Associazione tra malattie autoimmuni e patologie infiammatorie

Dottorato in Medicina Sperimentale Curriculum Medicina Traslazionale AA 2015/2016-XXXI CICLO
Presso il Dipartimento di Scienze e Biotecnologie Medico-Chirurgiche, Polo Pontino;
Dottoranda: Serena Fragiotta n. matricola 945541, e-mail: [email protected]
Tutor: Prof Enzo Maria Vingolo
Associazione tra malattie autoimmuni e patologie infiammatorie oftalmiche
Studi di immunopatogenesi.
Introduzione
La psoriasi è una malattia autoimmune caratterizzata da un upregulation dei patterns citochinici Th1
e Th17. Inoltre, è stata dimostrata la presenza di un danno microvascolare, che sembra essere
implicata nella patogenesi non solo delle patologie cardiovascolari ma anche della demenza su base
vascolare e dell’insufficienza renale progressiva. Pertanto la psoriasi può essere considerata un utile
modello di studio sia da un punto di vista autoimmune-infiammatorio che cardiovascolare.
L’infiammazione in corso di malattia interessa diversi distretti corporei, tra cui quello oculare.
L’incremento delle citochine circolanti sembra essere correlato ai parametri della funzione visiva
(sensibilità maculare e fissazione retinica), inoltre è stato dimostrato che il calibro retinico vascolare
è direttamente influenzato dall’infiammazione sistemica. Queste alterazioni, specie a livello
vascolare, sono probabilmente alla base delle complicanze a livello oculare.
Scopi:
a) Identificare la risposta proinfiammatoria nel modello psoriasi, con particolare attenzione
all’analisi delle microvescicole circolanti e risposta alla terapia con anticorpo monoclonale
inibente IL-17A.
b) Esaminare in pazienti affetti da psoriasi moderata-severa, la relazione tra i parametri
vascolari su modello retinico umano (e.g. calibro retinico vascolare e spessore coroideale) e
i fattori immunologici di danno microvascolare, in particolare i markers d’infiammazione e
di disfunzione endoteliale;
c) Combinare i risultati ottenuti a seguito di terapia immunomodulatoria in ambito clinico e
molecolare;
Materiali e Metodi:
Per la prima parte dello studio sono stati utilizzati modelli di cheratinociti umani immortalizzati
HaCaT, opportunamente stimolati con IL-17 e successivamente esposti ad anticorpo monoclonale
Secukinumab.
In seguito, verranno inclusi pazienti affetti da psoriasi a placche da moderata a severa (PASI score
minimo di 10). I criteri di inclusione comprendono un BMI normale tra 18.4-24.9, emoglobina
glicosilata ≤ 6.0%, normolipidemia, astinenza da alcool e tabacco; Verranno esclusi pazienti trattati
con precedenti terapie immunomodulatorie; patologie sistemiche degni di nota; pazienti affetti da
TBC manifesta o latente; gravidanza o allattamento; utilizzo di altre terapie antinfiammatorie o
corticosteroidee nei 3 mesi precedenti; altre patologie oculari di rilievo clinico.
I pazienti verranno inizialmente selezionati da un dermatologo esperto di malattia psoriasica. Una
volta arruolati verranno sottoposti a valutazione oftalmologica con foto del fondo oculare e studio
del calibro vascolare, studio con tomografia a coerenza ottica per l’analisi degli strati vascolari
profondi e studio con microperimetria per valutazione oggettiva della funzionalità retinica. Il
prelievo venoso verrà analizzato espressione citochinica nelle sottopopolazioni linfocitarie T1/
Th17/Th22 testando IFN-γ, IL-17A e IL-23 in CCR6, IL-23A e/o CD161 nelle cellule CD4+ ; Il
profilo citochinico verrà eseguito anche nelle sottopopolazioni monocitarie sia CD14high/CD16che CD14+/CD16+, con particolare attenzione alle citochine pro-infiammatorie TH-17 come IL-1,
IL-6 e IL23. L’analisi verrà eseguita utilizzando una citometria a flusso multiparametrica. I markers
Dottorato in Medicina Sperimentale Curriculum Medicina Traslazionale AA 2015/2016-XXXI CICLO
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Dottoranda: Serena Fragiotta n. matricola 945541, e-mail: [email protected]
cellulari verranno marcati utilizzando anticorpi coniugati con fluorocromi, mentre l’espressione
citochinica verrà valutata utilizzando il Quantigene FlowRNA assay. Inoltre, il plasma verra’
ulteriormente processato per l’isolamento del miRNA intero circolante utilizzando il miRCURY
RNA isolation. In alternativa verrano sottoposti a procedura di centrifugazione sequenziale standard
per l’isolamento delle microvescicole (e.g. ectosomi ed esosomi). In entrambi i casi il materiale sarà
analizzato usando RT-PCR array miRNA comprendente i miRNA già caratterizzati coinvolti nelle
vie infiammatorie- autoimmuni, così come nell’ induzione della senescenza.
Risultati preliminari:
Abbiamo concluso una prima parte dell’analisi di laboratorio che prevedeva l’utilizzo di
cheratinociti umani immortalizzati HaCaT. Tale linea cellulare veniva inizialmente stimolata
utilizzando IL-17.
Dopo induzione con IL-17 è stato osservata un’esagerata induzione della beta2-defensina umana (x
200 volte i valori basali). E’ stata osservata anche un upregolazione di CCL20 mRNA a 24 ore e in
una maniera dose-dipendente. Inoltre, risultava aumentata l’espressione mRNA delle chemochine
proinfiammatorie CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, e CCL6 (x 60 circa i valori basali).
L’induzione della beta2-defensina umana, osservata per circa 72 ore dall’esposizione con IL-17,
mostrava un’incremento costante senza raggiungere valori plateau.
A seguito dell’esposizione dell’ anticorpo monoclonale Secukinumab si è osservata una
downregolazione completa in grado di riportare tali chemochine ai livelli basali pre-stimolazione.
La quantificazione microvescicolare ha fornito ulteriori interessanti risultati. Se da un lato è stato
osservato che dopo stimolazione con IL-17 la quantità di microvescicole prodotte sia
numericamente inferiore, d’altra parte tali microvescicole sembrano contenere un numero più
elevato di messaggeri. Tali microvescicole, riscontrare anche a livello di altri tipi cellulari,
potrebbero far presagire un possibile meccanismo alla base della diffusione di malattia a zone
cutanee contigue. Tale riscontro andrà comunque approfondito con successive analisi.
Docente guida: Prof. Enzo Maria Vingolo
Dottoranda: Serena Fragiotta
Dottorato in Medicina Sperimentale Curriculum Medicina Traslazionale AA 2015/2016-XXXI CICLO
Presso il Dipartimento di Scienze e Biotecnologie Medico-Chirurgiche, Polo Pontino;
Dottoranda: Serena Fragiotta n. matricola 945541, e-mail: [email protected]
Elenco pubblicazioni 2015-2016:
1. Vingolo EM, Messano GA, Fragiotta S, Spadea L, Petti S. “Ocular Manifestations of Ebola
Virus Disease: An Ophthalmologist’s Guide to Prevent Infection and Panic,” Biomed Res
Int. 2015;2015:487073. doi: 10.1155/2015/487073.
2. Grenga PL, Fragiotta S, Cutini A, Meduri A, Vingolo EM. Enhanced depth imaging optical
coherence tomography in adult-onset foveomacular vitelliform dystrophy. Eur J
Ophthalmol. 2016;26:145-151. doi: 10.5301/ejo.5000687.
3. Vingolo EM, Fragiotta S, Domanico D, Limoli PG, Nebbioso M, Spadea L. Visual
Recovery after Primary Retinal Detachment Surgery: Biofeedback Rehabilitative Strategy. J
Ophthalmol. 2016;2016:8092396. doi: 10.1155/2016/8092396.
4. Vingolo EM, Carnevale C, Fragiotta S, Rigoni E, Iacobelli L. Visual Outcomes and Contrast
Sensitivity after Bilateral Implantation of Multifocal Intraocular Lenses with +2.50 or +3.0
Diopter Addition: 12-Month Follow-Up. Semin Ophthalmol. 2016 Apr 29:0. [Epub ahead of
print]
5. Vingolo EM, Fragiotta S, Mafrici M, Cutini A, Marinelli C, Concistre’ A, Iannucci G,
Petramala L, Letizia C. Vitreous and plasma changes of endothelin-1, adrenomedullin and
vascular endothelium growth factor in patients with proliferative diabetic retinopathy. Eur
Rev Med Pharmacol Sci 2016; Accepted #5464