Prof. F. Carinci Ultimi sviluppi nella genetica delle schisi Martinelli 2013 Morfogenesi Prof. F. Carinci Prof. F. Carinci History: 1942 - Fough-Andersen 1970 - Fraser Carinci F, et al. Am J Hum Genet. 1995;56(1):337-9. Scapoli L, et al. Genomics. 1997;43(2):216-20. Scapoli L, et al. Am J Med Genet. 1998;75(2):203-6. Pezzetti F, et al. Genomics. 1998;50(3):299-305. Bosi G, et al. J Dent Res. 1998;77(8):1613-21. Martinelli M, et al. Genomics. 1998;51(2):177-81. Bodo M, et al. J Dent Res. 1999;78(12):1783-90. Carinci F, et al. Cleft Palate Craniofac J. 2000;37(1):33-40. Martinelli M, et al. Am J Med Genet. 2001;98(4):357-60. Pezzetti F, et al. Ann Hum Genet. 2000;64(Pt 4):341-7. Scapoli L, et al. Hum Genet. 2002;110(1):15-20. Martinelli M, et al. Ann Hum Genet. 2001;65(Pt 5):465-71. Farina A, et al. Orthod Craniofac Res. 2002;5(3):185-91. Carinci F, et al. J Craniofac Surg. 2003;14(2):130-43. Baroni T, et al. J Periodontol. 2003;74(10):1447-53. Scapoli L, et al. Am J Med Genet. 2004 1;127A(2):211. Pezzetti F, et al. Hum Mutat. 2004;24(1):104-5. Scapoli L, et al. Am J Hum Genet. 2005;76(1):180-3. Scapoli L, et al. Am J Med Genet A. 2005;132(3):302-4. Carinci F, et al. J Craniomaxillofac Surg. 2005;33(2):91-4. Rullo R, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2005 Sep 9. Martinelli M, et al. Hum Mutat. 2006; 27: 294. Scapoli L, et al. Ann Hum Genet. 2006; 70: 410-3. Rullo R, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2006. Baroni T, et al. Mol Med. 2006; 12(9-10): 237-45. Martinelli M, et al. J Med Genet. 2007;44(6):387-92. Pezzetti F, et al. Eur J Hum Genet. 2007; [Epub ahead of print] Carinci F, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2007; [Epub ahead of print] Rullo R, et al. J Craniofac Surg. 2007; 18(6):1276-1280. Palmieri A, et al. Ann Hum Genet. 2008; [Epub ahead of print] Martinelli M, et al. Eur J Oral Sci. 2008 Jun;116(3):287-90. Scapoli L, et al. Eur J Oral Sci. 2008; 116(6):507-11. Marinucci L, et al. Toxicology. 2008 Dec 9. Pezzetti F, et al. Pathology. 2009 Apr;41(3):261-8. Martinelli M, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2009 Mar 21. Baroni T, et al. J Cell Physiol. 2010 Mar;222(3):748-56. Scapoli L, et al. Hum Mutat. 2010 May 18. Gagliano N, et al. Cleft Palate Craniofac J. 2010;47(4):393-9. Marinucci L, et al. Expert Opin Drug Saf. 2010 Jul 20. Girardi A, et al. Eur J Oral Sci. 2011; 119:102-5. Prof. F. Carinci STARTING POINT Martinelli 2013 Martinelli 2013 Campioni di sangue periferico 38 famiglie 274 individui 82 affetti 398 triadi Martinelli 2013 EPIDEMIOLOGIA La CL/P colpisce circa un bambino ogni 700 nati vivi La maggior parte sono casi sporadici Si ha famigliarità nel 20% dei casi Variabilità dipendente dalla zona geografica esaminata Più di 300 sindromi con schisi Ereditarietà complessa Martinelli 2013 Schisi labiopalatine CPO sindromici CL/P casi sporadici non-sindromici casi familiari Martinelli 2013 FATTORI GENETICI OFC1 (locus 6p24-p23) OFC2 (locus 2p13) OFC3 (locus 19q13.2) OFC4 (locus 4q21-q31) OFC5 (MSX1 gene) OFC6 (IRF6 gene) OFC7 (PVRL1 gene) OFC8 (TP73L gene) OFC9 (locus 13q33.1-q34) OFC10 (SUMO1 gene) OFC11 (BMP4 gene) OFC12 (locus 8q24.31) MTHFR (locus 1p36) TGFβ3 (locus 14q24) RARα (locus 17q21.1) Martinelli 2013 FATTORI AMBIENTALI anticonvulsivanti fumo steroidi anticoagulanti folati Martinelli 2013 EPIDEMIOLOGIA L’assunzione periconcezionale di multivitaminici contenenti acido folico riduce l’insorgenza di: difetti di chiusura del tubo neurale patologie a carico del tratto urinario anomalie cardiovascolari congenite labiopalatoschisi ? Martinelli 2013 Fattore Willis Vitamina M Acido folico Acido pteroilglutammico Vitamina B9 Folacina Martinelli 2013 Martinelli 2013 LIVELLI DI ASSORBIMENTO Da solo 100% Con gli alimenti Come folati dai cibi Cibi cotti 85% 50% riduzione dell’80% Martinelli 2013 Assorbimento intestinale e sintesi delle forme attive dell’acido folico Martinelli 2013 Rimetilazione dell’omocisteina a metionina Sintesi della SAM Sintesi dei nucleotidi Sintesi dell’emoglobina Metilazione di DNA, proteine, neurotrasmettitori e fosfolipidi Martinelli 2013 La via metabolica del folato SAM+ee- B12+ MTRR Metionina Folato SAH THF B12 MTR 5,10-MTHF CH3-B12 Omocisteina MTHFR TCN B12 5-MTHF FOLRs Martinelli 2013 LA VIA METABOLICA DEL FOLATO: implicazioni in malformazioni congenite Martinelli 2013 EPIDEMIOLOGIA DELLA SPINA BIFIDA Più comune malformazione del sistema nervoso centrale Colpisce circa un bambino ogni 8000 nati vivi Chiusura incompleta di una o più vertebre Eziologia multifattoriale Aumento di rischio in carenza di folato plasmatico Martinelli 2013 Martinelli 2013 NTD e ACIDO FOLICO 4 mg/die acido folico 514 5/514 = 1% multivitamine senza ac. folico 517 18/517 = 3.5% Riduzione di NTD del 72% Martinelli 2013 Campagna di prevenzione Martinelli 2013 Fortificazione degli alimenti Riduzione di NTD del 28% in U.S.A. Riduzione di NTD del 46% in Canada Martinelli 2013 La European Food Safety Authority (EFSA) nel 2009 ha condotto uno studio valutativo del vantaggio della fortificazione alimentare rinunciandovi Martinelli 2013 Variante C677T del gene MTHFR Sostituzione aminoacidica Ala222Val Forma termolabile dell’enzima con attività ridotta dell’omocisteina plasmatica del folato plasmatico Martinelli 2013 La via metabolica del folato SAM+ee- B12+ MTRR Metionina Folato SAH THF B12 MTR 5,10-CH3THF CH3-B12 Omocisteina MTHFR TCN B12 5-CH3THF FOLRs Martinelli 2013 Verifica del ruolo dell’MTHFR nelle schisi labiopalatine Martinelli 2013 MATERIALI E METODI CAMPIONI DI SANGUE 107 triadi famigliari 291 triadi di casi sporadici 398 affetti da CL/P Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Estrazione DNA Amplificazione in PCR Digestione enzimatica Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Elettroforesi su poliacrilammide Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Studio di linkage disequilibrium 198 bp 175 bp allele C allele T Foto di separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide delle varianti al polimorfismo C677T al gene MTHFR Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Estrazione DNA RealTime PCR Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Studio di linkage disequilibrium Genotipizzazione di SNP mediante RealTime PCR e sonda TaqMan Martinelli 2013 MATERIALI E METODI Studio di linkage e associazione Analisi statistica col metodo del TDT (Transmission Disequilibrium Test) Non parametrico c2td = (B-C)2 (B+C) Martinelli 2013 RISULTATI – MTHFR C677T Non vi è differenza nella trasmissione degli alleli C e T Il genotipo dei figli affetti non conferisce aumento del rischio di CL/P Nelle madri vi è un aumento significativo della frequenza dell’allele T Il genotipo materno TT conferisce aumento di rischio di generare prole con CL/P Martinelli 2013 RISULTATI – MTHFR C677T e A1298C Martinelli 2013 La via metabolica del folato Martinelli 2013 RISULTATI – FOLR1 e FOLR2 E’ stato riscontrato pattern alterato solo per una madre e suo figlio Martinelli 2013 RISULTATI – TCN - MTR - MTRR Nessuna prova di coinvolgimento per TCN1, MTR e MTRR La variante 776C (259Pro) del TCN2 influenza il rischio di sviluppare la schisi Martinelli 2013 RISULTATI – MTHFD1 Studio di due polimorfismi non sinonimi Trasmissione borderline dell’aplotipo più frequente (401G/1958G) Forse ruolo minore di MTHFD1 nella schisi 401 G>A Ex 6 1958 A>G Ex 20 Annals of Human Genetics (2008) 72,297–299 Martinelli 2013 RISULTATI – BHMT1 - BHMT2 - CBS Livelli di associazione non significativi per le varianti dei polimorfismi mappanti in BHMT1 e 2 Associazione con una variante del polimorfismo rs4920037 al CBS Presenza di una interazione materno-fetale per CBS Martinelli 2013 CONCLUSIONI La via metabolica del folato è sicuramente implicata nell’insorgenza di malformazioni congenite, tra cui le schisi labiopalatine Una buona campagna di prevenzione potrebbe ridurre l’incidenza di queste patologie Martinelli 2013 Martinelli 2013