come si rivelano i radicali.

Chimica 2 (07/08)
COME SI RIVELANO I RADICALI.
Come abbiamo visto c’è un gruppo di radicali persistenti che possono essere ottenuti in
alta concentrazione in soluzione, o anche come liquidi o solidi puri.
Tali specie possono essere studiate per mezzo di tutte le tecniche convenzionali a
disposizione del chimico, il loro spettro infrarosso ed ultravioletto può essere determinato
ed è possibile effettuare esperimenti per determinare la suscettibilità magnetica che
confermino la presenza di elettroni spaiati. Inoltre i loro spettri EPR possono essere
rilevati e da questi possono essere ricavate numerose informazioni sulla loro struttura.
La maggior parte dei radicali esiste però come intermedio transiente, che non è presente
in alta concentrazione. La presenza di intermedi radicalici può spesso essere dedotta
dalla natura dei prodotti di reazione o dallo studio della cinetica della reazione.
Alternativamente la reazione può essere inibita con un radicale persistente che intrappola
il radicale transiente. Tuttavia la conferma della presenza di intermedi radicalici attraverso
metodi fisici di solito comporta che si generi un’alta concentrazione di radicali per
irraggiamento con una luce molto intensa, o che si prepari il radicale per trasferimento
elettronico con uno ione di un metallo di transizione che sia presente in alta
concentrazione. In questo modo la flash fotolisi (Flash Photolysis) ha permesso lo studio
dello spettro elettronico di numerosi radicali. Altri sono stati studiati allo spettrometro EPR,
che permette il rilevamento di specie paramagnetiche, usando sorgenti luminose molto
intense.
LA SPETTROSCOPIA EPR
La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR electronic spin resonance o EPR
electronic paramagnetic resonance) è una tecnica che permette lo studio di radicali liberi
stabili o persistenti. Essa permette inoltre lo studio delle specie radicaliche transienti che
si formano nel corso di una reazione.
CONDIZIONE DI RISONANZA E RILASSAMENTO.
Qui di seguito sono descritte succintamente le basi teoriche su cui è fondata questa
tecnica.
Come sappiamo l'elettrone è una particella subatomica, che possiede una certa massa ed
una certa carica, dotata di un movimento di rotazione attorno a se stessa che viene
chiamato spin (trottola). Tale spin può essere uguale a ½ o a -½ a seconda del verso in
cui ruota l’elettrone.
A causa della sua rotazione l'elettrone genera inoltre anche un campo magnetico.
Nel caso in cui l’elettrone venga sottoposto ad un campo magnetico esterno l’energia dei
due stati di spin che in condizioni normali sono degeneri, viene modificata a causa
dell’interazione del campo magnetico esterno con quello generato dall’elettrone.
La differenza di energia che si viene a creare tra i due stati di spin è uguale a:
ΔE = gEβEH
(1)
4-1
Chimica 2 (07/08)
dove H è il campo magnetico applicato, βE è il magnetone di Bohr1 (9,2733 x 10-21
erg/gaus) e gE è un numero adimensionale che per l’elettrone libero vale 2,0023 e che per
gli elettroni in atomi o in molecole (cioè non isolati) ha un valore che dipende dall’intorno
dell’elettrone.
Splitting dei livelli di spin di un elettrone in presenza di un campo magnetico H.
Quando l’elettrone è esposto ad una radiazione elettromagnetica appropriata la cui
frequenza ν soddisfa la condizione di risonanza:
hν = gEβEH = Eα - Eβ
(2)
sono possibili transizioni tra i due livelli energetici cioè gli elettroni possono assorbire
energia per passare da uno stato all’altro.
Allo stesso modo irradiando l’elettrone con una radiazione di frequenza ν costante, e
variando la forza H del campo magnetico applicato si può raggiungere il valore che
soddisfa la condizione di risonanza.
Quando tale condizione è soddisfatta, le transizioni possono avere luogo in entrambe le
direzioni dando luogo ad assorbimento (Eβ→Eα) o ad emissione (Eα→Eβ) di energia.
i) Segnale EPR (assorbimento) ottenuto a frequenza costante e intensità H del campo
variabile; ii) Derivata prima del segnale di assorbimento EPR.
Il fatto che il sistema nel suo complesso assorba o emetta energia verrà dunque
determinato dalla direzione del maggior numero di transizioni, e poiché le due transizioni
hanno la stessa probabilità di avvenire, la popolazione dei due livelli α e β ha
Unità fondamentale del momento di dipolo magnetico di un atomo, dato da mb = e(h/2)/2me,
dove e è la carica dell'elettrone, h è la costante di Planck, ed me la massa dell'elettrone. Il
momento di dipolo magnetico è una grandezza vettoriale che esprime quantitativamente le
proprietà magnetiche di un atomo dovute al moto orbitale degli elettroni intorno al nucleo.
4-2
1
Chimica 2 (07/08)
un’importanza determinante. Si avrà così assorbimento solo quando la popolazione del
livello più basso (n1) sarà più grande di quella del livello più alto (n2). La legge di
distribuzione di Boltzman predice appunto un leggero eccesso di popolazione nel livello
più basso, cioè (n1 – n2) > 0 per cui di solito si ha un assorbimento anche se molto piccolo;
per aumentare il livello di segnale registrabile, nella tecnica EPR si usa quindi registrare lo
spettro di assorbimento come derivata prima.
Uno spettrometro EPR consiste essenzialmente di un elettromagnete, il quale permette di
variare con continuità il campo magnetico applicato, di un generatore di radiazioni
elettromagnetiche che emette microonde in un campo molto ristretto di frequenze, di una
cella portacampioni e di un rilevatore che permette di misurare l’entità dell’assorbimento
subito dalla radiazione elettromagnetica. I segnali forniti dal rilevatore vengono registrati
in funzione dell’intensità del campo magnetico.
PARAMAGNETISMO DI RADICALI ORGANICI.
Nello stato fondamentale dei composti organici stabili sia gli orbitali interni che quelli di
legame sono occupati ognuno da due elettroni che differiscono solo per il valore di Ms (gli
elettroni si dicono accoppiati e si indicano generalmente con il simbolo ↑↓). Lo stato di un
sistema è un singoletto in quanto ha molteplicità2* 1 ed è diamagnetico.
Nel caso in cui una molecola organica abbia un orbitale occupato da un solo elettrone
spaiato, allora esso si troverà in uno stato di doppietto e sarà paramagnetica dando luogo
ad uno spettro EPR. Il paramagnetismo di tali molecole deriva quasi esclusivamente dallo
spin dell'elettrone spaiato, cosicché i loro valori di ge (o più semplicemente g) differiscono
solo di poco da quello tipico dell'elettrone libero (2,0023).
Il segnale EPR ben risolto di un radicale organico può contenere anche più di cento linee
ed è per questo che si parla di spettri EPR.
La complessità degli spettri dipende dalla interazione dell'elettrone spaiato con i nuclei con
numero quantico di spin non nullo presenti nel radicale. Analogamente al caso
dell'elettrone infatti, anche i nuclei degli atomi possono possedere un momento magnetico
nucleare che dipenderà dal numero di neutroni e di protoni che contengono che sarà
associato al numero quantico di spin nucleare I.
Il valore di I vale multipli dispari di ½ per nuclei che possiedono un numero di massa
dispari:
I = 1/2 per 1H, 13C, 19F, 31P;
I = 3/2 per 11B, 23Na, 33S, 39K, 63Cu;
I = 5/2 per 55Mn;
I = 7/2 per 51V, 133Cs, etc.
multipli interi di 1 per nuclei che possiedono un numero di massa pari e carica nucleare
dispari:
I = 1 per 2H, 14N;
I = 3 per 10B, etc;
2
La molteplicità di una molecola: Un singoletto è una molecola con un'unica funzione d'onda e che non ha
elettroni spaiati. Un doppietto e un tripletto hanno funzioni d'onda che possono essere scritte in due e tre
modi, rispettivamente come conseguenza della presenza di uno o due elettroni spaiati. In generale il
numero di elettroni spaiati +1 corrisponde alla molteplicità della molecola.
4-3
Chimica 2 (07/08)
mentre nuclei con numero di massa pari e carica nucleare pari sono privi di momento
magnetico nucleare avendo un numero quantico di spin nullo:
I = 0 per 12C, 16O, 32S, etc.
L’interazione dell’elettrone spaiato con uno o più di questi nuclei sdoppia il segnale che
deriva dall’elettrone. Il numero di linee che vengono ottenute dall’interazione con n nuclei
equivalenti sono date dall’equazione:
numero di linee = 2 n I + 1
dove I è il numero quantico di spin nucleare e n è il numero di nuclei equivalenti che
interagiscono.
In figura sono riportati i diagrammi che mostrano l'interazione tra l'elettrone spaiato con
atomi aventi spin non nulli.
Splitting di un segnale ESR originato dall'interazione dell'elettrone spaiato con un nucleo
avente numero quantico di spin I = ½ (a sinistra o I = 1 a destra).
La separazione tra le righe si chiama costante di accoppiamento ed è caratteristica di ogni
nucleo in ogni composto radicalico (in pratica è un’indicazione di quanto un particolare
nucleo interagisca con l'elettrone spaiato). Lo spettro riportato nella parte sinistra della
figura può ben rappresentare la situazione di un atomo di idrogeno: in questo caso la
distanza tra le righe è di circa 500 Gauss. Lo spettro nella parte destra della figura
potrebbe rappresentare invece quello di un radicale in cui l'elettrone spaiato interagisce
con un unico nucleo avente spin I = 1, per esempio un atomo di azoto. Così l’interazione
dell’elettrone con un atomo di idrogeno sdoppia in due il segnale mentre l’interazione con
tre atomi di idrogeno equivalenti come nel metil radicale produce uno sdoppiamento che
risulta in un quartetto.
H
C
H
H
4-4
Chimica 2 (07/08)
Per tre nuclei equivalenti aventi spin = ½ infatti lo spettro consiste di quattro righe aventi
intensità relative 1:3:3:1, tutte ugualmente separate tra loro. Nel caso particolare del
metile, la costante di accoppiamento è di circa 23 Gauss.
La notevole differenza di accoppiamento riscontrata in H• e CH3• è da ricercarsi nel fatto
che nel metil radicale l'elettrone spaiato è localizzato sull'atomo di carbonio, cioè lontano
dagli atomi di idrogeno che ottengono comunque una certa frazione dì densità di spin
mediante polarizzazione indiretta.
L’intensità delle righe si dedurrà dallo sdoppiamento successivo delle stesse; nel caso di n
idrogeni equivalenti la situazione sarà quella riportata sotto:
N° righe e intensità relative
N° atomi equ con I = 1/2.
0
1
2
3
4
5
Nel caso in cui gli atomi adiacenti siano atomi di azoto che hanno numero quantico di spin
nucleare uguale ad 1 e quindi dividono il segnale in 3, la situazione sarebbe la seguente:
N° righe e intensità relative
N° atomi equ. con I = 1
0
1
2
3
4
Tale situazione è piuttosto difficile da incontrare in quanto raramente è presente un
numero così elevato di atomi di azoto equivalenti ma lo schema può aiutare a far capire il
meccanismo con il quale vengono sdoppiati i segnali. Inoltre tale schema è applicabile in
ogni caso in cui l’atomo abbia I = 1 (ad esempio il deuterio).
4-5
Chimica 2 (07/08)
Una situazione molto più frequente è quella in cui si abbia la contemporanea presenza di
atomi di idrogeno non equivalenti o atomi diversi.
In questo caso vale la formula:
(2nA IA + 1) (2nB IB +1) etc. = N° Totale di righe
dove nA sono il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IA, nB il
numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IB, ecc.
Vediamo alcuni esempi.
ESEMPIO 1
Lo spettro EPR del radicale anione del benzochinone risulta composto da 5 righe.
Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti ed avremo quindi:
(2 * 4 * 1/2 + 1) = 5 righe.
O*
H
H
O
O*
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
O
*
Gli atomi di idrogeno equivalenti danno cinque righe (intensità 1:4:6:4:1) con costante di
accoppiamento di 2.35 Gauss.
ESEMPIO 2
Lo spettro EPR dei radicale di-tert-butil nitrossido risulta composto da 3 righe.
Infatti in questo caso l’elettrone sente solamente l’influenza dell’atomo di azoto
CH3
H3C
C
CH3
N
CH3 O
C
CH3
CH3
4-6
Chimica 2 (07/08)
ESEMPIO 3
Lo spettro EPR dei radicale N-tert-butil-N-(2,2-dimetil-1-fenilpropil)-nitrossido risulta invece
composto di 6 righe.
In questo caso l’elettrone sente l’influenza dell’atomo di azoto e dell’atomo di idrogeno in α
all’azoto. Si avrà quindi:
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 1 * 1/2 + 1) = 6 righe.
Più precisamente, l’atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di
accoppiamento di circa 14 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un
doppietto (intensità 1:1) con costante di accoppiamento di circa 3.2 Gauss.
CH3
H3 C
C
t-Bu
N
C
H
CH3 O
ESEMPIO 4
Lo spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido risulta invece composto di 12
righe.
In questo caso l’elettrone sente l’influenza dell’atomo di azoto e dei tre atomi di idrogeno
del metile attaccato all’azoto. Si avrà quindi:
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1/2 + 1) = 12 righe.
Più precisamente, l’atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di
accoppiamento di 16.25 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un
quartetto (intensità 1:3:3:1) con costante di accoppiamento di 13.13 Gauss.
CH3
H 3C
C
N
CH3
CH3 O
ESEMPIO 5
Nel caso in cui gli atomi di idrogeno del metile siano stati sostituiti con atomi di deuterio lo
spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido sarà completamente differente.
4-7
Chimica 2 (07/08)
In questo caso infatti, l’elettrone sentirà comunque l’influenza dell’atomo di azoto e dei tre
atomi di deuterio del metile attaccato all’azoto che hanno però I = 1 e non ½ come
l’idrogeno. Si avrà quindi:
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1 + 1) = 21 righe.
Più precisamente, l’atomo di azoto darà comunque origine a tre righe (intensità 1:1:1) con
costante di accoppiamento di 16.25 Gauss, ma ognuna di esse sarà sdoppiata a sua volta
in un eptetto (intensità 1:3:6:7:6:3:1) con costante di accoppiamento di 1.87 Gauss.
CH3
H 3C
C
N
CD3
CH3 O
ESEMPIO 6
Lo spettro EPR dell’etil radicale risulta composto da 12 righe.
Infatti in tale radicale sono presenti due atomi di idrogeno equivalenti di tipo α e tre atomi
di idrogeno equivalenti di tipo β. Avremo quindi:
(2 * 2 * 1/2 +1) * (2 * 3 * 1/2 +1) = 12 righe.
Gli atomi di idrogeno di tipo α danno tre righe (intensità 1:2:1) con costante di
accoppiamento di 22.4 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei tre
atomi di idrogeno di tipo β equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in
un quartetto (intensità 1:3:3:1) con costante di accoppiamento 26.9 Gauss.
α
β
H3C CH2
ESEMPIO 7
Lo spettro EPR del radicale anione della naftalina risulta composto da 25 righe.
4-8
Chimica 2 (07/08)
Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti di tipo α e quattro
atomi di idrogeno equivalenti di tipo β. Avremo quindi:
(2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 4 * 1/2 +1) = 25 righe.
Gli atomi di idrogeno di tipo α danno cinque righe (intensità 1:4:6:4:1) con costante di
accoppiamento di 4,95 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei quattro
atomi di idrogeno di tipo β equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in
un quintetto (intensità 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento 1,87 Gauss.
α
*
β
ESEMPIO 8
Lo spettro EPR del butadiene radicale anione risulta composto da 15 righe.
Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno terminali equivalenti e due
atomi di idrogeno centrali equivalenti. Avremo quindi:
(2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 2 * 1/2 +1) = 15 righe.
CH2
CH2
CH
4-9
Chimica 2 (07/08)
Gli atomi di idrogeno di tipo terminali danno origine ad un quintetto (intensità 1:4:6:4:1) con
costante di accoppiamento di 7.5 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza
dei due atomi di idrogeno centrali equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua
volta in un tripletto (intensità 1:2:1) con costante di accoppiamento 2.75 Gauss.
ESEMPIO 9
Lo spettro EPR del radicale 2-fenil-2-metil-indolin-3-on-nitrossido risulta invece composto
di 27 righe.
In questo caso l’elettrone sente l’influenza dell’atomo di azoto e dei quattro atomi di
idrogeno sull’anello aromatico. Gli atomi di idrogeno in meta sono pressoché equivalenti
come lo sono quelli in orto ed in para. Si avrà quindi:
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1)= 27 righe.
Più precisamente, l’atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di
accoppiamento di 8.7 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un tripletto
(intensità 1:2:1) con costante di accoppiamento di 2.8 Gauss (Hp e Ho), che viene a sua
volta sdoppiato in un tripletto (intensità 1:2:1) più piccolo di 0.9 Gauss (Hm).
Hm
O
Hp
Ph
N
Hm
Ho
CH3
O
Riflessione: Spiegare lo spettro EPR del propenil radicale e del butenil radicale.
H
H
C C CH2
H
H
radicale
propenilico
C C C CH3
H H
H
radicale
butenilico
4-10
Chimica 2 (07/08)
RISONANZA DI SPIN ELETTRONICO IN BIOLOGIA
La spettroscopia di risonanza di spin elettronica (EPR) ha costantemente trovato
applicazioni nella problematica biochimica e biomedica, come un mezzo potente e
sensibile per la rivelazione di specie radicaliche.
Ciò si applica tanto al rilevamento (e all’identificazione) d’intermedi radicalici in reazioni
metaboliche, quanto all’osservazione di specie paramagnetiche stabili presenti in natura, o
al rilevamento di radicali prodotti da radiazioni esterne o, infine, all'analisi di sonde
paramagnetiche introdotte in sistemi biologici specifici (spin labeling).
Sebbene esista una grande potenzialità per l'osservazione diretta di specie radicaliche
associate a specifici fenomeni biochimici, il paramagnetismo si manifesta naturalmente
assai di rado in sistemi biologici.
Tuttavia grandi vantaggi possono essere ottenuti dalla introduzione di una qualche
versatile sonda contenente un centro paramagnetico.
Uno "spin label" ideale è un radicale libero stabile (spesso organico) di struttura e/o
reattività tali da consentirne l'introduzione in una particolare zona dei sistemi biologici e
della macromolecola. Sebbene a prima vista una tale sonda possa sembrare facilmente
ottenibile, in realtà non lo è. Infatti la maggior parte degli "spin-labels" usati attualmente
sono radicali nitrossidi protetti la cui sintesi è stata perfezionata solo in tempi recenti.
R
CH3
H3C
H3C
N
CH3
O
Qui di seguito è schematizzata una struttura generale di un tale nitrossido:
Sebbene la tecnica dello "spin-labeling" faccia generalmente riferimento all'uso di radicali
nitrossidi, si hanno anche altri esempi in cui NO2, Mn2+, altri ioni paramagnetici di metalli di
transizione, ioni di lantanidi, ed altri radicali organici di diversa matura sono stati usati
come sonde per lo studio di particolari si temi.
Tuttavia, a causa della loro grande versatilità, sensibilità e varietà di informazioni da essi
ottenibili, i radicali nitrossidi, hanno trovato un predominante impiego nella tecnica dello
“Spin-Labeling”.
4-11