8- interfaccia neur..

Capitolo 5
Interfacciamento neuroelettronico
Capitolo 5:
Interfacciamento neuroelettronico
5.1 I primi esperimenti
Il cervello e il calcolatore “lavorano” entrambi elettricamente; l’idea di provare ad
interfacciare direttamente i due sistemi è una sfida intellettuale e allo stesso tempo
tecnologica.
Allo stadio attuale delle nostre conoscenze teoriche e della nostra tecnologia non siamo in
grado di stabilire che cosa ci riservi il prossimo futuro, se dovremmo aspettarci tessuti
cerebrali integrati nei computer oppure chip integrati direttamente nel nostro cervello. Una
cosa però è certa: qualunque siano le ricerche svolte in questo campo, ci aiuteranno a capire
meglio l’architettura del cervello e porteranno ad uno sviluppo di applicazioni mediche e
scientifiche fino ad ora impensate. Già dai primi anni novanta sono state condotte con
successo delle ricerche in tal senso, stabilendo per la prima volta un’interfaccia elettrica tra
cellule nervose e microstrutture semiconduttrici e viceversa. In particolare sono stati utilizzati
i neuroni delle sanguisughe, notoriamente grandi e quindi facili da manipolare, uniti a
transistor disposti su una piastra di silicio [Fro02].
Dopo questi primi, rudimentali, passi iniziali sono state seguite due precise direzioni:
1. “Verso il basso”, si è studiata la natura microscopica della giunzione neurone-silicio
rispettandone la struttura e le sue proprietà elettriche, al fine di descrivere in modo corretto
tale giunzione per ottimizzare l’interfaccia neuroelettronica.
2. “Verso l’alto”, si sono assemblati semplici sistemi ibridi che combinavano neuroni e reti
neurali con dispositivi microelettronici semiconduttori. Qui lo scopo è stata la supervisione di
numerosi neuroni in una rete definita da contatti non invasivi tra le cellule e il substrato
semiconduttore, e questo è necessario per lo studio di processi dinamici distribuiti come
l’apprendimento e la memoria.
Oltre alla giunzione dei neuroni con il silicio e di tutte le sue implicazioni, sono stati svolti
anche molti altri esperimenti differenti per scopo e natura.
Nel 1999 sono stati condotti dal professor William Ditto e dai suoi collaboratori, presso
l’università di Atlanta (Georgia), alcuni esperimenti volti a creare delle semplici computazioni
attraverso i neuroni di sanguisughe. L’esperimento consisteva nel collegare due neuroni tra di
loro ed entrambi ad un computer in grado di inviare dei segnali in modo selettivo ad ognuno
di essi. Ditto è stato in grado di far compiere ai due neuroni una semplice addizione. In realtà,
delle simulazioni al computer hanno mostrato come grandi gruppi di neuroni siano in grado di
compiere moltiplicazioni e operazioni logiche. Le porte aperte da Ditto sono estremamente
affascinanti perché ci si prospetta un futuro in cui i biocomputer saranno in grado di trovare
da soli, senza l’aiuto di nessun programmatore, le soluzioni adatte ai vari problemi e forse di
sostituire in certi campi addirittura l’uomo. Queste ricerche si spingono in due direzioni:
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1. Venire in aiuto di chi soffre di problemi neurologici cronici e degenerativi, come epilessia e
morbo di Parkinson, Alzaimer e quant’altro.
2. Venire in aiuto di chi ha perso il controllo delle funzioni motorie, ad esempio conseguenze
di un ictus.
L’obiettivo finale è quello di usare soluzioni elettroniche per aggirare il danno inflitto a certe
porzioni del cervello e permettere agli impulsi neurali di arrivare comunque a stimolare un
muscolo oppure un braccio meccanico.
E’ stato utilizzato un sistema di elettrodi inseriti nel cervello che hanno permesso di tradurre
in istruzioni per calcolatori i segnali elettrici trasmessi dalle cellule neurali responsabili delle
funzioni cognitive. Questi esperimenti hanno avuto l’obiettivo a breve termine di stabilire la
possibilità di una linea di comunicazione con pazienti colpiti da paralisi totale.
Solo di recente i ricercatori hanno aperto la strada alla messa a punto di congegni in grado di
far svolgere a questi stessi pazienti semplici compiti di routine come accendere e spegnere la
luce. Sono infatti riusciti a dimostrare che è possibile interpretare i messaggi neurali emessi
dal cervello di una scimmia da laboratorio e usarli per controllare un braccio robotico
connesso ad un computer.
Inoltre, un altro gruppo di ricercatori ha condotto degli esperimenti sulle “reti neurali
coltivate”. Il loro scopo è stato quello di capire le correlazioni morfologiche
dell’apprendimento e della memoria utilizzando sistemi di neuroni coltivati su di un substrato
di silicio.
I neuroni utilizzati vengono prelevati dall’ippocampo dei topi e vengono fatti crescere sulla
piastrina: essi formano rapidamente delle sinapsi e sviluppano spontaneamente complessi
schemi di connessione.
figura 1 :Cellule nervose di un topo coltivate su di un chip
Stimolando gruppi di neuroni con vari schemi di “potenziali d’azione simulati” si spera di
osservare dei cambiamenti morfologici nelle reti di neuroni così coltivate, che possono
indicare come i neuroni, nei cervelli viventi, cambiano per imparare qualcosa di nuovo.
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Questi segnali possono indurre cambiamenti nel numero o nella grandezza delle sinapsi, nella
crescita dendritica, nella formazione di spine dendritiche o nella interazione con le cellule
gliali.
Studiando i fenomeni base di come l’attività elettrica influenza la morfologia neuronale, e
come a sua volta questi cambiamenti influenzano le proprietà elettriche della rete stessa, si
potranno avere preziosi parametri per lo studio delle reti neurali artificiali su computer.
Questo permetterà di sviluppare sistemi di apprendimento artificiali che si avvantaggiano
dell’adattamento intelligente presente nei sistemi biologici.
Nel 2000 un team di ricercatori della Northwestern University di Chicago, dell’Università
dell’Illinois e dell’Università di Genova, hanno presentato il risultato delle loro ricerche: la
creazione di una strana creatura ibrida costituita da un corpo meccanico controllato dal
cervello di un pesce. Il robot possiede pochi neuroni prelevati dalla lampreda marina
Petromyzon marinus, un vertebrato primitivo simile alle anguille. Di fronte ad alcuni stimoli
luminosi il robot ha presentato diversi comportamenti: ha seguito la luce, ha evitato la luce, si
è messo a “camminare” in circolo. La ricerca originariamente avrebbe dovuto studiare gli
adattamenti delle cellule del cervello di fronte a degli stimoli che cambiano in continuazione,
tuttavia Mussa-Ivaldi [Mus00] [Re&Al], lo scienziato italiano che ha partecipato
all’esperimento, sostiene che capire come i neuroni comunichino con le macchine artificiali
porterà sicuramente i suoi benefici.
Nel 2002, un team di ricercatori guidati da Catherine Schmidt dell’Università di Austin
(Texas), è riuscito a posizionare un semiconduttore esattamente nel punto desiderato della
superficie di una cellula nervosa umana, fatto di fondamentale rilevanza visto che fino ad ora
le cellule nervose utilizzate erano solo quelle di topi, sanguisughe e lumache.
In conclusione è possibile affermare che la ricerca sull’interfaccia neurone-silicio sta
facendo passi da gigante al punto che risulta difficile dare una precisa catalogazione di tutti gli
esperimenti che sono stati fatti in questi ultimi anni, sia per scopo sia per natura.
Ad esempio l’esperimento condotto da Fromherz al Max Planck di Monaco, tra l’altro uno
dei pionieri in questo campo, pone la sua attenzione sugli aspetti prettamente fisici della
giunzione tra cellula e silicio, studiandone i comportamenti dal punto di vista elettrico e, di
sicuro, sarà la base per successivi e più complessi esperimenti, in cui si porrà soprattutto
l’attenzione sulle cellule stesse e sul loro comportamento, in particolare sulla loro
aggregazione e sulla possibilità di farle crescere secondo un determinato schema morfologico.
Tuttavia ci sono molti altri team di ricerca che stanno portando avanti ricerche analoghe a
quella di Fromherz, ma con scopi del tutto diversi: ad esempio le ricerche di Potter per cercare
di capire come gli aspetti morfologici del cervello possano influenzare l’apprendimento e la
memoria.
L’esperimento del Max Planck di Monaco
Nel 2002 Peter Fromherz, un neuroscienziato del Max Planck di Monaco, ha coltivato delle
cellule nervose su una piastrina da cui emergevano minuscoli elettrodi di silicio, rivestiti di un
polimero spugnoso: dopo qualche giorno le cellule nervose hanno stabilito rapporti tra loro,
proprio come avviene nel sistema nervoso, ma soprattutto hanno formato sinapsi con gli
elettrodi di silicio, formando una rete biologico-artificiale in cui i neuroni rispondevano ai
segnali elettrici degli elettrodi e questi ultimi ai segnali dei neuroni. L’elaborazione di reti
neurali “miste” potrebbe aprire nuove strade sia nel campo dell’informatica che in quello delle
protesi. Già oggi esiste un orecchio (coclea) elettronico che registra i suoni, li trasmette a
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minuscoli elettrodi che attivano il nervo cocleare di una persona affetta da sordità: negli
impianti effettuati con successo, il cervello deve rielaborare gli impulsi elettrici e interpretare
lo spettro dei suoni digitalizzati attribuendo loro un significato. Ciò dimostra, come nei
cyborg in via di studio, che le cellule nervose possono imparare a distinguere tra sequenze di
impulsi elettrici, vale a dire memorizzarle.
Questi esperimenti sembrano fatti apposta per indicare come le cellule nervose abbiano la
proprietà di interconnettersi, di interfacciarsi con materiali non biologici, di estrarre
informazioni da ambienti e realtà artificiali: in altre parole, i neuroni sono dotati della capacità
di associarsi in reti intelligenti e di interfacciarsi con circuiti artificiali purché questi siano in
grado di recepire i loro segnali e ritrasmetterli alla rete neurale.
5.2 Esperimenti più recenti
5.2.1 Interfacciare neuroni e chip di silicio [Fromherz03]
Una cellula nervosa (diametro di circa 20micrometri) è avvolta da una membrana composta
da un doppio strato lipidico elettricamente isolante. Questo bilayer lipidico separa l’ambiente
esterno con circa 150 mM di ioni sodio dall’ambiente intracellulare con circa 150 mM ioni
potassio. Le correnti attraverso la membrana, in entrambi i sensi, sono regolate da canali
ionici e da proteine di membrana che hanno il ruolo di trasportatori.
Per quanto concerne invece i chip di silicio possiamo dire che questo materiale è usato come
substrato conduttore elettrolico perché rivestito con un sottile strato di diossido di silicio
diventa un substrato perfettamente inerte per la coltivazione di neuroni. Questo sottile strato
di diossido di silicio evita la corrosione del silicio e il conseguente danneggiamento delle
cellule, in quanto blocca il trasferimento di elettroni. Inoltre il diossido di silicio è anche in
grado di proteggere le cellule da i nuovi microscopi elettronici che spesso entrano in contatto
diretto con il materiale vivente.
Inizialmente un accoppiamento diretto tra segnali ionici nei neuroni e segnali elettronici nel
semiconduttore può essere ottenuto con polarizzazione elettrica. Se il bilayer cellulare colpito
è direttamente in contatto con il layer di silicio colpito si formerà un compatto dielettrico (no
conduzione di elettricità) come mostra la Figura 1
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Figura 2a – 2b
Un campo elettrico attraverso la membrana cellulare, causato dall’attività neuronale,
polarizza il diossido di silicio così che la struttura elettronica del silicio è alterato come si nota
in Figura 2a.
Al contrario un campo elettrico tra lo strato di diossido di silicio, causato da un voltaggio
applicato al chip, polarizza la membrana in un modo da alterare le conformazioni dei canali
ionici e delle proteine di trasporto di membrana come mostra la Figura 2b.
Questo, come detto, accade se la membrana del neurone e lo strato di diossido di silicio sono
a stretto contatto. Ma se noi facciamo crescere un neurone su un chip non possiamo aspettarci
un compatto dielettrico perché le proteine che sporgono dalla membrana cellulare fanno si che
tra il bilayer e lo strato di silicio si crei uno spazio pieno di elettroliti come mostra la Figura
2c-d
Figura 2c - 2d
Lo spazio conduttore a questo punto scherma il campo elettrico e annulla la polarizzazione
del layer di silicio e della membrana cellulare.
La giunzione cellula-silicio a questo punto forma un conduttore planare core-coat : i coat del
layer di silicio e della membrana isolano il core dello spazio conduttore dall’ambiente
conduttore del silicio e del citosol.
Il primo passo per una interfaccia neuroelettronica è determinato dal flusso di corrente nel
conduttore core-coat .
L’attività di un neurone porta correnti ioniche e di spostamento (displacement) attraverso la
membrana cellulare come mostra la Figura 2c. La concomitante corrente lungo il core crea un
Potenziale Extracellulare Transdotto (TEP) tra la cellula e il chip.
Un voltaggio transiente applicato al silicio porta a correnti di spostamento attraverso il coat
ossido come mostra la Figura 2d.
Di nuovo un TEP appare tra chip e cellula dovuto alle correnti lungo lo spazio.
In un secondo step nell’interfacciamento, il TEP nel conduttore core-coat viene registrato da
strumenti voltaggio-sensibili nel chip o nella cellula:
 il TEP indotto dal neurone genera un campo elettrico nel diossido di silicio (Figura 2c).
 il TEP indotto dal chip crea un campo elettrico attraverso la membrana cellulare
(Figura 2d)
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La giunzione silicio-neuroni
Per descrivere la giunzione silicio-neuroni può essere usato il modello 2D area-contatto che
viene mostrato in Figura 3 a.
Figura 3a
La corrente lungo lo spazio tra cellula e silicio è bilanciata dallo corrente di spostamento
attraverso il silicio e dalla corrente ionica e di spostamento attraverso la membrana. La
conservazione della carica elettrica per unità di area della giunzione è espressa dalla seguente
formula:
La parte sinistra dell’equazione si riferisce al bilancio di corrente per unità di lunghezza
nello spazio tra silicio e membrana, mentre la parte destra si riferisce alla corrente per unità di
area attraverso al membrana e l’ossido con un il potenziale elettrico Vm nella cellula, il
potenziale Vs nel substrato, il TEP Vj nella giunzione e
è l’operatore di derivata
bidimensionale. Inoltre rj è la resistenza dello spazio tra cellula e silicio, cm e cs sono le
capacità specifiche di area della membrana e del substrato e dove gjm è la conduttanza della
membrana attaccata.
Un altro modello che può essere usato è il modello mostrato in Figura 3 b:
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Figura 3 b
Questo modello è detto modello point-contact.
Per molte applicazioni è conveniente descrivere il conduttore core-coat con il circuito appena
mostrato in Figura 3b e descritto in (2).
Lo spazio conduttore è rappresentato da una conduttanza ohmica conduttanza Gj, la
membrana attaccata del neurone e il diossido di silicio rispettivamente rappresentate da le
capacità globali Cjm e Cs. Vi0 rappresenta i voltaggi inversi generati dalle differenze di
concentrazione ionica tra cellula e ambiente, che scorre lungo Gijm. Questi voltaggi vengono
considerati uguali anche per la condizione di membrana libera.
Possiamo quindi concludere che l’iterfacciamento neuroni-semiconduttori è mediato dal
TEP. Un grande TEP risulta da grandi correnti attraverso la membrana e il diossido di silicio
e da una bassa conduttanza della giunzione. La registrazione e la stimolazione da attività
neuronale sono promosse da una piccola distanza dj tra membrana e silicio una alta resistenza
specifica e un grane raggio della giunzione cellula-silicio. Una registrazione efficiente
richiede una alta conduttanza ionica gjm nella membrana attaccata, mentre un’efficiente
stimolazione richiede una alta capacità area specifica del chip.
Come misurare la distanza tra cellula e chip
La distanza dj tra cellula e chip può essere misurata con un metodo detto FLIC (fluorescence
interference contrast) che utilizzando la microscopia tiene conto dei diversi modi in cui l luce
si comporta di fronte alla superficie riflettente del silicio.
Come dimostrato da differenti esprimenti condotti su astrociti di ratto piastrati con laminin, la
membrana e il silicio, a causa della presenza di proteine transmembrana e dello strato di
laminin stesso, non sono a stretto contatto. Questo porta a forze entropiche repulsive che
bilanciano le forze attrattive di adesione cellulare tra le integrine nella membrana e le
molecole di laminin.
La conduttanza dello spazio tra cellula e silicio
Lo spazio tra neurone e silicio ha una resistenza elettrica che corrisponde ad un sottile film
di elettroliti. La resistenza del film è dell’ordine di rj= 10 Mohm con una resistenza globale
intorno a Gj-1= 1 Mohm. Non ci sono Giga ohm di sigillo tra cellule e silicio. Può essere
notato che la larghezza dello spazio è più grande dello spessore del doppio strato
elettricamente diffuso nel diossido di silicio e nella membrana. Potrebbe essere un difficile
goal quello di rendere maggiore la resistenza del film abbassando la larghezza o aumentando
la resistenza specifica dello spazio
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Sterilizzazione supporto di silicio [Kaul04]
Prima di ogni utilizzo, la superficie in silicio va lavato con una soluzione 10% detergente in
milli-q water a 70 gradi C, poi risciacquate in milli-q water e sterilizzate con raggi UV per 15
minuti. Una soluzione di poly-l-lysine viene applicata per 8 ore. Per ultimo il silicio viene
sciacquato 3 volte con acqua e asciugato.
Segnali registrati
Per dare un’idea del segnale che si registra “ascoltando” i neuroni coltivati su supporti di
silicio voglio riportare un lavoro del gennaio di quest’anno [1]
Questo è lo schema che si è usato (Figura 4):
Figura 4
Dove in a) è rappresentato il sistema ibrido cellule-silicio, in b) cellula di sx = neurone
presinaptico (VD4), cellula di dx = neurone postsinaptico (LPeD1).
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Testare la presenza di sinapsi chimiche
Le due cellule sono state impalate con 2 microelettrodi e si è visto che i potenziali d’azione
presinaptici in VD4 hanno generato potenziali d’eccitazione postsinaptica 1:1 come mostrato
in Figura 5
Figura 5
La Figura 5a mostra, le cellule impalate per poter effettuare la registrazione. La Figura 5b
mostra invece la registrazione intracellulare, più precisamente il grafico in alto mostra 2
potenziali d’azione in VD4 tratto da una iniezione di corrente di 1nA (holding voltage 60mV). Il grafico in basso, invece, mostra potenziali di eccitazione postsinaptica in LPeD1
(holding voltage -90mV)
Testare le stimolazioni del capacitor
Si è testato se i potenziali d’azione in VD4 possano essere tratti dal chip, per mezzo della
stimolazione del capacitor, tenendo la cellula impalata con il microelettrodo. Si è usato un
generatore di waveform per applicare voltaggi positivi al capacitor. Uno stimolo consiste in
due impulsi con ampiezza di +3V e 0.5ms (Figura 6a ).
Figura 6a: VD4
Una sequenza di tre paia di impulsi portano a piccole risposte di voltaggi intracellulari che
inducono depolarizzazioni intracellulari sostanziose (Figura 6b)
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Figura 6b: VD4
I potenziali d’azione generalmente si creano dopo il secondo o il quarto stimolo.
I potenziali d’eccitazione postsinaptica in LPeD1 sono indotti dall’attività in VD4 generata
dal capacitor. I potenziali di eccitazione postsinaptica così indotti, sono indistinguibili da
quelli indotti dalla stimolazione intracellulare.
Registrando intracellularmente si sono osservati i potenziali d’azione postsinaptica dopo 2 o 3
spikes presinaptici generati dalla stimolazione del capacitor (Figura 6d), in analogia con le
stimolazioni presinaptiche intracellulari.
Figura 6d: VD4
I risultati danno evidenza sperimentale del fatto che la stimolazione del capacitor può
innescare trasmissione sinaptica.
Testare le registrazioni del transistor
Per completare l’interfacciamento di trasmissioni sinaptiche per mezzo del chip in silicio, si
è testato se le attività pre- e post- sinaptiche possono essere osservate con un transistor.
Prima di ogni misurazione, il transistor viene calibrato applicando definiti voltaggi al bath..
Impulsi sono stati applicati al capacitor sotto ad un neurone VD4. i potenziali d’azione nel
neurone VD4 sono stati registrati dal transistor come un transiente positivo del voltaggio
extracellulare con una ampiezza di 3mV (Figura 6c)
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Figura 6c
Il potenziale d’azione tratto nel neurone LPeD1 dalla trasmissione sinaptica è stato registrato
dal transistor come un picco elevato di circa 3mV nella sua fase ascendente (Figura 6e)
Figura 6e
Questo esperimento ha dimostrato che l’interfaccia di una sinapsi chimica per mezzo di un
semiconduttore (chip) con stimolazione presinaptica by capacitor e la registrazione by
transistor sia in fase pre- che in fase postsinaptica. I risultati sono stati confermati da
esperimenti condotti senza impalare LPeD1 e esperimenti condotti senza impalar nessuna
delle due cellule.
Il potenziamento short-term: le basi per la memoria negli animali
Si è testata la capacità delle sinapsi VD4-LPeD1 di esibire potenziamento short-term che è
alla base della memoria negli animali. Precisamente un tetano presinaptico in VD4 che
consiste di 5-10 potenziali d’azione genera spikes postsinaptici in LPeD1. hanno riprodotto la
plasticità short-term sul chip con l’inserimento di una corrente attraverso elettrodi
intracellulari. Poi hanno testato se il potenziamento può essere tratto da una stimolazione del
capacitor e registrato con un transistor.
Prima come controllo, un singolo potenziale d’azione è stato dato a VD4 con un paio di
impulsi applicati al capacitor. In questo caso la depolarizzazione postsinaptica non è stata
sufficiente per creare un potenziale d’azione in LPeD1 (Figura 7a)
Figura 7a:
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Poi un tetano di sei impulsi ( 3V, 0.5ms) è stato applicato e ha generato cinque potenziali
d’azione in VD4 (Figura 7b)
Figura 7b
per testare il potenziamento, di nuovo un potenziale d’azione viene stimolato pochi secondi
dopo il tetano. Il potenziale d’azione post-tetanico ha causato uno spike in LPeD1 che è stato
registrato dal transistor (Figura 7c)
Figura 7c
5.2.2 Interfacciare neuroni e MEAs [Novellino03]
Un MEAs è un array di microelettrodi su cui è possibile coltivare diversi tipi cellulari, quindi
materiale biologico, vivente, per poter effettuare studi di elettrofisiologia in modo veloce e
innovativo.
Figura 8: MEA www.brainworks.uni-freiburg.de/.../ mea/mea.html
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figura 9 : cellule su MEA www.ece.uiuc.edu/ingenuity/ 1001/neuronal.html
Due principali caratteristiche rendono i MEAs un valido strumento per l’elettrofisiologia:
 Non invasività
 Registrazione in MULTI-SITE (su diversi canali)
La prima caratteristica permette, sotto determinate condizioni, di poter registrare l’attività
cellulare per lunghi periodi di tempo.
La seconda caratteristica permette di poter registrare simultaneamente dalla rete su diversi
canali, quindi, e di poter analizzare i cambiamenti indotti dalle stimolazioni elettriche e
correlare le attività tra i differenti canali per poter quindi definire la dinamica della rete.
Le principali attività ritmiche elettrofisiologiche vanno da spike asincroni e pattern
organizzati nella forma di “bursting”. Un “burst” è caratterizzato da una rapida sequenza di
più spike separati l’uno dall’altro da pochi milli secondi ( Inter Spike Interval, ISI) e l’
intervallo tra i burst è nella scala dei secondi o dei minuti. Dal punto di vista dei pattern dei
segnali, abbiamo a che fare con sequenze temporali dove eventi nel range di secondi (burst)
sono separati da periodi di silenzionel range di decimi di secondi (Inter Burst Interval, IBI).
Presso l’Università di Genova sono stati condotti esperimenti con neuroni dissociati dalla
spinal cord di embrioni di pollo dopo 7-8 di incubazione. I neuroni sono stati piastrati, quindi,
su MEAs ricoperti da polylisina e laminina per favorirel’adesione cellulare.
I segnali elettrofisiologici sono stati registrati dopo 14 giorni in vitro, necessari per la
formazione di sinapsi tra i neuroni.
L’array usato è di vetro con 60 microelettrodi. Sono stati inoltre usati: una gabbia di Faraday
per evitare le interferenze elettromagnetiche, 8 canali per la registrazione in MULTI-SITE (l1,
l2, l3, l4, r1, r2, r3, r4), una strumentazione per la registrazione DIGITAL TAPE
RECORDER, un’oscilloscopio per il monitoraggio in tempo reale dei segnali, un sistema per
la stimolazione elettrica e ovviamente un PC per l’analisi dei dati.
Protocollo sperimentale di stimolazione elettrica e segnali registrati
1) registrazione dei segnali dell’attività spontanea dei neuroni nel medium di coltura
2) singolo impulso (ampiezza 0.3-0.1 V, lasting: 100 microsecondi) mantenuto per 2
minuti a 0,5 Hz
3) registrazione dell’attività post –stimolazione
4) aggiunta di K+ 9mM (creazione di condizione in alta concentrazione di potassio)
5) 2h in incubatore per verificare la salute dei neuroni
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6) controllo post incubazione
7) stimolazione tetanica formata da un rapida successione di stimoli (ognuno di 0.3-0.1 V,
lasting: 100 microsecondi, a 20Hz) dove ogni stimolo è di 0.2 Hz
I segnali raccolti da i MEAs hanno tipicamente ampiezza nel range di 0.1-0.4 mV e sono
circondati in rumore biologico e termico che va dai 10 ai 40 V peak-to-peak. Per estrarre le
caratteristiche degli spike i dati sono stati processati da un algoritmo ad Hoc per la rilevazione
di potenziali d’azione.
Sono stati processati: l’attività spontanea, control condition, con bursting e ISI .
Può essere osservato che i pattern elettrofisiologici nelle condizioni di controllo sono gli stessi
per tutti i canali: burst, lasting (circa 0,5 s), caratterizzati da circa 26.6 s di IBI. La
sincronizzazione della rete può essere rilevata osservando le caratteristiche di ISI , che sono le
stesse per ogni canale e mostrano come due spike siano più temporalmente separati da meno
di 10 ms.
Dopo la stimolazione elettrica, i neuroni rispondono con segnali differenti, dove il burst
sembra essere soppresso.
Dopo le 2 ora di incubazione con l’aggiunta del K+ è osservabile che i neuroni hanno una
attività spontanea caratterizzata da un IBI di circa 27.6 s più alto cioè dell’IBI della
condizione di controllo, con un burst di circa 7.4 s. In questa fase sperimentale, l’attività
spontanea dei neuroni è più alta rispetto alla prima: i neuroni sembrano recuperare l’attività
spontanea sincronizzata, in termini di burst e di ISI , ma qualche cambiamento nel burst può
essere osservato : ISI adesso è compreso tra 5 e 7,5 ms come mostrano le figure 8 e
9.d’altronde, si può osservare che il nuovo stato è caratterizzato da più burst e da burst più
lunghi con IBI più bassi rispetto alla situazione di control condition.
La fase tetanica, poi, mostra che la stimolazione elettrica induce una nuova depressione
dell’attività, sia in termini di bursting che in termini di spiking (fig 7, 8, 9), che è meno
drastica della precedente depressione post-stimolazione elettrica.
Riassumendo allora possiamo dire che:
 L’attività spontanea della rete mostra un alto livello di sincronizzazione
 dopo la stimolazione elettrica, la rete cambia comportamento e mostra un bursting depresso
. Questo può essere spiegato dal fatto che la stimolazione produce un rilascio totale dei
neurotrasmettitori.
 Dopo l’incubazione la rete aumenta la sua attività .Questo può valicare l’ipotesi sul rilascio
totale del neurotrasmettitore e confermare che la stimolazione elettrica produce un
duraturo ma reversibile effetto sulla dinamica della rete.
 La stimolazione tetanica induce invece una depressione dell’attività, ma la rete è ancora
sincronizzata in termini di eventi. Questa depressione è minore rispetto alla prima, questo
sembra significare che può essere possibile indurre differenti tipi di cambiamenti attivitàdipendenti in accordo con le frequenze esposte della stimolazione.
Le differenze di queste risposte e tra le frequenze dei pattern rappresentano lo stato corrente
della rete, così che questi comportamenti possono sottolineare se è avvenuto apprendimento e
come la rete sta codificando le nuove caratteristiche.
D’altronde, si è visto come in tutte le fasi sperimentali la rete abbiamo mostrato un attività
sincronizzata nel tempo. Questo sembra significare che le modificazioni indotte dalla
stimolazione non abbiano un effetto locale, ma si riferiscano a dinamiche spazio-temporali
complesse.
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Esperimenti di adattamento selettivo e apprendimento neuronale: MEAs e neuroni corticali
di ratto [Shahaf01 e Eytan03]
Una caratteristica chiave nei sistemi neurali è la loro abilità di adattarsi selettivamente a
stimoli di differenti caratteristiche. Usando i MEAs e dei circuiti random di neuroni corticali
isolati da cervelli di ratti appena nati, un lavoro pubblicato nel 2003 e condotto al politecnico
di Haifa in Israele, mostra come i neuroni così coltivati siano iin grado di adattarsi
selettivamente a diversi stimoli che invadono la rete. Sviluppando un array di 60 elettrodi, e
utilizzando la poly-D-lisina come molecola di adesione su cui piastrare le cellule, sono stati
condotti 7 esperiementi in cui le reti sono stimolate in due differenti parti.
figura 10: MEA
Ogni esperimento dura 15 minuti e comprende 162 stimoli ad alta frequenza (1/5 sec-1) e 18
stimoli a bassa frequenza (1/50sec-1). Inoltre sono stati condotti esperimenti a diverse
frequenze (1/2-1/20 sec-1, 1/3-1/30 sec-1). Gli stimoli ad alta frequenza sono inviati tramite il
sito A e quelli a bassa frequenza tramite il sito B. in ogni esperimento la rete è stimolata
continuamente con 180 stimoli, come già detto, un singolo stimolo crea una risposta che dura
diverse decine di millisecondi.
La figura in basso mostra la risposta registrata da un elettrodo dei 60 sull’array in risposta ad
uno stimolo lìmandato dal sito A:
Figura 11: stimolazione
La figura in basso invece mostra un singolo spike:
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Capitolo 5
Interfacciamento neuroelettronico
figura 12: singoli spike
Come osservato da altri [Jimbo00], [Shahaf01], [Marom02] una risposta tipica ad una
stimolazione in una rete random di neuroni corticali include due tipi di fasi distinte: una fase
early che dura 20msec, che coinvolge il neurone o i neuroni direttamente coinvolti dallo
stimolo e una fase tardiva che dura centinaia di msec, che involve la propagazione del segnale
all’interno della rete e che è dipendente dalla trasmissione mediata dai recettori NMDA. Le
due fasi sembrano riflettere la bifasica (AMPA-NDMA) natura e dinamicità delle sinapsi
glutamaergiche (Jimbo 2000).
I risultati ottenuti da una rete sono mostrati sotto:
figura 13: risultati
La figura 13 A, mostra la media delle risposte allo stimolo ad alta frequenza (grigio) e a
bassa frequenza (nero) da una singola parte delle rete. La risposta è presentata nella forma di
un PSTH (post stimulus time hystogram) del firing rate istantaneo in funzione del tempo
trascorso dopo lo stimolo.
Le linee tratteggiate indicano la situazione all’inizio dell’esperimento mantre le linee
continue indicano le risposte dopo 15 min di stimolazione. Si nota come la riposta allo
stimolo a frequenza più alta si sia marcatamante abbassato, mentre è evidente il contrario per
quanto riguarda gli stimoli a bassa frequanza.
La figura 13 B mostra le stesse risposte ma sull’intera rete.
I cambiamenti in PSTHs mostrati finora possono essere considerati reversibili. infatti come
mostra la figura seguente entro i 15 minuti di stimolazione
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Capitolo 5
Interfacciamento neuroelettronico
figura 14: risposte agli stimoli
Infatti, entro i 15 minuti di stimolazione nel sito A e B ad alta e bassa frequenza la rete
diventa ipersensibile allo stimolo a bassa frequenza e iposensibile allo stimolo ad alta
frequenza (pannello sx della figura 14 ). A questo punto la rete non viene più stimolata per 15
min, dopo i quali le differenze nelle sensibilità diminuiscono come mostra il pannello
centrale. A questo punto vengno invertiti i siti e cioè vengono mandati gli stimoli ad alta
frequenza da sito B e quelli a bassa frequenza dal sito A e la rete viene così stimolata per altri
15 min. alla fine di questa seconda sessione le risposte sono praticamente invertite (nei colori
anche) ma perfettamente in accordo alle precedenti stimolazioni (figura 14 pannello di dx).
L’abilità di differenziare tra stimoli ad alta e bassa frequenza, a livello di singolo neurone, è
presentata dalla figura che segue:
figura 15: risposta di un singolo neurone
La figura 15 A mostra che questa proprietà adattativa risulta da due processi: la capacità di
risponedere algli stimoli ad alta frequenza diminuisce anche se la capacità di risponedere a
stimoli a bassa frequenza aumenta o rimane stabile. Ogni punto nel grafico rappresenta una
singola sorgente di spikes. La capacità di risposta è definita come il numero di spike registrati
entro 150msec dopo lo stimolo. La capacità di risposta iniziale e finale sono averaged su i
primi 6 e gli utlimi sei stimoli rispettivamente.
Come possiamo vedere nella figura 15 B all’inizio dell’esperimento (asse x) molte cellule
rispondono similarmente alle due diverse stimolazioni (rapporto= 1). Alla fine invece (asse y)
quasi tutti i punti sono posizionati sopra al valore 1. Si è dimostrato allora come reti random
di neuroni corticali siano in grado di rispondere selettivamente a diversi stimoli.
Sempre lo stesso gruppo di recercatori israeliani, solo 2 anni prima aveva anche dimostrato
come una rete random di neuroni corticali mostri un particolare tipo di apprendimento
selettivo.
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Capitolo 5
Interfacciamento neuroelettronico
Per dimostrare ciò, hanno usato una semplice idea: stimolare la rete a basse frequenze 0,3-1
Hz (A stimolazioni maggiori di 1Hz inoltre la rete si inattiva dopo pochi impulsi e quindi
così si spiega l’utilizzo di frequenze inferiori 0,3-0,5-1 Hz ) fino a raggiungere una risposta
desiderata predefinita nei 50+- 10 msec dopo lo stimolo. Una volta raggiunto, fermare lo
stimolo. E si chiedono quanto ci vuole per ottenere la risposta desiderata? La risposta
appropriata rimarrà stabile dopo questa semplice procedura? Quanto può essere selettivo il
cambiamento nella connettività? Se dopo questa procedura la risposta richiesta allo stimolo
sarà attendibile e selettiva, questo potrà essere considerato una forma di apprendimento.
Per controllare l’esistenza di sinapsi (da cui l’attività elettrica in vitro sembra essere
dipendente [Maeda95], [Turrigiano98]) nella rete sono stati effettuati degli esperimenti di
blocco sinaptico per mezzo di bicucullina e DNQX, i quali hanno dati esito positivo. Inoltre
l’essistenza di sinapsi è confermata da un gran numero di attività correlate statisticamente
significative tra paia di elettrodi. Definiscono la connettività tra paia di elettrodi in termini di
potenziale d’azione A che che è seguito da un altro potenziale d’azione B con un preciso time
delay (t +- 0,5 sec ). L’analisi dell’attività spontanea della rete, senza nessuna stimolazione,
suggerisce che la media delle connessioni A-B statisticamente significative è una grande
percentuale del massimo che è possibile a valori di t relativamente piccoli.
figura 16
Ma la cosa importante è che il numero di connessioni è grande e che esistono molti patterns
di attività indipendenti. Quest’ultima cosa è amplificata dal fatto che in queste reti, i singoli
neuroni raramente si accendono spontanenamente senza essere attivati da altri neuroni (
maeda 1995, canepari 1997), anche se la correlazione media tra gli elementi è bassa (vedi
inserto figura 16 in alto).
Quando stimolano con una frequenza costante, la rete risponde generando un ricco repertorio
di attività elettriche che durano 100 msec e più:
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figura 17
Modifiche nella connettività funzionale si manifestano come cambiamenti
nell’accoppiamento delle risposte agli stimoli. Stimolazioni continue inducono cambiamenti
nella risposta della rete come già Jymbo nel 1999 aveva dimostrato [Jimbo99]. Inoltre la
figura 18 sotto riportata mostra che il numero di modifiche cresce col tempo di stimolazione:
figura 18
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Capitolo 5
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Ogni esperimento comincia con lo stimolare la rete attarverso un paio di elettrodi e osservare
le risposte da tutti gli altri elettrodi non stimolanti. Uno di questi elettrodi di output che
risponde 50 msec dopo uno stimolo con un rapporto risposta/stimolo (R/S) di 1/10 o meno,
viene selezionato. In altre parole prima del training, servono 10 stimoli per evocare un
potenziale d’azione nell’elettrodo selezionato nel tempo designato di 50msec dopo lo stimolo.
Durante la fase di training, il task di apprendimento è quello di incrementare il rapporto R/S
dell’elettrodo selezionato a 2/10 o più sempre in 50 msec dopo lo stimolo. Gli stimoli arrivano
continuamente alla rete con una frequenza costante di 1/3 o ½ o 1 stimolo per secondo. Un
computer costantemente monitora il rapporto R/S dell’elettrodo selezionato e una volta che il
criterio 2/10 viene verificato (cioè due risposte vengono generate in 10 stimoli consecutivi), il
computer blocca le stimolazioni. Dopo 5 minuti la rete viene stimolata dinuovo (con la stessa
frequenza) fino a raggiungere un criterio uguale o superiore a 2/10. Questo ciclo di
stimolazione è ripetuto più volte. Cmq come regola generale se il criterio non viene raggiunto
entro 10 minuti la stimolazione viene cmq bloccata. Un esempio di risultato di procedura di
apprendimento è mostrata in basso:
figura 19
Si mostrano in figura 19 le risposte dell’elettrodo selezionato prima e dopo il training. Le 11
tracce di ogni pannello, mostrano le risposte a 11 stimoli consecutivi. Si nota che l’attività
entro i 50msec (dentro le linee rosse) è marcatamente aumentata dopo la fase di training. La
figura20 in basso invece mostra 8 curve di apprendimento in cui il tempo di risposta (tempo
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richiesto per raggiungere il criterio >=2/10) e plottato contro il numero di cicli di
stimolazione. Ogni punto rappresenta il tempo in secondi che serve per rispondere al criterio:
figura 20
Queste curve sono caratterizzate da un decremento nel tempo di risposta e da una
stabilizzazione a valori più bassi dei valori iniziali.
La figura 21 in basso riassume i dati di apprendimento selettivo. Cambiamenti nel rapporto
R/S dell’elettrodo selezionato (pallini ) e 10 elettrodi di controllo (stelle) sono mostrati per
otto esperimenti da otti diverse reti di neuroni. Per ogni rete, i 10 elettrodi di controllo sono
scelti analizzando i dati, dopo la fine dell’esperimento, e sono i dieci elettrodi con R/S più
simile all’R/S dell’ elettrodo selezionato prima del training. Il cambiamento, mostrato con “f “
è definito come il rapporto tra la risposta prima del training e dopo il training, normalizzato
con il cambiamento in R/S dell’elettrodo selezionato. Così che f=1 significa un cambiamento
in R/S identico al cambiamento misurato nell’elettrodo selezionato. F<1 e f>1 significa che la
risposta rilevante dell’elettrodo di controllo è diminuita o cresciuta rispettivamente,
reltivamente all’elettrodo selezionato.
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Interfacciamento neuroelettronico
figura 21
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