tramite meccanismi specifici. FRAMMENTAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI Asp Ser DEAMIDAZIONE A B B A La velocità di deamidazione è superiore per residui di asparagina recanti al Cterminale un residuo amminoacidico poco ingombrato come la glicina RACEMIZZAZIONE La racemizzazione è stata sempre un grave problema di stabilità di peptidi (sia in fase sintetica che in condizioni fisiologiche) e ne ha limitato a lungo lo sviluppo. Se l'amminoacido racemizzato si trova in un punto critico della proteina o se vengono racemizzati più amminoacidi, allora la struttura tridimensionale della proteina modificata può essere così diversa da quella nativa da comportare una totale perdita di attività biologica. Esistono vari meccanismi di racemizzazione/epimerizzazione di un farmaco peptidico. RACEMIZZAZIONE PER ENOLIZZAZIONE DIRETTA In soluzione acquosa neutra a 20 °C la racemizzazione praticamente non avviene. Questo meccanismo diventa significativo solo se un peptide è sottoposto a condizioni molto basiche e/o ad alte temperature. L'idrolisi basica di una proteina, con NaOH 1M a 100 °C per 1 ora, produce amminoacidi completamente racemizzati. RACEMIZZAZIONE VIA ASPARTIMMIDE 5 1 L-ASPARTIMMIDE D-ASPARTIMMIDE 2 4 3 7 6 I residui di acido aspartico (Asp) in peptidi e proteine sono inclini a racemizzazione non enzimatica. E’ un processo inevitabile, spontaneo e svolge un ruolo importante nella biologia molecolare dell'invecchiamento. La racemizzazione di Asp ha anche rilevanza per molte malattie legate all'età come il morbo di Alzheimer. Health, 5, 2013, 2018-2021 FORMAZIONE DI PIROGLUTAMMATO IN POSIZIONE N-TERMINALE La formazione avviene attraverso il riarrangiamento del glutammato o della glutammina in posizione N terminale. Procede spontaneamente o tramite l’enzima glutaminil ciclasi che si trova in molte piante e animali, compresi gli esseri umani. La reazione sia spontanea che catalizzata da enzimi sembra essere molto più veloce con glutammina che con residui di glutammato. The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286, 11211-11217. RIARRANGIAMENTO DI PONTI DISOLFURO Le disolfuro isomerasi (o PDI) sono una classe di enzimi che catalizzano reazioni di scambio tra gruppi -S-H e gruppi S-S-, la formazione o la rottura di ponti di solfuro OSSIDAZIONE Cys OSSIDAZIONE Met OSSIDAZIONE Trp OSSIDAZIONE His FOTO-INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 96, NO. 6, JUNE 2007 INSTABILITÀ FISICA DI PEPTIDI E PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO Include fenomeni che comportano modifiche non covalenti come DENATURAZIONE ASSORBIMENTO DI SUPERFICIE AGGREGAZIONE PRECIPITAZIONE Superficie idrofobica aggregati insolubili monomeri cristalli Qualunque evento che porta a denaturazione e aggregazione può inattivare la proteina terapeutica anche se viene conservata la struttura primaria. CONSERVAZIONE DI PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI La formulazione e lo stoccaggio dei farmaci proteici differisce da quella di farmaci non proteici. Occorre considerare che sono generalmente farmaci molto costosi e vanno correttamente conservati. Le scorte di magazzino richiedono una rotazione elevata per la difficoltà di conservazione. Le proteine hanno in genere un ridotto tempo di stabilità e la media di conservazione in farmacia per un prodotto biotecnologico è di 12-18 mesi (stabilità media di farmaci non proteici è superiore ai 36 mesi). Alcuni farmaci fotosensibili vanno protetti dalla luce. Vengono conservati in frigorifero ad una temperatura di 2-8 °C e non surgelati. Se il paziente deve percorrere un tragitto dopo la consegna del farmaco in farmacia, il farmacista dovrebbe fornire una confeziona adatta alla conservazione secondo indicazioni della ditta produttrice (contenitori con ghiaccio e non ghiaccio secco). CONSERVAZIONE DI PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI Attenzione al rispetto della catena del freddo RACCOMANDAZIONI PER PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI Al ricevimento del farmaco il personale sanitario addetto deve verificare sistematicamente la temperatura del contenitore. Deve essere effettuata costantemente una valutazione visiva del farmaco per escludere la presenza di particolato e segni di variazione di colore. Le ditte producono questi farmaci in soluzioni sterili preferibilmente monodose o come liofilizzati. Devono essere prodotti in condizioni sterili perché instabili ai comuni processi di sterilizzazione che prevedono l’impiego di radiazioni ionizzanti e calore. I farmaci biologici per via infusionale attualmente disponibili in Italia, prima di poter essere somministrati, devono essere ricostituiti e/o diluiti secondo le modalità indicate all’interno delle rispettive schede tecniche. Cura deve essere prestata alla ricostituzione del farmaco di origine proteica. ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH ANTIOSSIDANTI: Per il blocco dell’ossidazione di metionina, cisteina, triptofano, e istidina. In genere l’ossigeno viene sostituito con un gas inerte. AGENTI ANTIAGGREGANTI: Sono necessari per ridurre l’assorbimento della proteina terapeutica alle superfici della fiala, siringa, ago. Molto usata l’albumina che agisce come surfattante. Questa ha natura anfifilica che contribuisce a ridurre l’adsorbimento della proteina tramite meccanismo competitivo. In questo caso le fiale non devono essere agitate per evitare la formazione di schiuma da parte di albumina che causa perdita o inattivazione del farmaco. PEPTIDI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA LA FARMACOLOGIA COMPRENDE FARMACODINAMICA Studia i meccanismi d’azione dei farmaci e gli effetti biochimici e fisiologici degli stessi studia gli effetti del farmaco sull'organismo FARMACOCINETICA ossia i processi che condizionano il raggiungimento ed il mantenimento di un'adeguata concentrazione dei farmaci nei vari compartimenti studia gli effetti dell'organismo sul farmaco FARMACOCINETICA (ADME) Studia i movimenti del farmaco nell’organismo. Le varie fasi della cinetica di un farmaco sono: Assorbimento Passaggio del farmaco dalla sede di applicazione al sangue attraverso le membrane biologiche. Metabolismo o Biotrasformazione Modificazioni chimiche che il farmaco subisce nell’organismo, principalmente ad opera del fegato. Distribuzione Distribuzione del farmaco dal sangue ai diversi compartimenti dell’organismo. Escrezione Eliminazione del farmaco dall’organismo, prevalentemente avviene ad opera del rene. ASSORBIMENTO ASSORBIMENTO DI FARMACI PEPTIDICI/PROTEICI Trasporto attivo • Barriere fisiche epiteliali • Barriere metaboliche (enzimi sulla superficie degli epiteli) LIMITE DI DIMENSIONE E IDROFILIA PER I FARMACI PEPTIDICI /PROTEICI Diffusione passiva (-------): limite idrofilia Assorbimento paracellulare (++++): limite dimensione Fagocitosi (+) Trasporto attivo (+) Ordine decrescente delle principali vie di somministrazione in relazione alla velocità ed entità dell’ASSORBIMENTO L’entità e la velocità di assorbimento di un farmaco dipendono anche dalla via di somministrazione 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Endovenosa (non c’è la fase di assorbimento) Inalatoria Sublinguale Sottocutanea Intramuscolare Intradermica Rettale Orale VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI La via parenterale è quella di elezione per peptidi e proteine terapeutiche Via parenterale che comprende: ENDOVENOSA INTRAMUSCOLARE SOTTOCUTANEA In particolare la sottocutanea: • è quella più impiegata per i peptidi perché più sicura rispetto all’endovenosa; • Il volume di iniezione e la profondità di iniezione influenzano l’assorbimento del peptide. • Inoltre la prolungata residenza nel sito d’iniezione aumenta l’esposizione a reazioni di degradazione (es.”insulino-resistenza” dovuta ad alte concentrazioni di peptidasi tissutali). PENNE PRE-RIEMPITE PER INSULINA VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI Via intranasale: • • • consente l’assorbimento di peptidi ad alto peso molecolare (> 2KDa); no metabolismo di primo passaggio epatico il muco tuttavia costituisce barriera fisica ed elettrostatica (carico negativamente). Via polmonare: • • • • • barriere epiteliali più sottili, ampia superficie esposta (100 m2), ricca vascolarizzazione, assenza metabolismo epatico, presenza di antiproteasi (l'alfa-1antitripsina è una glicoproteina che costituisce il più importante sistema di difesa delle vie respiratorie inferiori contro i danni causati da queste proteasi sulle pareti degli alveoli). VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI Via transdermica: • barriera fisica dello strato corneo; • barriera enzimatica di epidermide e derma. SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI PER VIA TRANSDERMICA Per veicolare un farmaco proteico attraverso la pelle intatta, è necessario sviluppare tecnologie che facilitino la permeazione transdermica di molecole che presentano caratteristiche chimicofisiche inadatte al superamento della barriera cutanea. Risultati particolarmente interessanti per il delivery transdermico di macromolecole sono stati ottenuti utilizzando iontoforesi, elettroporazione, sonoforesi e microporazione. SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI PER VIA TRANSDERMICA IONOFORESI Tecnica elettroterapica che utilizza una corrente continua, prodotta da un apposito generatore per favorire la somministrazione transdermica. MICROPORAZIONE Il modo comune di applicazione è la microperforazione seguita da applicazione di un cerotto medicato o una formulazione liquida. ELETTROPORAZIONE VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI LA VIA ORALE CONTROINDICATA a causa di: ELEVATA DEGRADAZIONE • • • • pH gastrico Endopeptidasi presenti a livello intestinale (pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi) Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B) Degradazione da parte della flora batterica SCARSO ASSORBIMENTO • • • Molecole di grande dimensioni Assenza di meccanismi di trasporto attivo Adsorbimento su cibi non digeribili PEPTIDI ATTIVI PER VIA ORALE IN COMMERCIO DESMOPRESSINA • E’ analogo della vasopressina, ormone pituitario, e viene utilizzata per il trattamento del diabete insipido • 9 residui amminoacidici • Ha natura ciclica • Biodisponibilità 1% CICLOSPORINA • E’ un farmaco antirigetto con effetto immunosoppressivo • 11 residui amminoacidici • Ha natura ciclica • Biodisponibilità 40% DISTRIBUZIONE DISTRIBUZIONE DI FARMACI PEPTIDICI NELL’ORGANISMO • I peptidi di piccole molecole e (<500 Da) sono distribuiti principalmente per diffusione. Questo può anche verificarsi per proteine più grandi (0,5-10 kDa), sebbene il processo sia più lento e avvenga soprattutto attraverso i nanopori delle pareti capillari. Ne consegue che il volume di distribuzione è relativamente piccolo. • Inoltre, il legame di peptidi alle proteine plasmatiche interferisce in maniera importante con il processo di distribuzione (65% di octreotideacromegalia e 98% di liraglutide-diabete si legano alle proteine plasmatiche). • A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio della biodistribuzione è necessario per evitare l’accumulo di metaboliti tossici in particolari tessuti, la biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo l’avvenuta distribuzione del farmaco in un particolare tessuto, dato che gli aminoacidi della proteina possono essere riutilizzati. DISTRIBUZIONE DI FARMACI PEPTIDICI NELL’ORGANISMO SANGUE DRUG La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo iniezione s.c. rappresenta l’unico meccanismo di trasporto per macromolecole, che raggiungono il torrente circolatorio indirettamente attraverso il sistema linfatico: composti con P.M. maggiore di 16kD vengono assorbiti dai vasi linfatici, mentre i composti inferiori a 1kD non vi penetrano quasi per nulla SITO D’INIEZIONE LINFA ELIMINAZIONE ELIMINAZIONE DI FARMACI PEPTIDICI/PROTEICI 1. PROTEOLISI Richiede in genere pochi minuti, il che spiega la loro breve emivita e gli effetti terapeutici limitati nel tempo. Le peptidasi (eso ed endo) sono ubiquitarie ma la maggior parte del processo avviene in sangue, fegato, reni, e piccolo intestino. Possono essere di membrana o solubili (sangue). Porta alla formazione di amminoacidi che vengono riutilizzati. 2. METABOLISMO EPATICO Non è la principale via di eliminazione ma contribuisce in caso di piccoli peptidi (bortezomib) o in caso di peptidi assunti per via orale (ciclosporina). 3. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE E’ rilevante solo in peptidi modificati che resistono alle peptidasi (exenatide) 4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA E’ un processo che contraddistingue peptidi e proteine (ORMONI POLIPEPTIDICI). Si verifica quando una porzione significativa del farmaco è legata al target farmacologico con alta affinità. Nel caso di peptidi una porzione consistente di farmaco rimane legato ai recettori che vengono poi internalizzati (uptake) e metabolizzati a livello cellulare. CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI PEPTIDICI SCARSO ASSORBIMENTO BASSA BIODISPONIBILITÀ La biodisponibiltà descrivere la frazione di farmaco somministrato che raggiunge inalterato la circolazione sistemica rispetto al totale somministrato. METABOLISMO VELOCE SCARSA EMIVITA PLASMATICA Per emivita plasmatica si indica il tempo richiesto per ridurre del 50% la quantità di un farmaco nel plasma. LE CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI PEPTIDICI INCIDONO ANCHE SUL LORO PROFILO FARMACODINAMICO IN GENERALE I FARMACI PEPTIDICI E PROTEICI HANNO DIFFICOLTÀ A RAGGIUNGERE RECETTORI INTRACELLULARI E IL SISTEMA NERVOSO CENTRALE STRATEGIE PER MIGLIORARE LE CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI PEPTIDICI 1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO • Sistemi depot parenterali • Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi) SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO Per migliorare l'efficacia delle proteine, si utilizzano sistemi iniettabili o impiantabili che garantiscano il rilascio prolungato delle proteine terapeutiche per periodi variabili da una settimana fino a diversi mesi. Un sistema ideale di delivery dovrebbe: • Proteggere la proteina dalla degradazione in vivo; • Controllarne anche la velocità di rilascio I sistemi a rilascio prolungato sono progettati per estendere gli effetti del farmaco e quindi permettere di avere vantaggi quali: • • • • riduzione della frequenza di somministrazione riduzione degli effetti indesiderati riduzione della tossicità locale e del dolore al momento della ’iniezione minori costi rispetto alla formulazione convenzionale SISTEMI DEPOT PARENTERALI MICROSFERE MATRICI POLIMERICHE IMPIANTI SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MICROSFERE Alcuni di questi prodotti parenterali commercializzati sono formulazioni polimeriche di microsfere che possono essere iniettate per via intramuscolare e sottocutanea per avere effetti sistemici oppure in un sito specifico dell’organismo per un trattamento localizzato. Le microsfere sono sistemi polimerici rigidi, con dimensioni micrometriche (3-800 µm). La matrice polimerica è spesso costituita da polilattico-poliglicolico (PLGA) e deve rispondere ai seguenti requisiti: • Deve garantire il mantenimento dell’integrità del farmaco durante le fasi di produzione e conservazione per preservarne stabilità e bioattività. • Deve garantire l’elevata incorporazione del farmaco. • Deve essere sicuro e non tossico • Deve garantire il controllo del grado di rilascio del farmaco MICROSFERE A BASE DI PLGA PER IL RILASCIO DI INSULINA SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MICROSFERE SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MATRICE POLIMERICA Astra Zeneca ha sviluppato lo Zoladex® a base di PLGA per il rilascio prolungato (28 giorni) di goserelin acetato (trattamento del carcinoma della prostata in cui sia indicata la soppressione della produzione di testosterone). Il dispositivo, di forma cilindrica con 1 mm di diametro, è dispensato all’interno di una siringa specializzata per l’iniezione sottocutanea. Il goserelin si somministra sotto forma d'iniezione sotto cute nella regione addominale. Di solito la somministrazione è mensile (ogni 4 settimane). L'iniezione deve essere eseguita da un medico o un infermiere. SISTEMI DEPOT IMPIANTABILI Questi dispositivi, inseriti sottocute mediante piccoli interventi chirurgici, sono sistemi ideali per il rilascio controllato di farmaci per periodi superiori ai sei mesi. La tecnologia d’impianto DUROS® è utilizzata nel sistema Viadur® contenente leuprolide acetato per il trattamento del tumore prostatico. Il Viadur® è un sistema osmotico che si è rivelato efficace nel ridurre i livelli di testosterone per un periodo di 12 mesi. DIMENSIONE: 4x45 mm MATERIALE: titanio SISTEMI LIPIDICI PER IL DELIVERY DI PROTEINE Le formulazioni liposomiali a lunga circolazione sono state studiate come sistemi di drug delivery e la letteratura suggerisce che tali formulazioni possano essere utilizzate anche per il prolungamento del tempo di circolazione di proteine e peptidi. L’incremento dell’emivita può variare tra 2 e 150 volte e dipende da: • rapporto proteina/lipide; • dimensioni liposomiali; • dalla composizione lipidica dei liposomi. I liposomi hanno la capacità di proteggere il loro contenuto dall’azione denaturante di enzimi e ambienti degradanti. LIPOSOMA SISTEMI LIPIDICI PER IL DELIVERY DI PROTEINE Il limite della veicolazione in liposomi convenzionali è dato dalla scarsa capacità di loading di macromolecole idrosolubili. Per ovviare a questi problemi sono stati sviluppati sistemi di delivery multivescicolari come il DepoFoam, costituito da microscopiche particelle sferiche contenenti centinaia di cavità acquose multiple, non concentriche che incapsulano il farmaco idrofilo. Le singole cavità sono separate da membrane a doppio strato lipidico formate da lipidi sintetici analoghi a quelli naturali che consentono di ottenere un carrier biocompatibile e biodegradabile. Formulazioni DepoFoam di proteine/peptidi quali insulina, leuprolide, encefaline ed octreotide sono stati già sviluppati e caratterizzati. DepoFoam STRATEGIE PER MIGLIORARE LE CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI PEPTIDICI 1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO • Sistemi depot parenterali • Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi) 2) STRATEGIE FORMULATIVE PER INCREMENTARE IL DELIVERY PER VIA ORALE • Associazione con molecole che possano inibire la degradazione • Associazione con molecole che possano incrementare l’assorbimento SISTEMI STUDIATI PER INCREMENTARE L’ASSORBIMENTO DI PROTEINE PER VIA ORALE Inibitori delle proteasi e tecniche di protezione dagli enzimi Gli inibitori enzimatici come l’aprotinina (inibitore di tripsina/chimotripsina), amastatina, bestatina, (inibitori delle amminopeptidasi) sono stati oggetto di numerosi studi che hanno evidenziato la loro efficacia nel preservare le molecole proteiche dal venire a contatto con il sistema enzimatico. Tuttavia questo approccio ha una limitata accettabilità pratica e commerciale in quanto la prolungata inattivazione enzimatica può provocare un incremento dell’attività enzimatica di ritorno e disturbi nella digestione delle proteine alimentari. Promotori di assorbimento I promotori di assorbimento comprendono varie classi di molecole che hanno in comune la capacità di favorire la penetrazione e/o il trasporto delle molecole attraverso le membrane biologiche. Molte di queste sostanze, come i sali biliari, agiscono alterando la fluidità delle mucose e delle membrane. PROMOTORI DI ASSORBIMENTO Tecnologia Transient Permeability Enhancer (TPE®) Si basa sull’utilizzo di sali sodici di acidi grassi a media catena come promotori di assorbimento. Il sodio caprato (C10) è la molecola più studiata e impiegata. IL SODIO CAPRATO PROMUOVE L’ASSORBIMENTO PARACELLULARE Tecnologia Peptelligence Si basa sull’utilizzo di lauroil (C12) carnitina e palmitoil (C16) carnitina come promotori di assorbimento. Le acil carnitine promuovono l’assorbimento paracellulare e transcellulare. lauroyl carnitine CARNITINA palmitoyl carnitine Tecnologia Peptelligence Tecnologia Eligen® Si basa sull’utilizzo di diversi carriers il più studiato dei quali viene chiamato SNAC. SNAC (sodium N-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino]caprylate) MECCANISMO Aumenta la superficie lipofila di insulina/calcitonina cui si lega in maniera non covalente e induce cambiamenti di conformazione al peptide, che determinano l'esposizione di regioni idrofobiche adatte alla permeazione transcellulare STRATEGIE PER MIGLIORARE LE CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI PEPTIDICI 1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO • Sistemi depot parenterali • Dispositivi impiantabili • Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi) 2) STRATEGIE FORMULATIVE PER INCREMENTARE IL DELIVERY PER VIA ORALE • Associazione con molecole che possano inibire la degradazione • Associazione con molecole che possano incrementare l’assorbimento 3) MODIFICAZIONI CHIMICHE DERIVATIZZAZIONE/CONIUGAZIONE • Coniugazione con cell penetrating peptides • PEGilazione • Coniugazione con il frammento Fc di una immunoglobulina G • Coniugazione con Albumina PEPTIDOMIMETICI Cell penetrating peptides (CPP) • SONO PICCOLI PEPTIDI (MENO DI 30 aa). • SPESSO CATIONICI • HANNO LA CAPACITÀ DI ATTRAVERSARE LE MEMBRANE!!!!! Coniugazione con cell penetrating peptides (CPP) + + + + + + + + Coniugazione con cell penetrating peptides (CPP) PROTEINA TERAPEUTICA CPP I CPP se funzionalizzati covalentemente con una macromolecola riescono a mantenere la capacità di attraversare le membrane. Per questo vengono considerati dei validi sistemi di trasporto di farmaci proteici che altrimenti non riuscirebbero ad entrare nella cellula. Cell penetrating peptides (CPP) Meccanismo STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI: LA CONIUGAZIONE CON POLIMERI IDROFILI PEGILAZIONE La strategia più efficace ad oggi è costituita dalla coniugazione della proteina terapeutica con PEG (PEGilazione) ossia la funzionalizzazione del farmaco con polimeri di poliossietilene. l glicole polietilenico (PEG) o poliossietilene (POE) è un polimero preparato per polimerizzazione dell‘ossido di etilene. polimerizzazione OSSIDO DI ETILENE PEG GLICOLE ETILENICO PEGILAZIONE • Il PEG è un polietere di natura anfifilica • I PEG possono essere lineari o ramificati • I PEG possono avere peso molecolari variabili • I polimeri di PEG sono molecole inerti e non tossiche • Una stessa proteina terapeutica può essere funzionalizzata con più catene di PEG EFFETTI DELLA PEGILAZIONE SULLE PROPRIETÀ DI PROTEINE TERAPEUTICHE AUMENTO SOLUBILITÀ IN ACQUA RIDOTTA IMMUNOGENICITÀ La porzione idrofilica può incorporare un La flessibilità della porzione idrofilica puo’ elevato numero di molecole di acqua . coprire i determinanti antigenici della proteina. RIDOTTA ELIMINAZIONE RENALE La proteina derivatizzata ha una maggiore dimensione che ostacola la filtrazione glomerulare. AUMENTO DELLA RESISTENZA METABOLICA Le catene di PEG costituiscono uno scudo protettivo nei confronti degli enzimi proteolitici. ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA L’Interferone alfa-2a (Roferon®) di Hoffman- La Roche è stato approvato dalla FDA nel 1984 per il trattamento dell’epatite C cronica mediante somministrazioni sottocutanee da ripetersi 3 volte alla settimana per un periodo di 11-12 mesi. Nel 2002 è stata lanciata una seconda generazione di interferone coniugato con catene di PEG ramificato (PM 43 KDaltons) noto come Pegasis® (Interferone alfa-2a pegilato) Il Pegasis® ha mostrato un efficacia clinica di gran lunga superiore al Roferon A® come conseguenza del rilascio controllato del farmaco che determina livelli sistemici costanti di interferon alfa-2a. Un ulteriore vantaggio è il miglioramento della compliance del paziente per effetto di una sola somministrazione alla settimana contro le tre del Roferon A®. ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA LINKER PEG PEPTIDE PEGINESATIDE è un peptide sintetico PEGilato. Imita la struttura dell’eritropoietina, la glicoproteina umana che promuove lo sviluppo di globuli rossi. ERITROPOIETINA ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA PEGVISOMANT (SOMAVERT) È una proteina contenente 191 residui amminoacidici legata covalentemente a diversi polimeri di polietilene glicole. Progettato per bloccare il recettore dell'ormone della crescita. E‘ prodotto utilizzando batteri E. coli geneticamente modificati. ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA Indicato nel trattamento dell'ipercalcemia associata a tumori maligni, iperparatiroidismo ed intossicazione da calcio. Come tale ha un’emivita di circa 3 ore mentre la CALCITONINA PEGILATA ha un’emivita di 15 ore POSSIBILI SVANTAGGI DELLA PEGILAZIONE • Perdita di attività • Il PEG non è biodegradabile ALTRI APPROCCI DI CONIUGAZIONE CON POLIMERI IDROFILI BIODEGRADABILI STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI: PEPTIBODY Un’altra strategia per migliorare le caratteristiche farmacocinetiche di un farmaco peptidico è quella di innestare peptidi sulla regione Fc di una immunoglobulina G (IgG). Questi peptidi fusi, sviluppati per la prima volta da Amgen sono stati chiamati peptibodies e rappresentano una nuova classe terapeutica. L’approccio fornisce una lunga emivita in circolo del peptide terapeutico PEPTIBODY IN TERAPIA ROMIPLOSTIM (NPLATE) Nplate viene utilizzato negli adulti affetti da porpora trombocitopenica immunitaria (PTI) cronica, una malattia in cui il sistema immunitario del paziente distrugge le piastrine. Emulando l'azione della trombopoietina, romiplostim stimola la produzione di piastrine, aumentando la conta di piastrine nel sangue. Romiplostim non ha sequenze amminoacidiche omologhe con quelle della TPO endogena. Nplate deve essere somministrato una volta alla settimana mediante iniezione sottocutanea PEPTIBODY IN TERAPIA ROMIPLOSTIM (NPLATE) STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI: FUSIONE CON ALBUMINA ALBUMINA L’albumina è la proteina plasmatica del peso approssimativo di 67kDa. Ha un’emivita di 19 giorni. La fusione di una proteina terapeutica con albumina ne aumenta l’emivita plasmatica. PROTEINE FUSE CON ALBUMINA IN TERAPIA Albiglutide (Eperzan o Tanzeum) Agisce legandosi ai recettori di una sostanza, denominata peptide glucagone-simile 1 (GLP1), che si trovano sulla superficie delle cellule del pancreas, stimolandoli a rilasciare insulina. La fusione con albumina porta l’emivita plasmatica del peptide da poche ore a giorni. Richiede somministrazione sottocutanea settimanale. Perché le strategie PEPTIBODY e di fusione con ALBUMINA allungano l’emivita plasmatica di una proteina terapeutica? FcRn (Neonatal Fc receptor) o recettore di Brambell, è un recettore per la regione costante delle immunoglobuline PEPTIDOMIMETICI PEPTIDOMIMETICI: DEFINIZIONE Peptidi modificati chimicamente con caratteristiche strutturali analoghe a quelle dei peptidi naturali ma con migliori proprietà farmacologiche tra cui un’aumentata stabilità in vivo per una MAGGIORE RESISTENZA ALLE PEPTIDASI Alcune altre proprietà, come la selettività recettoriale o la potenza, spesso possono essere notevolmente migliorate rispetto al peptide di riferimento. Quindi i peptidomimetici hanno un grande potenziale nel campo della drug discovery. PEPTIDOMIMETICI: COSA MIMANO Un qualsiasi peptide di varia origine che svolga una funzione biologica di possibile interesse farmaceutico e di cui si conosca l’esatta sequenza amminoacidica: • Peptidi endogeni umani • Peptidi di origine vegetale • Peptidi di origine batterica • Peptidi di origine animale AZIONE BIOLOGICA PEPTIDOMIMETICI La modifica chimica di un peptide ne cambia sia la struttura primaria che quella secondaria e terziaria. Entrambi gli aspetti contribuiscono alla stabilizzazione in quanto gli enzimi responsabili della degradazione riconoscono sia la sequenza amminoacidica che la struttura tridimensionale di un peptide. La modifica chimica può essere fatta al fine di favorire la conformazione bioattiva e sfavorire conformazioni che invece sono soggette a degradazione enzimatica La modifica chimica può essere fatta al fine di mascherare le sequenze riconosciute dalle peptidasi PEPTIDOMIMETICI Tutte le possibili modifiche della sequenza peptidica per l’ottenimento di un peptidomimetico sono quindi finalizzate a: • Imporre delle restrizioni conformazionali • Modificare la catena laterale degli amminoacidi • Modificare il backbone e in particolare il legame ammidico Come stabilire quale parte della molecola è possibile modificare senza perdere attività biologica? Dobbiamo conoscere il FARMACOFORO FARMACOFORO È la più piccola unità strutturale della molecola di un farmaco responsabile della sua attività biologica. E’ la regione che media l’attività biologica in quanto identifica la superficie tridimensionale coinvolta nell’interazione con il recettore. RECETTORE In un farmaco peptidico/proteico questa può comprendere sia una sequenza di amminoacidi vicini tra loro che residui amminoacidici separati tra loro nella sequenza lineare del peptide che però si trovano ad essere vicini nella struttura tridimensionale della conformazione bioattiva FARMACOFORO Catene laterali 1 2 3 4 5 6 H2N COOH 4 2 3 1 Legami ammidici labili 3 1 5 5 R MODELLO FARMACOFORICO H2N COOH R RECETTORE 6 In cui si irrigidiscono i residui fondamentali in scheletri molecolari con migliore resistenza rispetto al peptide IDENTIFICAZIONE DEL FARMACOFORO CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X Idealmente, l’analisi delle strutture cristalline mediante cristallografia a raggi X fornisce conferma accurata e visiva di residui amminoacidici coinvolti all'interfaccia ligando recettore. Tuttavia, l'ottenimento di strutture cristalline è lento, impegnativo e non è sempre applicabile. Inoltre, una singola struttura cristallina può rivelare solo una delle possibili conformazioni in equilibrio di un peptide. RISONANZA MAGNETICA Se effettuata sul complesso peptide-recettore può fornire indicazioni su quali residui amminoacidici siano coinvolti nel legame. MODELLISTICA MOLECOLARE Il docking molecolare, nel campo della modellistica molecolare, è un metodo che predice l'orientamento preferito di un ligando verso una recettore quando questi si legano fra di loro per formare un complesso stabile. STUDIO SAR Gli studi di relazione struttura-attività (SAR) possono identificare i principali farmacofori e i residui chiave che sono responsabili per l'effetto biologico. È l’approccio più veloce e di più semplice applicazione. SAR: IDENTIFICAZIONE DELLA MINIMA SEQUENZA ATTIVA Lo studio di relazione struttura-attività (SAR) può definire in una prima fase la minima sequenza attiva del peptide di interesse. PEPTIDE DI INTERESSE N- e C-terminal truncation or deletion approach IDENTIFICAZIONE DEL FARMACOFORO: ALANINE SCANNING La sistematica sostituzione nella sequenza primaria con un residuo di Alanina (Ala-scan), permette di avere informazioni riguardo l’importanza delle singole funzioni chimiche degli aminoacidi per l’interazione recettoriale. L’alanina è utilizzata in quanto presenta un gruppo metilico non ingombrato chimicamente e inerte. Questa tecnica è rapida, perché molte catene laterali vengono analizzate simultaneamente. Peptide Scanning for Studying Structure-Activity Relationships in Drug Discovery D-SCAN La sostituzione sistematica di ogni residuo con il suo enantiomero fornisce informazioni sull'importanza della configurazione di ogni amminoacido in termini di attività biologica Prolina SCAN N-CH3 SCAN La sostituzione sistematica del gruppo NH del legame ammidico con CH3 aiuta a definire l’eventuale coinvolgimento in ponti H con il recettore. La scansione con prolina è stata utilizzata per studiare la relazione tra conformazione e attività in quanto la prolina tende a favorire determinate conformazioni. INFORMAZIONI PROVENIENTI DALLO STUDIO SAR Uno studio SAR può portare ad avere indicazioni riguardanti: • • • • • LA SEQUENZA MESSAGE LA SEQUENZA ADDRESS I REQUISITI STEREOCHIMICI DI OGNI SINGOLO AMMINOACIDO HOT SPOTS POSSIBILE CONFORMAZIONE BIOATTIVA ADDRESS MESSAGE PROGETTAZIONE PEPTIDOMIMETICI MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE INFORMAZIONI SAR 1. Restrizioni conformazionali 2. Modifiche della catena laterale degli amminoacidi 3. Modificare il backbone e in particolare il legame ammidico CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI PEPTIDE DI PARTENZA PONTI DISOLFURO LATTAMI CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI A B C B A C CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI La Bifalina è un peptide oppioide dimerico (Tyr-Ala-Gly-Phe-NH)2. La presenza di due distinti farmacofori conferisce alla Bifalina un'elevata affinità sia per i recettori oppioidi μ che per i δ mostrando quindi un'attività analgesica. IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO Incorporazione di amminoacidi non naturali conformazionalmente vincolanti. Gli amminoacidi metilati in varie posizioni e gli amminoacidi ciclici hanno come effetto quello di restringere severamente la rotazione attorno ai legami phi e psi. AMMINOACIDI METILATI β α AMMINOACIDI CICLICI Atc IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO Gli amminoacidi N-metilati hanno come effetto quello di restringere severamente la rotazione attorno ai legami phi e psi. MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE INFORMAZIONI SAR 1. Restrizioni conformazionali 2. Modifiche della catena laterale degli amminoacidi 3. Modificare il backbone e in particolare il legame ammidico INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI NON NATURALI INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI GLICOSILATI (glicopeptidi) La glicosilazione di peptidi porta a • aumentare la stabilità metabolica in quanto maschera le catena laterali; • ostacolare processi di ossidazione; • facilitare il trasporto attivo di composti modificati attraverso le membrane cellulari mediante interazione con trasportatori di glucosio sulla superficie delle membrane. β-D-Glucosio Ser Ser INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI GLICOSILATI (glicopeptidi) derivato dell’encefalina non glicosilato derivato dell’encefalina glicosilato Il derivato glicosilato dell’encefalina 2, produce effetti analgesici anche se somministrato a livello periferico in topi. INTRODUZIONE DI D-AMMINOACIDI INTRODUZIONE DI D-AMMINOACIDI H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 La dermorfina è un epta-peptide isolato per la prima volta dalla pelle di alcune rane del sudamerica. MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE INFORMAZIONI SAR 1. Restrizioni conformazionali 2. Modifiche della catena laterale degli amminoacidi 3. Modificare il backbone e in particolare il legame ammidico SOSTITUZIONI DEL LEGAME PEPTIDICO CON BIOISOSTERI DEL LEGAME AMMIDICO Il concetto di BIOISOSTERIA Friedmann (1951) definisce bioisosteri gruppi funzionali aventi analogie chimiche e fisiche e che quindi producono effetti biologici spiccatamente simili Depsipeptidi La sostituzione isosterica di almeno un gruppo amminico in catena peptidica da un atomo di ossigeno porta alla formazione di depsipeptidi. Questi sono in pratica peptidi in cui uno o più legami ammidici sono sostituiti da un gruppo estereo. L’ eliminazione dei gruppi NH porta ad una riduzione della capacità di donare legami idrogeno provocando variazioni conformazionali importanti. Hanno strutture più flessibili in quanto il legame estereo è meno rigido del legame peptidico. Depsipeptidi A B Romidepsin, noto anche come Istodax, è un agente antitumorale utilizzato in terapia per il trattamento di alcune forme di linfoma. Romidepsin è un prodotto naturale ottenuto da un batterio, e agisce bloccando gli enzimi noti come istone deacetilasi, in tal modo inducendo l'apoptosi. Tiodepsipeptidi La sostituzione dell'azoto ammidico da un atomo di zolfo genera una nuova classe di peptidi noti come tiodepsipeptidi. Tiodepsipeptidi macrociclici sono stati isolati da fonti naturali e hanno trovato applicazioni preziose in medicina. Sostanza naturale antitumorale AZAPEPTIDI La sostituzione del carbonio α di un amminoacido di un peptide con azoto genera una nuova classe di composti chiamati azapeptidi. Sono analoghi semicarbazidici dei corrispondenti peptidi. La sostituzione provoca cambiamenti significativi sia chimici che relativamente alle proprietà biologiche del peptide di riferimento. Questa sostituzione elimina la chiralità del residuo modificato. ATAZANAVIR Anti HIV ISOSTERI DEL LEGAME AMMIDICO RETROPEPTIDI E PEPTIDI RETROINVERSI Si definisce retropeptide un peptidomimetico in cui uno o più legami peptidici CONH- è sostituito da -NHCO-. Se anche le configurazioni dei centri alfa-chirale sono invertiti, allora peptide viene definito retroinverso. INTRODUZIONE DI β-AMMINOACIDI RIASSUNTO MODIFICHE LEGAME AMMIDICO PEPTIDOMIMETICI DI TIPO I: Sono anche noti come pseudo-peptidi e hanno una sequenza amminoacidica modificata rispetto a quella dei composti peptidici di riferimento ma mantengono la parte bioattivo responsabile dell’interazione con il sito di legame con il recettore. PEPTIDOMIMETICI DI TIPO II: Questo tipo di peptidomimetici sono in realtà delle small-molecules che si legano al recettore del peptide progenitore con cui condividono solo alcune analogie strutturali
