Diapositiva 1 - e

Preparazione di campioni biologici
per la microscopia ottica
ed elettronica
Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M)
OCULARE
CANNONE
ELETTRONICO
OBBIETTIVI
CONDENSATORE
TAVOLINO PORTA
CAMPIONE
OBBIETTIVO
PORTA CAMPIONE
CONDENSATORE
DIAFRAMMA DI CAMPO
LAMPADA
SCHERMO
FLUORESCENTE
CAMERA
FOTOGRAFICA
Aumentando la
risoluzione aumentano
proporzionalmente
anche gli artefatti e
la loro visibilità
Occhio umano
Microscopio ottico
Microscopio elettronico
a scansione
Microscopio elettronico
a trasmissione
Problematiche…
• la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono
attraversare solo materiale di spessore molto ridotto
• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti
microtomi ed utramicrotomi
• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli
• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito
– Fissazione
– Inclusione
– Congelamento
• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto
• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato
o contrastato
• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse
possono essere combinati nella stessa sezione istologica
Fasi della preparazione
• Prelievo
• Fissazione
• Disidratazione
• Inclusione
• Taglio
• Colorazione
Prelievo
• Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene
il campione da esaminare
• Deve essere eseguito da materiale biologico vivente
• Deve essere eseguito il più velocemente possibile
• Riduzione
10x10x3 mm per la microscopia ottica
Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica
La Fissazione
Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo
stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti
Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone
la morfologia
Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)
FISICA
Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse:
Congelamento in N2 o -30°C
Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino
CHIMICA
Uso di sostanze chimiche:
Perfusione
Immersione
Con vapori
LE ALDEIDI
FORMALDEIDE
• usata in soluzione (4-10%) in
tampone pH 7.4
• elevato potere di penetrazione
( 0.8 mm/h)
• agisce formando legami crociati
con gli aa delle proteine (reversibili)
• preserva una buona morfologia
PARAFORMALDEIDE
• preserva la reattività delle macromolecole
• indicata per indagini biochimiche
La fissazione chimica
Microscopia Ottica
Formaldeide 4-10%
+ Saccarosio 2%
in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
PFA 10%
+ Saccarosio 2%
in PBS pH 7.4
4 ore 4°C
LE ALDEIDI
GLUTARALDEIDE
• penetra bene nei tessuti, ma meno
rapidamente della formaldeide
• forma cross-legami più velocemente
e più stabilmente della formaldeide
La fissazione chimica
Microscopia Elettronica
GA 2-4%
in Tampone Fosfato pH 7.4
2-4 ore 4°C
• non fissa i lipidi, quindi per preservare
le membrane
Post-fissazione con Osmio Tetrossido
• Fissa i lipidi insaturi
• agisce rapidamene, ma penetra
molto poco
Fissativo 2°
• reagisce in modo differente con i
vari componenti cellulari accentuando
le differenze di densità e fornendo una
sorta di colorazione
OsO4 1-2%
In Tampone Fosfato pH 7.4
2 ore 4°C buio
I Tamponi
I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversità
di pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di
osmolarità
Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare
i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore)
PBS
Tampone fosfato di Sorensen
Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M
Tampone Cacodilato
Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M
Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico
La Disidratazione
E’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con un
solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)
La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool
in una scala crescente di concentrazioni
Alcool 70%
Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70%
(T.E.M.)
Alcool 90%
Alcool 100%
Chiarificazione
L’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione
Xilolo
Paraffina
Acetone assoluto
Ossido di propilene
Resine idrofobiche per T.E.M.
Infiltrazione
Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente
lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)
3:1
2:1
1.1
1:2
1:3
Inclusione
E’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza
duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili
PARAFFINA
(M.O.)
• Miscela di idrocarburi saturi
• solida a T ambiente
• punto di fusione a 54-60°
• insolubile in H2O, solubile in xilolo
•
•
•
•
•
RESINE
(T.E.M.)
Epon, Araldite
liquida a T ambiente
polimerizza a 60-70°C
insolubile in H2O, solubile in acetone
si preparano a partire da soluzioni di
monomeri, da sostanze plasticizzanti che
migliorano la consistenza finale del
polimero e da un acceleratore chimico
per la reazione di polimerizzazione
Il campione viene immerso in paraffina
o resina pura per completarne
l’infiltrazione
Polimerizzazione
Resina (T.E.M)
Paraffina (m.o.)
T ambiente
4°C
Blocchetti pronti
per essere
tagliati in
sezioni
60-70°C
Il taglio delle sezioni
MICROTOMO
Strumento che permette di sezionare
i blocchetti di paraffina contenenti il
campione in fette spesse 3-10 uM
La raccolta delle sezioni
Vetrini
Xilanizzati
La colorazione
I coloranti sono di solito in soluzione acquosa.
Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala
decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)
Metodica ematossilina eosina
Ematossilina 10 min
Lavaggio con H2O corrente
Eosina 1 min
Disidratazione
Montaggio
COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA
I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture
che li compongono
ACIDI
BASICI
carica negativa
formano sali con basi
colorano citoplasma
carica positiva
formano sali con acidi
colorano i nuclei
NATURALI
animali : es. carminio (colorante
acido nucleare)
vegetali: es. ematossilina
(colorante acido)
ARTIFICIALI
eosina (colorante basico citoplasmatico)
NEUTRI
formati dall’unione di un
colorante acido con uno
basico
fucsina, violetto di genziana
(coloranti nucleari)
Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con
microtomo a vibrazione
COLORAZIONI
chimiche
fisiche
chimico fisiche
• chimiche: reazione tra colorante e substrato
evidenziano molecole come lipidi
e zuccheri
OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI)
• o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere
• alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi
• o.r.o si deposita al loro posto
P.A.S. (PER ZUCCHERI)
• acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH
degli zuccheri
CHOH-CHOH
CHO-CHO
reagisce con composto fucsina-acido solforoso e
da’ colorazione fucsia
COLORAZIONI
ISTOCHIMICHE
• FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche
Es. impregnazione argentica
Sali d’argento + sostanza riducente
liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche
argentofile (fibre nervose)
• CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico
substrato e colorante hanno cariche diverse e
formano sali fra loro
EOSINA
EMATOSSILINA
ULTRAMICROTOMO
Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina
in sezioni molto sottili
SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui
osservazione al m.o. permette di selezionare i
campi utili destinati ell’esame ultrastrutturale
al T.E.M.
SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore
Il taglio
delle sezioni
Lama di
diamante
Raccolta delle
sezioni
retino
LA COLORAZIONE
• il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione
• piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il
contrasto
• le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H,
C, O)
• le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti
Acetato di Uranile
e
Citrato di Piombo
…un esempio di applicazione
semifini
Sezione trasversale di una foglia
fini
Ultrastruttura di cellule a palizzata