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Lezione 15-16-regolazione genica in eucaroti 15-05-14 CLA 26-05-14 Un singolo fattore trascrizionale influisce sull’attività di parecchi geni target UNA SINGOLO REGOLATORE ATTIVA PARECCHI GENI DIVERSI Un singolo gene target è influenzato da piu’ fattori trascrizionali Abbiamo pochi esempi di geni “Master” la cui presenza è necessaria e sufficiente alla regolazione Nucleo citoplasma ambiente esterno comunicano TGFbeta Pathway 1- il controllo trascrizionale avviene con due meccanismi • • epigenetico mediante fattori di trascrizione ( attivatori e repressori) Il DNA è organizzato in cromosomi I cromosomi sono fatti di DNA e proteine IL DNA è organizzato in cromatina a formare una struttura più o meno compatta di fibre di 30 nm di diametro La cromatina Diversi gradi di compattazione della cromatina eterocromatina eucromatina nucleolo involucro nucleare Un meccanismo per modulare il grado di condensazione della cromatina: la modificazione chimica reversibile delle code degli istoni Le code istoniche protrudono dal nucleosoma e partecipano al compattamento della cromatina code istoniche (N-terminale) Amminoacidi soggetti a modificazione Il nucleosoma è costituito da DNA a doppia elica e dai quattro istoni principali H3 H4 H2A H2B Enzimi modificatori degli istoni R K Metilazione Istone acetil-trasferasi Istone deacetilasi Acetilazione S Fosforilazione Lisina metil-trasferasi Lisina demetilasi Arginina metil-trasferasi T Y Protein chinasi Protein fosfatasi EPIGENETICA modificazioni dell’attività genica che non comportano alterazioni della sequenza del DNA ma sono ereditabili e controllano espressione genica - tessuto-specifica - sviluppo-specifica silenziamento genico: - inattivaz. crom. X - position-effect variegation - genomic imprinting Una volta definito, il pattern di espressione viene ereditato EPIGENETICA modificazioni dell’attività genica che non comportano alterazioni della sequenza del DNA, sono ereditabili e riprogrammabili Esempi di Meccanismi 1. modificazioni degli istoni: 2. metilazione del DNA 3……… - acetilazione - fosforilazione - metilazione - ubiquitinilazione Modificazioni della cromatina influiscono sull’espressione genica Le principali sono metilazione e acetilazione a) La cromatina trascrizionalmente attiva è iperacetilata b) Geni silenziati sono deacetilati e presentano metilazione delle citosine Repressori trascrizionali interagiscono con l’istone deacetilasi (HDAC) Attivatori trascrizionali reclutano l’istone acetil-transferasi (HAT) HAT acetila l’amminoterminale della coda degli istoni… HAT aC …Il nucleosoma si rimodella, la cromatina si decondensa e la trascrizione si attiva ac TF CA ac ac TF CA HDAC deacetila la coda degli istoni… HDAC ac ac TF ac CA TF CA …la cromatina si ricondensa e la trascrizione viene repressa TF CA TF CA Modificazioni degli istoni Metilazione degli Istoni IN GENERALE Repressori trascrizionali interagiscono con l’istone deacetilasi (HDAC) il legame di repressori e dell’HDAC a promotori è correlato con la deacetilazione dell’istone Attivatori trascrizionali reclutano l’istone acetil-transferasi (HAT) il legame di proteine attivatrici dell’HAT a promotori è correlato con l’ acetilatazione della cromatina Meccanismi 1. modificazioni degli istoni: 2. metilazione del DNA - acetilazione - fosforilazione - metilazione - ubiquitinilazione Metilazione del DNA Nell’uomo, circa 1% delle C sono metilate nella sequenza CpG Protruding in the major groove: -displacements of TFs -attracts Methyl-Binding Proteins Metilazione del DNA CITOSINA Circa il 60% dei geni umani hanno isole CpG al 5’ Le C nelle isole CpG non sono metilate, né nei tessuti in cui il gene è espresso, né nei tessuti in cui il gene è silente Ruolo della metilazione del DNA Come tutti i fenomeni epigenetici la metilazione del DNA viene ereditata alla divisione cellulare e trasmessa stabilmente alle cellule figlie: DNA methyl transferasi (DNMT1) metilano la nuova elica in corrispondenza delle mC sull’elica vecchia: DNMT1" Il gene Dnmt1 e’ essenziale: promotori diversi mantenimento de novo methylation diversi prodotti genici in cell. germ. maschili cell. germ. femminili embrioni “precoci” Il KO del gene Dnmt1 causa demetilazione e letalità embrionale Metilazione del DNA La metilazione del DNA reprime la trascrizione: - Impedendo il legame dei fattori trascrizionali - reclutando Methyl-Binding Proteins (es. MeCP2) che a loro volta reclutano HDACs Inattivazione del cromosoma X Karen Ng, Dieter Pullirsch, Martin Leeb & Anton Wutz EMBO rep aug 2007 Come si inattiva l’X L’inattivazione random di un X prevede innanzitutto che i cromosomi X siano contati. Ciò dipende dalla regione Xic (X inactivation center), che contiene il gene Xist. All’appaiamento dei cromosomi, quindi delle due Xic, segue la trascrizione di Xist solo su uno dei due, quello che verrà inattivato. Il gene XIST produce un RNA non codificante che lega lo stesso cromosoma che lo ha prodotto e ne determina un cambiamento di conformazione della cromatina (reclutamento di DNA metiltransferasi, deacetilasi, etc) i geni sono cosi silenziati. Il silenziamento non è totale: circa il 15% dei geni sull’X sfuggono all’inattivazione. L’inattivazione ad es. NON coinvolge i geni presenti nella regione telomerica Xp (segmento pseudoautosomico del cr.X) che è quella omologa al cr. Yp e che assicura il corretto appaiamento dei due cromosomi sessuali durante la meiosi maschile NB: l’inattivazione avviene in maniera casuale ma una volta stabilita viene mantenuta nel tempo Xist serve nella scelta del cromosoma da inattivare e ne determina il silenziamento, che implica un rimodellamento della cromatina a formare regioni eterocromatiche. DNA methylation Curr Opin Gen Dev Volume 17, Issue 5, October 2007, 1) Xist accumulates Polycomb repressor complex 1 (PRC1) mediates histone H2A lysine 119 ubiquitinylation (H2AK119ub1), and PRC2 mediates histone H3 lysine 27 tri-methylation (H3K27me3). -Initially X inactivation is reversible and genes become reactivated if Xist is lost. 3) Later during the XCI process DNA cytosine methylation marks the promoters of genes on the Xi. In this phase X inactivation is irreversible 2) Xist spreading along the chromosome in cis. Xist RNA (red) and protein factors postulated to bind Xist (orange) are shown. Xist spreading along the chromosome by means of 'way stations or 'boosters'. state In estrema sintesi Le modificazioni principali della cromatina sono: metilazione del DNA e acetilazione degli istoni La cromatina trascrizionalmente attiva è iperacetilata e demetilata I geni silenziati sono deacetilati e presentano metilazione delle citosine L’espressione genica può essere controllata a molteplici livelli: • trascrizionale • posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione The liver originates from the definitive endoderm lining the developing gut heart liver pancreas hindgut > At the end of gastrulation endodermal cells are pluripotent cells,giving rise to multiple differentiated organs: thyroid, lung, liver,pancreas, stomach … Both induction and restriction contribute to hepatic determination endoderm ectoderm cardiac mesoderm mesoderm + alb. - > ectoderm and dorsal mesoderm inhibit hepatogenesis > Candidates as positive and negative signals are ECM and growth factors: - FGF1, 2 and 8 are hepatogenic signals, - negative signals from dorsal tissues ? Liver development" Heart" Endoderm" Septum" transversum" Liver" Gut" Mouse: e9" Human: e27" Liver development" centro-lobular vein" liver" (hepatoblasts)" sinusoids" hepatocytes" sinusoids" endoderm" bile canaliculus" duodenum" hepatic artery" portal vein" e9" bile duct" birth" Endoderm" Hepatocyte" Cords" Cholangiocyte" Ducts" Hepatoblast" Metabolic" function" Bile" transport" HYPOTETHICAL HIERARCHY OF TRANSCRIPTION FACTORS CONTROLLING LIVER DEVELOPMENT HNF3β, GATA4 Hex vHNF1 HNF4α HNF6 Gastrulation competency Foregut endoderm Specification and activation of liver-specific genes Formation of liver bud Hlx, c-jun Proliferation and migration HNF1 Organogenesis C/EBPα Mature liver functions Early liver CONTROLLO COMBINATORIALE DURANTE LO SVILUPPO ESEMPI DI MODALITà DI REGOLAZIONE DEI REGOLATORI TRASCRIZIONALI 5 modi di reprimere INOLTRE: L’istone acetil-transferasi e l’istone deacetilasi possono modificare alcuni fattori trascrizionali alterandone il legame al DNA e l’attività trascrizionale Gli istoni sono soggetti ad altre modificazioni post-traduzionali all’N-terminale ( metilazione, fosforilazione e ubiquitinazione ) che sembrano essere coinvolte nella regolazione epigenetica della trascrizione LA REGOLAZIONE ABERRANTE DELL’ESPRESSIONE GENICA E’ UNA CARATTERISTICA COMUNE DI ALCUNE FORME DI CANCRO Nella leucemia proteine di fusione chimeriche generate da traslocazioni cromosomiche alterano la normale regolazione genica favorendo modificazioni della cromatina Esempio: PML-RARalfa e AML1-ETO generate da t(8;21) reclutano in modo aberrante l’HDAC che causa la repressione di geni generalmente attivi coinvolti nel differenziamento Nel cancro metastatico della prostata l’overespressione di proteine modificanti gli istoni genera una repressione genica alterata Esempio: EZH2 SET metila gli istoni inibendo l’espressione genica Specifiche regioni nel genoma delle cellule tumorali sono frequentemente ipermetilate, ciò causa il silenziamento di oncosoppressori Esempio: INK4A Quindi :Approcci farmacologici che modificano il controllo epigenetico e favoriscono il superamento del blocco differenziativo delle cellule tumorali Lezione 15-17-regolazione genica in eucaroti 23-05-12 CLA 28-05-2014 EPIGENETICA modificazioni dell’attività genica che non comportano alterazioni della sequenza del DNA, sono ereditabili e riprogrammabili Cromatina e DNA Regolazione della trascrizione Mediata dalla interazione tra elementi • in CIS: sequenze specifiche nel promotore/ operatore • In Trans : proteine con ruolo attivatorio o repressorio • I regolatori spesso formano dimeri/tetrameri • (omo ed etero) Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione SPLICING ALTERNATIVO fibronectina SR • un singolo gene può codificare per due o più proteine simili • la presenza sul pre-mRNA di particolari sequenze riconosciute da proteine regolatrici determina quali introni vengono rimossi Perché lo splicing alternativo ? • Più proteine da un unico gene • Proteoma più complesso del genoma • Circa il 50% dei pre-mRNA umani viene sottoposto a splicing alternativo Quale sono gli effetti dello splicing alternativo ? Proviamo ad immaginarli….. Rapporto gene fenotipo • Come si è evoluta la vostra visione ( e quella di noi tutti) nel corsodel tempo? Determinazione del sesso in drosofila Un caso estremo di splicing alternativo gene DSCAM Drosofila per i recettori che guidano gli assoni durante lo sviluppo del sistema nervoso Il processamento dell’ mRNA è accoppiato alla trascrizione Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione Controllo della stabilità • la quantità di un mRNA dipende dall’equilibrio tra velocità di trascrizione e velocità di degradazione • l’emivita di un mRNA dipende dalla sequenza, struttura secondaria e lunghezza coda poliA • l’emivita di un dato mRNA può essere regolata in risposta ad uno stimolo Perché controllare la stabilità degli mRNA ? “fine tuning” ( controllo fine della regolazione) • Permette rapidi cambiamenti del livello dell’mRNA Controllo stabilità mediato dalla deadenilazione DUE MECCANISMI DI DECADIMENTO DELL’RNA COMPETIZIONE TRA TRADUZIONE E DEGRADAZIONE Degradazione mediata da specifiche nucleasi In epatociti di Xenopus laevis,PMR1 taglia l’ mRNA della vitellogenina. La vigilina, che lega lo stesso sito protegge l’mRNA • I miRNAs : microRNA (23 basi) • geni che li codificano • Biogenesi • funzione micro RNA (miRNA) Scoperti negli animali e nelle piante Regolatori post-trascrizionali dell’espressione genica Diversa biogenesi e meccanismo d’azione tra piante e animali Caratteristiche dei miRNA degli animali Si appaiano tutti sul 3’UTR dei geni bersaglio Determinano un blocco traduzionale del messaggero bersaglio Non si appaiano completamente al bersaglio I primi 7 nucleotidi (seed) si appaiano completamente al bersaglio Caratteristiche dei miRNA nelle piante Si appaiano completamente al bersaglio Si appaiano principalmente sulla parte codificante dei geni bersaglio Determinano degradazione del messaggero bersaglio Genomica dei miRNA Sono stati identificati più di 4000 miRNA in piante, animali Nell’uomo ci sono circa 800 miRNA identificati Ne sono stati predetti per l’uomo 1000 Ogni miRNA può controllare migliaia di mRNA bersaglio! Genomica dei miRNA Più del 50% si trovano spesso raggruppati (cluster) e possono perciò essere trascritti come singola unità trascrizionale (policistronici) Possono essere trascritti da promotori propri La trascrizione dei miRNA è mediata da una RNA polymerase II, infatti I trascritti presentano un CAP al 5’ e una coda al 3’ poliadenilata Genomica dei miRNA Il 70% dei miRNA si trovano in unità trascrizionali (TU) Esoni di ncRNA Introni di ncRNA Introni di mRNA Biogenesi e funzione miRNA e siRNA: geni specifici codificano per precursori che formano un’ansa e che vengono processati per dare origine a piccoli dsRNA . Vengono processati. Controllano altri geni in modo specifico miRNA: sono estremamente conservati e inibiscono la traduzione di specifici messaggeri miRNA mechanisms of action Sometimes in mammals, always in plants…… IL MODELLO OGGI PIù ACCREDITATO è QUESTO: PER IL QUALE è FONDAMENTALE L’INTERAZIONE DI AGO CON GW182 LA QUALE è CAPACE DI RICHIAMARE I COMPLESSI DI DECAPPING E DEADENILAZIONE E DETERMINARE QUINDI LA DEGRADAZIONE DEL MESSAGGERO TRANSPOSONS aberrant ? VIRUS RdRP 5’ 5’ 3’ Silenziamento posttrascrizionale mediato da piccoli RNA 3’ dsRNA 3’ 5’ Dicer RISC cleavage cap polyA RISC INTERFERENZA DA RNA Biotecnologia Una deregolazione dei miRNA può portare a conseguenze catastrofiche nei processi di sviluppo e differenziamento così come pure essere vantaggiosa ad una cellula tumorale miRNA e Cancro Ci possono essere sia miRNA come oncogeni che come soppressori tumorali Mutazioni nella sequenza del miRNA o nelle componenti del macchinario di processamento Es. miR-15a e miR-16-1 regolano la proteina BCL2 (antiapoptotico) Nel 50% leucemie linfocitiche croniche (CLL) presentano una delezione nella regione dove sono allocati questi miRNA (le cellule acquisiscono resistenza all’apoptosi) miR-125a e miR-125b regolano due recettori tirosina kinase Le cellule del tumore alla mammella acquisiscono tramite l’abbassamento dell’espressione dei miR maggiori capacità invasive e di ancoraggio miRNA e Cancro Il 50% dei miRNA conosciuti si trovano in siti ricorrenti a delezioni o amplificazioni in vari tipi di cancro miRNA e Cancro Carlo Croce ha messo a punto la tecnologia dei microarray contenenti tutti i miRNA umani conosciuti come strumento diagnostico per monitorare I vari tipi di tumori in base al profilo di espressione di miRNA tipici per quella classe tumorale (signature) miRNA e Cancro Terapie in sperimentazione Utilizzo di miRNA sintetici da utilizzare nel caso di cancro dovuto a delezione dei miRNA Utilizzo di LNA o antagomir, inibitori dei miRNA nei casi di tumori correlati a overesspressioni dei miRNA Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione NMD (nonsense-mediated mRNA decay) Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione Regolazione posttrascrizionale • Processamento • Stabilità • Controllo qualità • Traduzione Perché regolare la traduzione ? 1. “fine tuning” controllo fine della regolazione 2. Velocità 3. Controllo “spaziale” dell’ espressione Due modalità di controllo della traduzione 1. REGOLAZIONE GLOBALE 2. CONTROLLO mRNA specifico Controllo generale (non gene specifico) della traduzionale basato sulla fosforilazione del fattore di inizio elF-2 PKR Elementi che influenzano in positivo o in negativo la traduzione di un mRNA • La struttura m7GpppN CAP al 5’ • La coda poly(A) al 3′ • Strutture secondarie e terziarie • uORFs (upstream open reading frames) • Il legame di proteine • Internal ribosome entry sequences (IRESs) mediano la traduzione cap-indipendente Geni TOP (Terminal OligoPyrimidine tract) • • • • • 80 proteine ribosomali EF-1α, EF-1β, EF-1γ, EF-2 • • Nucleolina PABP Proteina di fusione rp/ubiquitinaProteina di fusione rp/ubiquitina80aa • • • • • Proteina tumorale controllata Fosfoproteina nucleolare B 23 Proteina da 23 kDa altamente basica • • Proteina che lega l'ubiquinone Nucleoside di fosfato chinasi B Proteina 12.3 simile alla sub. β delle proteine G 52 aa • hnRNP A1 Proteina che lega la laminina Proteina associata ai piccoli RNA di EBV • Subunità C della ATP sintasi (forma P2) 5’UTR rpL6 rpL7 rpL8 rpL9 rpL10 rpL10A rpL11 rpL13A rpL14 rpS2 rpS3 rpS3A rpS4X rpS4Y rpS6 rpS8 rpS10 rpS11 rpS13 rpS14 CUCUUUCCCAUCUUGCAAGAUG CCUCUUUUUCCGGCUGGAACCAUG CUCUUUCGGCCGCGCUGUGAACAGGACCCGUCGCCAUG CUUUCUUUGCUGCGUCUACUGCGAGAAUG CUCUUUCCCUUCGGUGUGCCACUGAAGAUCCUGGUGUCGCCAUG CUCUUUUCCGGUUAGCGCGGCGUGAGAAGCCAUG CUCUUCCUGCUCUCCAUCAUG CUCCUUUUCCAAGCGGCUGCCGAAGAUG CUUCUCGCCUAACGCCGCCAACAUG CUUCUUUUCCGACAAAACACCAAAUG CCUUUCCUUUCAGCGGAGCGCGGCGGCAAGAUG CCCUUUUGGCUCUCUGACCAGCACCAUG CCUCUUUCCUUGCCUAACGCAGCCAUG CUCUUCGUCGCAGAGUUUCGCCAUG CUCUUUUCCGUGGCGCCUCGGAGGCGUUCAGCUGCUUCAAGAUG CUCUUUCCAGCCAGCGCCGAGCGAUG CUUCCUUUCCAGCCCCGGUACCGGACCCUCAGCCGCAGAGAUG CUUUCUUUUUUUCAGGCGGCCGGGAAGAUG CUCCUUUCGUUGCCUGAUCGCCGCCAUCAUG CUCUUUCCGGUGUGGAGUCUGGAGACGACGUGCAGAAAUG Controllo traduzionale dei TOP mRNA Cellule in crescita AAA AAA AAA Cellule in quiescenza AA AA AA AA AA 80S polisomi AAA mRNP polisomi mRNA TOP tradotto (associato ai polisomi)) AAA AA mRNA TOP non tradotto (associato alle mRNP) mRNP • La ferritina è una proteina citoplasmatica che lega il ferro proteggendo la cellula dagli effetti tossici del metallo libero • l’mRNA della ferritina viene tradotto solo se c’ è ferro libero • velocità di adattamento RNA non codificanti (ncRNA) già noti RNA ribosomiali (rRNA) strutturali RNA transfer (tRNA) strutturali Piccoli RNA nucleari (snRNA) Piccoli RNA nucleolari (snoRNA) Splicing dell’mRNA Modificazione dell’rRNA Ruolo nella struttura della cromatina XIST (X(inactive)-specific transcript) Inattivazione del cromosoma X Small non-coding RNA miRNA Micro RNA – regolazione post-trascrizionale di numerosi geni siRNA Small interfering RNA – legano RNA complementari determinandone la degradazione piRNA Piwi-interacting RNA – controllo di trasposoni nella linea germinale degli animali natsiRNA Natural antisense transcript derived siRNA - regolazione post-trascrizionale di geni durante stress biotici e abiotici tasiRNA Trans-acting siRNA – regolazione post-trascrizionale di geni di piante I miRNA sono solo la punta di un iceberg di cui si sta venendo a conoscenza con lo studio di altri ncRNA e della genomica funzionale ncRNA e Transcrittomica Sebbene solo l’1.5% del genoma umano codifica per proteine, molto invece viene comunque trascritto La stima su dati già presenti in letteratura annotava 140.000 trascritti nell’uomo Analizzando invece 10 cromosomi umani troviamo che il 10% del genoma comprendente questi cromosomi viene trascritto L’ultimo grande progetto di trascrittomica completato (FANTOM3 2005) in topo rivela che il 63 % del genoma del topo viene trascritto (sia da un filamento che da entrambi), con più di 180.000 trascritti la metà dei quali sono RNA non codificanti (ncRNA) È chiaro quindi che negli organismi complessi un importante ruolo spetta a questi ncRNA, agendo molto probabilmente come regolatori dell’espressione genica (i livelli di espressione non sono alti), come pure a splicing alternativo, RNA editing, rimodellamento della cromatina etc. Geni che non codificano per proteine? Il cosiddetto "dogma centrale della biologia molecolare", enunciato da Francis Crick nel 1957 prevede che l'informazione fluisca dagli acidi nucleici alle proteine e non viceversa Nel metodo scientifico non possono esistere dogmi! Regolazione genica in Eucarioti Multistep Epigenetica Trascrizionale Splicing alternativo Stabilita e traducibilità: miRNAs Traduzionale Posttraduzionale Concludo qui il mio 14esimo anno di insegnamento al Sant’Andrea augurandomi di esservi stato utile ed augurandovi Buono studio Modificazioni dell’istone H3 L’ipotesi del “codice istonico” Diverse modificazioni agiscono in varie combinazioni per formare un “codice” MECCANISMO D’AZIONE DELL’ACIDO RETINOICO Co-Activators Cromatina trascrizionalmente repressa Cromatina trascrizionalmente attiva miRNA Biogenesis Mammalian miRNAs are located in Pol-II transcription units miRNAs are produced as a distinct species from a specific precursor that is encoded in the genome. Expected to represent ~1% of predicted genes (Lim et al., 2003) Regolazione dell’espresione genica mediata da piccoli RNA PIWI Alcuni miRNA sono altamente conservati negli animali Esempi di ncRNA 70 ncRNA parzialmente caratterizzati nell’uomo Xist e inattivazione del cromosoma X (rimodellamento della cromatina)
