Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione
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Seminario Seminario per per ilil corso corso “misure “misure con con biomarcatori” biomarcatori” A.A. A.A. 2005-2006 2005-2006 Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress Silvia Franzellitti ESITE ESITE UNA UNA GERARCHIA GERARCHIA DELLA DELLA RISPOSTA RISPOSTA ALLO ALLO STRESS AMBIENTALE AMBIENTALE Ecosystem STRESS tempo Relevance to Ecosystem ‘Health’ Perché utilizzare lo studio dell’alterazione dell’espressione genica nella tossicologia ambientale? Community Population Individual M STI OLO NUCLEO NUCLEO promotore gene RNA polimerasi Cell TRASCRIZIONE Organelle mRNA Molecular AAAA trasporto trasporto Dose/Concentration mRNA Le modificazioni a livello molecolare rappresentano il primo stadio, estremamente precoce, della serie di eventi che governano i meccanismi di risposta. AAAA TRADUZIONE proteina proteina RISPOSTA S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 1 Metodi per lo studio dell’espressione genica Basati sull’ibridazione degli acidi nucleici Basati sulla PCR (Reazione a catena della DNA polimerasi) Southern/Northern blotting Ibridazione in situ Microarray a DNA/cDNA RT-PCR PCR semi-quantitativa PCR real-time S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress Ibridazione A-T G-C S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 2 TECNOLOGIA DEL MICROARRAY CHIP GENICI Supporti in vetro su cui sono collocati in posizioni definite dei frammenti di DNA. Ogni posizione (spot) rappresenta un singolo gene. Ogni vetrino può contenere svariate migliaia di spot S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress Preparazione dei microarray (spottaggio) Preparazione dei campioni controllo Acquisizione e analisi delle immagini trattato Isolamento dell’mRNA AAA AAA AAA AAA Retrotrascrizione e marcatura dei cDNA AAA Cy3Cy3-dCTP AAA Cy5Cy5-dCTP ibridazione S. Franzellitti - Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress 3 Mytox-chip Un microarray per studiare la risposta allo stress in M. galloprovincialis 2 SOTTO-ARRAYS con 50 oligonucleotidi spottati su un supporto in vetro “attivato” di dimensioni 26 mm x 76 mm I 50 oligonucleotidi rappresentano i 25 geni: 2 spots diversi per ogni gene in esame S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 2+ (750 nM) Hg2+ NSO (0.5ppm) S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 4 Applicazione Applicazione del del mytox-chip mytox-chip al al biomonitoraggio biomonitoraggio del del Visnes Visnes fjord fjord (Norvergia) (Norvergia) Stabilità delle membrane lisosomiali Rapporto volume lisosoma/citoplasma Accumulo lipidi neutri Accumulo lipofuscine S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress DAI DATI DEL MICROARRAY…. Messa a punto quantitativa risposta allo mediante di metodiche di PCR per studiare la stress ambientale GENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALI S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 5 I METODI BASATI SULLA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR) Estensione Permette l’amplificazione selettiva di singoli tratti genici, cioè la produzione in vitro di un elevato numero di copie di una specifica sequenza di DNA. La PCR si basa sulle proprietà dell’enzima DNA polimerasi di ripetere in vitro ciò che accade normalmente in vivo durante il processo di duplicazione del DNA, ossia la sintesi di nuovi filamenti complementari ad un filamento stampo, e sulla possibilità di mirare tale sintesi ad uno specifico tratto di DNA scegliendo opportunamente gli inneschi o primer. I primers sono oligonucleotidi sintetici lunghi 10-30 pb, complementari alle regioni fiancheggianti il frammento genico da amplificare. Appaiandosi a tali regioni, i primer costituiscono un piccolo tratto di DNA a doppia catena, dal quale la DNA polimerasi può iniziare la sintesi, ossia formazione di legami fosfodiesterici tra l'estremità 3' del segmento iniziatore e il dNTP complementare allo stampo. LA PCR SEMI-QUANTITATIVA [amplificato] [amplificato] la quantità di un determinato target prodotto dalla duplicazione in vitro è esponenzialmente proporzionale alla quantità di cDNA inizialmente presente Elettroforesi n° n° cicli cicli di di PCR PCR C 1 2 3 HSP70 HSC70 18s rRNA Analisi d’immagine S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 6 °C 35 h 1 ** fold induction H sh eat oc ke d tr ol Hsp 77 Hsp 72 Hsp 69 3,0 2,5 Co n M ar ke r Le Hsp70 e la risposta allo stress termico 2,0 * 1,5 HSP70 1,0 HSC70 0,5 0 10 5 20 25 time of recovery (hour) S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress LA RISPOSTA AI METALLI PESANTI 4,0 3,5 HSC70 * L’espressione dei geni HSP70 è modulata durante l’esposizione a Hg2+ fold induction 3,0 2,5 * 2,0 * 1,5 1,0 HSP70 ** 0,5 0,0 0 1 2 3 4 5 6 35000 time of exposure (days) I geni MT sono differentemente regolati dall’esposizione a Hg2+ n° molecole 30000 25000 20000 15000 10000 5000 MT10 MT20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 tempo di esposizione a Hg (giorni) S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 7 rapporto d'induzione ABC transporter 8 Pgp * 6 4 2 0 rapporto d'induzione ctr 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 24h * Mrp2 Mrp2 * Hg2+ ctr 24h CH3Hg+ S. S. Franzellitti Franzellitti -- Il Il biomonitoraggio biomonitoraggio ambientale ambientale attraverso attraverso lo lo studio studio della della regolazione regolazione genica genica della della risposta risposta allo allo stress stress 8
