La Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica di Arabidopsis

La Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica di Arabidopsis thaliana: purificazione di
un’isoforma espressa in lievito
M. Cerana, L. Luoni, M.C. Bonza e M.I. De Michelis
Dipartimento di Biologia-Università degli Studi di Milano
At-ACA8 è una Ca2+-ATPasi coinvolta nella fine regolazione dell’omeostasi del Ca2+ citosolico e
localizzata a livello della membrana plasmatica (PM) delle cellule di A. thaliana
L’enzima appartiene alla superfamiglia delle P-type ATPasi; in particolare alla sottofamiglia IIB
che identifica le Ca2+-ATPasi la cui attività è regolata dall’interazione diretta con la calmodulina
(CaM). Come molti enzimi regolati dall’interazione con la CaM anche At-ACA8 contiene
nell’estesa porzione N-terminale un dominio autoinibitorio parzialmente sovrapposto al dominio di
legame per la CaM.
Nelle piante la Ca2+-ATPasi del PM è meno dell’1% delle proteine totali di membrana; inoltre a
livello del PM di A. thaliana sono presenti più isoforme (At-ACA8 e At-ACA9 e possibilmente AtACA10). In questo laboratorio è stato messo a punto un efficace metodo per la purificazione della
Ca2+-ATPasi del PM delle cellule in coltura di A. thaliana tramite cromatografia di affinità su resina
di CaM agarosio; per ottenere una quantità consistente di una singola isoforma da poter utilizzare
per studi di tipo strutturale è stato però necessario esprimere At-ACA8 in un sistema eterologo.
In questo lavoro At-ACA8 è stata overespressa nel ceppo K616 di S. cerevisiae un mutante privo
Ca2+-ATPasi endogene.
La frazione microsomale proveniente dalle cellule di K616 trasformate con At-ACA8 è stata
frazionata su un gradiente discontinuo di saccarosio. At-ACA8 è presente sia a livello del PM che
nel reticolo endoplasmico (ER) di lievito in cui si recupera il 50% delle proteine totali caricate sul
gradiente. Nella frazione arrichita in ER ad un accumulo di At-ACA8 corrisponde inoltre un
arricchimento dell’attività enzimatica altamente stimolata da CaM. At-ACA8 è stata purificata, a
partire dalla frazione arricchita in ER, mediante cromatografia di affinità utilizzando una resina di
CaM-agarosio, sfruttando l’elevata affinità esistente tra l’enzima e la CaM. Questa procedura di
purificazione ha consentito di ottenere una frazione, eluita con 5 mM EDTA, fortemente arricchita
in At-ACA8: infatti la proteina rappresenta circa il 90% delle proteine totali presenti nelle frazione.
L’eluizione della resina con 5 mM EDTA consente inoltre il recupero di circa il 25% dell’attività
Ca2+-ATPasica presente nella frazione arricchita in ER. Utilizzando questa metodica si ottengono
circa 0.1 mg di proteina per litro di coltura ed una frazione fortemente arricchita in At-ACA8,
condizioni necessarie per avviare degli studi di cristallografia.