Identificazione e studio delle Cellule Staminali Tumorali del carcinoma della mammella e dell’adenocarcinoma del colon Carmelo Lupo Coordinatore Tecnico U.O. Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica Casa di Cura di Alta Specialità La Maddalena Palermo AITIC Riccione 19-22 maggio 2009 Centro OncoBiolgia Sperimentale Referenze Incontri ravvicinati…. Staminali Tumorali Modello di crescita delle staminali tumorali MODELLO GERARCHICO Cellule Staminali Tumorali Sono state identificate in tumori solidi e del sangue �Hanno proprietà simili alle normali staminali ma sono in grado di dare origine a cellule che presentano una resistenza maggiore ai farmaci �Hanno la capacità di auto-rigenerarsi Stem cells in breast cancer are CD44+, CD24-/low, ESA+. Nel carcinoma della mammella la percentuale delle staminali tumorali è del 10-20% “Cancer stem cells drive metastasis” Nature Breast Cancer Stem Cells are Metastatic Progetto Staminali Tumorali APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE Staminali tumorali come comune denominatore Prelievo di frammento di carcinoma della mammella in sala operatoria TAGLIO SPECULARE Frammento A: un frammento del tumore per la diagnosi istologica e fattori prognostici Frammento B: il frammento speculare destinato alle colture cellulari Frammento B: Campione chirurgico prelevato e posto in PBS; entro 15’ nel Laboratorio di Colture cellulari (criticità per mRNA) Dissociazione del tessuto Dissociazione del tessuto tramite enzimi (es: Collagenasi ) Successivamente Tripsina e DNAsi Separazione per centrifugazione della quota cellulare dall’estratto e successivi lavaggi Cellule in coltura Le cellule isolate vengono poste in coltura con siero al 20% ed antibiotici in una fiasca da 25 cm2 (terreno di coltura DMEM + Glutamina o RPMI) Crescita (nelle cellule tumorali manca l’inibizione da contatto) 7g Numero di cellule 4g tempo La crescita cellulare ha un andamento gompertziano Prima settimana: stato di confluenza, attese 2 milioni di cellule alla conta (popolazione eterogenea) Distacco mediante EDTA o Tripsina Conta Risemina in due fiasche da 75 cm2 ed una da 175 cm2 Attesa di circa un’altra settimana Sorting Popolazione cellulare eterogenea (staminali tumorali, tumorali adulte) Necessario fare un “SORTING” (citofluorimetro; sistema sfere magnetiche) CITOFLUORIMETRIA ANTIGENI CELLULE TUMORALI STAMINALI DELLA MAMMELLA CD44+ CD24-/low ESA+(antigene superficiale epiteliale) Cellule staminali tumorali del carcinoma della mammella Dopo circa un mese avremo le nostre staminali tumorali del tumore della mammella. Lo scopo dello studio è finalizzato all’identificazione di un fenotipo e di un genotipo Proiettare la tecnica per isolare le staminali del tumore del colon. Abbiamo “sacrificato” alcune cellule in coltura per… allestire citologici su strato sottile ThinPrep ed effettuare reazioni immunoistochimiche con: CK CD44 CD133 Abbiamo osservato: Popolazione eterogenea CK+ CK+ CK+ positività apicale Negatività Perché cellule epiteliali di mammella sono negative per CK? Marcatore di staminalità CD44 CD44+ CD44+ CD44+ CD44+ CD133 expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer Horst D, Kriegl L, Engel J, Kirchner T, Jung A. Pathologisches Institut der Ludwig-Maximilians-Universität München BJC 2008 Oct 21;99(8):1285-9. Epub 2008 Sep 9 COLON: CD133 CD133 Microdissettore laser Estrazione DNA Estrazione RNA Sequenziamento per mutazioni note e non note Mappe Proteomiche Studio delle staminali tumorali in Anatomia Patologica e comparazione con il dato istologico: Tecniche immunoistochimiche PTEN; CD133; CD44; CD24, ESA; Tecnica FISH Determinazione dello status dei geni FENOTIPO Approccio proteomico Mappa proteomica (comparare profili proteomici con cellule tumorali adulte sfruttando proteine già note) Sequenziamento DNA Analisi mutazionale di segmenti di DNA delle staminali per identificare le mutazioni genetiche coinvolte: Sequenziamento K-RAS, B-RAF, Microarray Elettroferogramma K-RAS Mappa proteomica Immunoistochimica DATA-MATCHING Follow-up FISH Microarray Abbiamo il potenziale giusto Perché farlo? Potremmo avere il fenotipo delle cellule staminali tumorali che, comparata con mappe già note di cellule tumorali adulte, potrebbe evidenziare ulteriori proteine presenti solo nelle staminali tumorali. Identificare proteine ignote o comunque specifiche per le staminali tumorali potrebbe portare alla creazione di anticorpi/farmaci specifici e selettivi. Identificare il genotipo delle staminali tumorali potrebbe aiutarci a capire il pathway degli errori/mutazioni genetici (amplificazioni, delezioni, traslocazioni) coinvolti. Cancer stem cell TARGET THERAPY Prospettive future Radiology Radiotherapy Oncology Nuclear medicine Grazie per l’attenzione