LABORATORIO PROPRIETÀ SALUTISTICHE DI UNA GIOVANE BRASSICACEA IL KAVOLÌ Un nuovo ortaggio frutto di particolari tecniche agronomiche; per il suo sapore e la sua consistenza può essere consumato crudo, a differenza di altre varietà di cavolo, ed è ricco di glucosinati e acido ascorbico che ne caratterizzano le proprietà biologiche e nutrizionali. 72 t natural 1 giugno 2014 * Vincenzo Longo I l Kavolì appartiene alla famiglia delle Brassicaceae, la famiglia dei cavoli (le diverse varietà di Brassica oleracea), ed è costituito da piccole foglie raccolte a uno stadio giovanile dello sviluppo della pianta e per questo consumabile crudo a differenza di altre Brassicaceae, come il cavolo toscano, generalmente consumato solo previa cottura. Il Kavolì viene coltivato su un terreno sano, ricco di humus e in presenza di microorganismi probiotici senza l’utilizzo di concimi chimici, diserbanti e antiparassitari. Il prodotto che si ottiene è migliore sia come sapore che in termini di proprietà nutritive. Nonostante la giovane età, le foglioline del Kavolì presentano sia il sapore che le proprietà nutrizionali tipiche dei cavoli e, grazie alla tecnologia utilizzata per la produzione, contengono una notevole quantità di sostanze antiossidanti. È universalmente riconosciuto che tutte le verdure appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae (cavolo, broccoli, cavolini di Bruxelles, verza, crescione, rapa, cavolfiore) siano molto importanti per la salute umana, in quanto ricche in vitamine, sali minerali, fibre e molti composti fitochimici. Oltre a proteine, grassi, carboidrati e micronutrienti, il mondo vegetale fornisce anche fenoli, terpeni, terpenoidi, alcaloidi, purine, pirimidine, acidi nucleici e altri composti che esercitano potenti attività biologiche, riconosciute complessivamente con il nome di fitochimici. Queste sostanze hanno spesso un’azione protettiva sulla salute umana se assunte a livelli significativi e possono espletare una serie di funzioni biologiche tra le quali attività antiossidante, modulazione degli enzimi detossificanti, stimolazione del sistema immunitario, attività antibatterica (1, 2). La classificazione dei composti fitochimici sintetizzati dalle piante è complessa, ma possiamo individuare tre gruppi principali: i polifenoli (suddivisi a loro volta in flavonoidi, acidi fenolici, stilbeni e lignani), i carotenoidi e i glucosinolati. Queste sostanze concorrono all’espletamento delle ben note attività antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali. I flavonoidi costituiscono il gruppo più comune di composti polifenolici nella dieta umana e sono presenti ubiquitariamente nelle piante. giugno 2014 natural 1 t 73 LABORATORIO È universalmente riconosciuto che tutte le verdure appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae siano molto importanti per la salute umana, in quanto ricche in vitamine, sali minerali, fibre e molti composti fitochimici 74 t L’azione antiossidante di polifenoli e flavonoidi è dovuta principalmente alla capacità ossidoriduttiva, che consente loro di agire da agenti riducenti e quencer di ossigeno singoletto (3). Il gruppo dei flavonoidi comprende le importanti sotto-classi dei flavonoli, e delle antocianine. Oltre all’azione antiossidante è stato dimostrato per le Brassicaceae un effetto preventivo e protettivo nei confronti di patologie cardiovascolari, anemie, disordini visivi e polmonari, nonché nei confronti di patologie degenerative come le neoplasie; inoltre studi recenti ne hanno dimostrato l’attività antinfiammatoria e antitumorale, in quanto inducono l’apoptosi delle cellule tumorali (4). Proprio in questo ambito si inseriscono le più recenti ricerche sulla famiglia delle Brassicaceae natural 1 giugno 2014 e sul loro potenziale anti-tumorale, grazie all’elevato contenuto di glucosinolati (GLS) precursori degli isotiocianati (ITC), metabolicamente attivi. L’enzima coinvolto nella idrolisi dei glucosinolati in isotiocianati è la mirosinasi, una glicosidasi presente sia nelle cellule vegetali che nei batteri che compongono la flora intestinale umana. La mirosinasi viene liberata dai vacuoli cellulari a seguito di triturazione delle varie parti della pianta, inoltre la presenza di questo enzima a livello della microflora intestinale contribuisce a rendere ulteriormente disponibili gli isotiocianati di origine alimentare. Gli isotiocianati prodotti dall’idrolisi dei glucosinolati sono responsabili dell’odore pungente e del sapore peculiare delle Brassicaceae, che scoraggia, in natura, l’aggressione della pianta da parte di insetti ed erbivori; nell’uomo esercitano un’analoga attività nei confronti delle cellule tumorali, inibendone alcune fasi della carcinogenesi e inducendone l’apoptosi. Tra gli isotiocianati più studiati per le proprietà antitumorali citiamo il sulforafano, attivo contro i carcinomi di mammella, colon e prostata (5). I glucosinolati, i loro prodotti di idrolisi e le tirosinasi vengono facilmente inattivati dal calore. L’eccessiva cottura causa un odore intenso, indice della liberazione dello zolfo; per mantenere inalterate le proprietà delle brassicaceae si consiglia l’impiego di alimenti freschi o sottoposti a una cottura al vapore di pochi minuti. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che sia l’drolisi dei glucosinolati che l’assorbimento degli isotiocianati risultano maggiormente efficaci in seguito al consumo dei vegetali crudi rispetto ai cotti (6). Il contenuto di glucosinolati nelle Brassicaceae si riduce con l’avanzamento dell’età del germoglio e la maturazione della pianta; il Kavolì, essendo a uno stadio iniziale di maturazione, mostra un ottimo livello di glucosinolati e quindi di isotiocianati. La famiglia delle Brassicaceae è anche ricca di acido ascorbico, ossia la vitamina C, nota per l’elevato potere antiossidante. Numerosi studi hanno dimostrato che un consumo regolare di alimenti ricchi in vitamina C può ridurre significativamente l’incidenza di diverse forme di cancro; inoltre l’acido ascorbico sembra agire in maniera sinergica con gli isotiocianati, potenziandone così l’effetto (7). Alimenti contro radicali Un’alimentazione basata sull’apporto e il conseguente assorbimento di antiossidanti, è uno dei fattori che possono contribuire a mantenere nell’organismo un corretto livello di radicali liberi, rafforzando la naturale barriera antiossidante e riducendo lo stress ossidativo. Il potere antiossidante di un alimento può essere misurato con diversi metodi, il più idoneo alla valutazione dei complessi vegetali è stato ritenuto il test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) (8) che misura la capacità scavenging dei composti antiossidanti di un campione alimentare o biologico verso i radicali perossidici (ROO·), una delle più comuni specie reattive dell’ossigeno (ROS) presenti nell’organismo. In questo saggio viene misurata la variazione dell’intensità della fluorescenza di un marcatore nel tempo, in seguito alla modifica, da parte dei radicali, di tale marcatore. I valori ORAC sono riportati in termini di Trolox equivalenti per grammo di prodotto (μmolTE/g). È stato dimostrato che con un incremento da 5 a 10 volte della porzione quotidiana di frutta e verdura, il valore ORAC del cibo assunto aumenta da 1500 a 3500 unità. L’USDA (United States Department of Agriculture) considera la dose ottimale per la salute una quantità giornaliera 3500 unità ORAC. La misura antiossidante degli alimenti in vitro mostra spesso una debole correlazione con l’attività osservata in vivo. Girard-Lalancette e coll. (9) hanno infatti dimostrato come l’attività antiossidante misurata con saggio ORAC risulti spesso sovrastimata rispetto ai valori ottenuti utilizzando modelli sperimentali cellulari e animali. Blasa e colleghi hanno introdotto un nuovo test per valutare la capacità antiossidante di molecole di origine naturale in eritrociti umani, denominato CAA-RBC ossia Cellular Antioxidant Activity-Red Blood Cells (10, 11). L’utilizzo dei globuli rossi come sistema sperimentale per l’attività antiossidante è ampiamente giustificato dal forte coinvolgimento di queste cellule nei pathway ossidativi. Essendo gli eritrociti cellule anucleate e prive di mitocondri, il test CAA-RBC non viene influenzato dalla produzione endogena di ROS mitocondriali né dal contributo dei ROS alla trascrizione genica e consente di misurare l’attività antiossidante dei soli composti in grado di attraversare la membrana eritrocitaria (12). Queste proprietà rendono l’eritrocita umano un sistema ideale per lo studio dello stress ossidativo e l’emolisi indotta da fattori ossidanti. Il test CAA-RBC misura il grado di ossidazione di una sonda intracellulare, la 2’,7’-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA), in presenza di sostanze che, in base alla loro capacità antiossidante sono in grado di esercitare un determinato livello di inibizione del processo di ossidazione; la sonda intracellulare diffonde all’interno delle cellule e viene inizialmente de-acetilata dalle esterasi intracellulari, successivamente l’aggiunta di AAPH (2,2’-azobis2-amidinopropano) genera specie reattive dell’ossigeno che agiscono ossidando e convertendo la sonda nel derivato fluorescente (DCF). In seguito al trattamento con i composti in studio, se l’azione del generatore di radicali AAPH viene contrastata e quindi in seconda istanza viene inibita la formazione MATERIE PRIME PER IL SETTORE ERBORISTICO Erbe officinali Tisane Thè aromatizzati e infusi Pot pourry Miscele di spezie da cucina Prodotti particolari Patrizio Breseghello di Breseghello Alberto & C. S.a.s. Via del Senio, 70 - Casola Valsenio (RA) Tel: +39 0546 73400 - Fax: +39 0546 73383 www.p-breseghello.com [email protected] LABORATORIO del composto fluorescente, la sostanza testata risulterà avere una capacità antiossidante, direttamente correlata alla fluorescenza misurata. Il danno ossidativo a carico della membrana dell’eritrocita generalmente causa un aumento della perossidazione lipidica, con alterazione della plasticità cellulare e della funzionalità di enzimi e di recettori di membrana, meccanismi che determinano danno cellulare, causando infine l’emolisi dell’eritrocita (13). Alcune sostanze naturali sono in grado di aumentare sia la resistenza della membrana all’insulto ossidativo sia le proprietà antiossidanti endogene dei globuli rossi, queste proprietà vengono misurate con il saggio di emolisi, basato sull’induzione di emolisi ossidativa dopo il trattamento con elevate concentrazioni di AAPH che determina una rapida deplezione di tutto il GSH intracellulare, nonché l’ossidazione delle proteine e dei lipidi di membrana causando infine emolisi. Le sostanze in grado di ridurre o inibire tale processo risultano avere capacità anti-emolitica (14) t Contenuto totale di polifenoli I polifenoli totali sono stati determinati con il metodo di Folin-Ciocalteu modificato da Singleton (15). L’estratto naturale è stato miscelato con di reattivo di Folin-Ciocalteu 0.2 N e incubato al buio per 5 minuti. In seguito è stato aggiunto carbonato di sodio 0.7 M (Na2CO3) . Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente al buio, è stata misurata l’assorbanza allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di 760 nm. Il contenuto totale di polifenoli è stato infine espresso come mg di acido gallico equivalenti per g di peso secco (mg GAE/g). Materiali e metodi Contenuto totale di flavonoidi I flavonoidi totali sono stati quantificati mediante il metodo colorimetrico del cloruro di alluminio modificato (16). Brevemente, l’estratto naturale è stato miscelato con H2O e NaNO2 al 5% e incubato 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente è stato aggiunto AlCl3 al 10%, e dopo un’incubazione di 6 minuti la reazione è stata neutralizzata con NaOH 1M. Dopo 30 minuti è stata misurata l’assorbanza allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di 430 nm, la catechina è stata utilizzata come standard e la concentrazione finale di flavonoidi presente nei campioni è stata espressa come mg di catechina equivalenti per g di peso secco (mg CE/g). Preparazione dei campioni Le foglie di Kavolì I e II (fornite dal Consorzio Freschissimi, Campagna Lupia, Venezia, Italy) sono sta- Contenuto totale di flavonoli Il contenuto di flavonoli è stato determinato con il metodo descritto da Romani e colleghi (17). Lo scopo del nostro studio è stato quello di determinare la quantità di composti fenolici, flavonoidi e flavonoli, l’acido ascorbico, l’attività antiossidante con saggio ORAC e test CAA-RBC e infine l’attività anti-emolitica sul Kavolì. Le analisi sono state effettuate su estratti derivanti dalle foglie a due diversi stadi di maturazione della piantina di cavolo e perciò denominati in ordine di età crescente rispettivamente Kavolì I (20 gg.) e Kavolì II (40 gg.). 76 te liofilizzate, polverizzate in azoto liquido e infine sottoposte a un processo di estrazione. I campioni di Kavolì (10 mg/ mL) sono stati estratti in H2O per 12 ore in agitazione a 4 °C al buio e in seguito centrifugati a 2300xg 10 minuti a 4 °C. L’estrazione è stata effettuata in triplicato. natural 1 giugno 2014 Brevemente, agli estratti sono stati aggiunti EtOH al 10% HCl allo 0.1% in EtOH al 95% e HCl al 2%. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, l’assorbanza della miscela di reazione è stata misurata spettrofotometricamente a una lunghezza d’onda di 360 nm e la quercetina è stata utilizzata come standard. La concentrazione di flavonoli presenti nel campione è stata espressa come mg di quercetina equivalenti per g di peso secco (mg QE/g). Dosaggio dell’acido ascorbico La vitamina C presente nelle due varietà di cavolo è stata dosata mediante il saggio colorimetrico di Jacota e coll. (18). Brevemente, agli estratti è stato aggiunto TCA (acido tricloroacetico) al 10% e in seguito a una incubazione in ghiaccio di 5 minuti, i preparati sono stati centrifugati. Successivamente il sovranatante è stato prelevato e miscelato con acqua bi-distillata e reattivo di Folin diluito 1:10. Dopo 10 minuti di incubazione si è proceduto alla lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 760 nm e l’acido ascorbico è stato utilizzato come standard. La concentrazione di vitamina C nei campioni viene espressa come mg di acido ascorbico per g di peso secco (mgAA/g). Saggio ORAC Il metodo di Cao e coll. (19) è stato utilizzato con alcune modifiche. La miscela finale di reazione contiene: fluoresceina 36 nM, campione o Trolox 5μM diluiti in tampone fosfato 0,075 M pH 7.4 e AAPH 40 mM. La fluorescenza è stata letta a 37 °C con fluorimetro Perkin-Elmer VictorTM X3 (Waltham, MA) a 510 nm di emissione e 485 nm di eccitazione, 60 cicli. Il valore ORAC corrisponde all’area sotto la curva della fluoresceina in presenza del campione e del Trolox. Il valore finale corrisponde all’area sotto la curva di fluorescenza in presenza del campione o del Trolox e viene espresso come μmoli di Trolox equivalenti per g di peso del composto (μmoli TE/g). Preparazione degli eritrociti I campioni di sangue sono stati raccolti in tubi trattati con EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) e centrifugati per 10 minuti a 2300xg a 4 °C per rimuovere il plasma, le piastrine e il buffy coat. Gli eritrociti (RBC) sono stati quindi diluiti in tampone fosfato. Attività antiossidante cellulare (CAA-RBC) Gli eritrociti sono stati diluiti in PBS e incubati 1 ora a 37 °C in agitazione al buio, con la sonda DCFH-DA alla concentrazione finale di 15 μM e gli estratti di Kavolì o lo standard (Trolox) a diverse concentrazioni. Al termine dell’incubazione, gli eritrociti sono stati lavati per rimuovere l’eccesso di antiossidanti e risospesi in PBS freddo. Successivamente, alla sospensione cellulare è stato aggiunto il generatore di radicali AAPH a una concentrazione finale pari a 600 μM e la fluorescenza è stata misurata mediante fluorimetro Perkin-Elmer Victor X3 (Waltham, MA) a una lunghezza d’onda di eccitazione pari a 485 nm e 520 nm di emissione. Al termine delle letture (12 cicli) la misura della fluorescenza prodotta è stata misurata integrando l’area sotto la curva di fluorescenza. Analisi dell’attività anti-emolitica L’emolisi eritrocitaria è stata misurata con il metodo descritto da Mikstacka et al. (20), utilizzando come induttore di stress ossidativo la decomposizione termica Tabella 1. Contenuto totale di polifenoli, flavonoidi, flavonoli e vitamina C e attività antiossidante misurata in unità ORAC delle due varietà di Kavolì. **=p<0,01; ***=p<0,005; ****=p<0,0001. Figura 1. Attività antiossidante misurata con il test CAA-RBC. *=p<0,05; **=p<0,01. Figura 2. Attività anti-emolitica misurata con il test di emolisi. ***=p<0,005; ****=p<0,001. dell’AAPH in radicali perossidici. Una sospensione eritrocitaria al 5% è stata pre-incubata con Trolox o estratti di Kavolì a 37 °C per un’ora in agitazione. In seguito, è stato aggiunto l’AAPH 50 mM e dopo 4 h di incubazione a 37 °C in agitazione, i campioni sono stati centrifugati per 5 minuti e l’emolisi spontanea (bianco) e AAPH-indotta è stata valutata spettrofotometricamente a giugno 2014 natural 1 t 77 LABORATORIO una lunghezza d’onda di 540 nm come emoglobina rilasciata nel sovranatante. Il livello di emolisi misurata nei campioni è espresso come percentuale rispetto al controllo. Analisi statistica Tutti i dati sono riportati come media statistica di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard. Per valutare se i parametri antiossidanti determinati in Kavolì I e Kavolì II differiscono in maniera significativa è stato applicato il test t di Student. In presenza di più punti sperimentali (CAA-RBC ed emolisi) è stato utilizzato il test ANOVA a una via per l’analisi della varianza. Le differenze risultano statisticamente significative per p<0,05. Risultati La Tabella 1 mostra i livelli di polifenoli, flavonoidi, flavonoli totali e vitamina C, nonché l’attività antiossidante risultante dal test ORAC nei tipi di cavolo. Tutti i risultati riportati mostrano livelli più elevati del Kavolì I rispetto al II, in particolare i polifenoli, i flavonoidi e la vitamina C, sebbene presenti in elevate quantità in entrambe le tipologie di ortaggio, risultano significativamente più alti nelle foglie del tipo più giovane di Kavolì (p<0,001 per i polifenoli; p<0,0001 per i flavonoidi e la vitamina C). Il livello di flavonoli risulta in entrambi i casi piuttosto basso, ma anche qui si può sottolineare una differenza statisticamente significativa tra il Kavolì I e il II (p<0,001). Per quanto riguarda i risultati del Test ORAC, i dati ottenuti sono in linea con quelli presenti in letteratura relativi ad altri tipi di Brassicacaee. Il Kavolì I risulta avere una maggiore atti- 78 t natural 1 giugno 2014 vità antiossidante in termini di unità ORAC, rispetto al Kavolì II (p<0,05). I risultati dal test CAA-RBC sono riportati nella Figura 1 come area sotto la curva di fluorescenza; il livello di fluorescenza intracellulare degli eritrociti in questo test risulta essere un indice della capacità antiossidante cellulare del composto. Negli eritrociti trattati con Kavolì sia I che II è stato osservato un significativo decremento della fluorescenza intracellulare rispetto alle cellule di controllo (rispettivamente p<0,01 e p<0,05). Il trattamento con Kavolì I ha prodotto risultati sovrapponibili al trattamento con un antiossidante standard, il Trolox alla concentrazione di 100 μM. La Figura 2 mostra i risultati del test di emolisi, riportati come percentuale di emolisi rispetto al controllo. È interessante osservare come gli eritrociti trattati con Kavolì mostrino una maggiore e significativa resistenza all’emolisi eritrocitaria, paragonabile a quella indotta dal trattamento con la concentrazione più alta dello standard antiossidante (Trolox 500 μM). Il Kavolì I risulta più efficiente nel proteggere i globuli rossi dall’emolisi indotta dall’AAPH (p<0,0001), rispetto al Kavolì II (p<0,0005). In conclusione le due tipologie di Kavolì mostrano elevati livelli di polifenoli e flavonoidi, componenti che sicuramente giocano un ruolo fondamentale nella forte attività antiossidante di queste sostanze, attività valutata sia con saggio ORAC che con est CAA-RBC. Il Kavolì I e il Kavolì II risultano efficaci agenti protettivi nei confronti dell’emolisi eritrocitaria. In tutti i test sperimentali effettuati è risultato che il Kavolì I, che rappresenta lo stadio più immaturo del cavolo in oggetto, ha mostrato livelli più elevati di fitochimici a testimoniare una perdita progressiva delle componenti antiossidanti con l’avanzare della crescita e della maturazione della pianta. Un’alimentazione corretta rappresenta probabilmente il più efficace strumento a nostra disposizione per affrontare e vivere al meglio i rischi legati alla salute e all’ambiente; tra gli alimenti sani, le Brassicaceae sono un’ottima fonte di composti nutrienti e benefici, con l’unico ostacolo rappresentato dal sapore deciso che queste assumono una volta cotte, che spesso non viene apprezzato dai consumatori. In questo scenario, il Kavolì, edibile in forma cruda alla stregua di un’insalata, può rappresentare una valida e importante alternativa; inoltre i risultati ottenuti in questo studio dimostrano un elevato potere antiossidante e anti-emolitico di questo cavolo, in grado quindi di sopperire a due importanti richieste dei consumatori/amanti della buona tavola: gusto e salute. * Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, CNR, PISA Bibliografia 1) Arts IC, Hollman PC. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies. Am J Clin Nutr 2005;81(Suppl. 1):317S-25S. 2) Claudio Giovannini, Carmela Filesi, Massimo D’Archivio, Beatrice Scazzocchio, Carmela Santangelo e Roberta Masella. Polifenoli e difese antiossidanti endogene: effetti sul glutatione e sugli enzimi ad esso correlati. ANN IST SUPER SANITÀ 2006 VOL. 42, NO. 3: 336-347. 3) Suboh SM, Bilto YY, Aburjai TA. Protective effects of selected medicinal plants against protein degradation, lipid peroxidation and deformability loss of oxidatively stressed human erythrocytes. Phytother Res. 2004 Apr;18(4):280-4. 4) Kalpana Deepa Priya D, Gayathri R, Gunassekaran GR, Murugan S, Sakthisekaran D. Apoptotic role of natural isothiocyanate from broccoli (Brassica oleracea italica) in experimental chemical lung carcinogenesis. Pharm Biol. 2013 May;51(5):621-8.) 5) Hussain A, Mohsin J, Prabhu SA, Begum S, Nusri Qel-A, Harish G, Javed E, Khan MA, Sharma C. Sulforaphane inhibits growth of human breast cancer cells and augments the therapeutic index of the chemotherapeutic drug, gemcitabine. Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14(10):5855-60 6) Rungapamestry V, Duncan AJ, Fuller Z, Ratcliffe B. Effect of cooking brassica vegetables on the subsequent hydrolysis and metabolic fate of glucosinolates. Proc Nutr Soc. 2007 Feb;66(1):69-81. 7) Chambial S, Dwivedi S, Shukla KK, John PJ, Sharma P. Vitamin C in Disease Prevention and Cure: An Overview. Indian J Clin Biochem. 2013 Oct;28(4):314-328 8) Ninfali P, Mea G, Giorgini S, Rocchi M, Bacchiocca M. Antioxidant capacity of vegetables, spices and dressings relevant to nutrition. Br J Nutr. 2005 Feb;93(2):25766.). 9) Gauthier C, Legault J, Girard-Lalancette K, Mshvildadze V, Pichette A. Haemolytic activity, cytotoxicity and membrane cell permeabilization of semi-synthetic and natural lupane- and ole- anane-type saponins. Bioorg Med Chem. 2009 Mar 1;17(5):2002-8. doi: 10.1016/j. bmc.2009.01.022) 10) Angelino D, Gennari L, Blasa M, Selvaggini R, Urbani S, Esposto S, Servili M, Ninfali P. Chemical and cellular antioxidant activity of phytochemicals purified from olive mill waste waters. J Agric Food Chem. 2011 Mar 9;59(5):2011-8. 11) Wolfe KL, Liu RH. Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods, and dietary supplements. J Agric Food Chem. 2007 Oct 31;55(22):8896-907. 12) Honzel D, Carter SG, Redman KA, Schauss AG, Endres JR, Jensen GS. Comparison of chemical and cell-based antioxidant methods for evaluation of foods and natural products: generating multifaceted data by parallel testing using erythrocytes and polymorphonuclear cells. J Agric Food Chem. 2008 Sep 24;56(18):8319-25. 13) Suwalsky M, Orellana P, Avello M, Villena F. Protective effect of Ugni molinae Turcz against oxidative damage of human erythrocytes. Food Chem Toxicol. 2007 Jan;45(1):13-5 14) Lindau. Songklanakarin. Antioxidant activity and protective effect against oxidative hemolysis of Clinacanthus nutans (Burm.f) J. Sci. Technol., March 2007, 29(Suppl. 1) : 1-9. 15) Singleton V.L. Rossi Joseph A Jr. Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagents - Am. J. Enol. Vitic 1965 vol. 16 no. 3 144-158 16) Kim, D., O. Chun, Y. Kim, H. Moon and C. Lee, 2003. Quantification of phenolics and their antioxidant capacity in fresh plums. J. Agric. Food Chem., 51: 6509-6515 17) Romani A., Mancini P., Tatti S., Vincieri F. Polyphenols and polysaccharidies in Tuscan grapes and wines. Italian Journal of Food Science, 1, 13-24, (1996). 18) Jacota S.K. and Dani H. M. A new colorimetric Technique for the estimation of Vitamin C using Folin Phenol Reagent. Analytical Biochemistry 127, 178-182 (1982). 19) Cao G, Alessio HM, Cutler RG. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radic Biol Med. 1993 Mar;14(3):303-11 20) Mikstacka R, Rimando AM, Ignatowicz E. Antioxidant effect of trans-resveratrol, pterostilbene, quercetin and their combinations in human erythrocytes in vitro. Plant Foods Hum Nutr. 2010 Mar;65(1):57-63.