Metodi di analisi di OGM
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Metodi di analisi di OGM Roberta Onori Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Quadro no rmativo Indag ini s ulla e s po s izio ne Attività Pre-marketing me to di di analis i Attività Controllo ufficiale Postmarketing Autocontrollo Metodi di analisi degli OGM ¾ Ditte produttrici ¾ Per verificare le caratteristiche molecolari e la segregazione dell’OGM ¾ Per monitorare la modificazione genetica mella produzione di ibridi ¾ Idustrie alimentari, mangimistiche e sementiere ¾ Per garantire la tracciabilità dei prodotti ¾ Per garantire il rispetto delle normative vigenti ¾ Autorità Competenti ¾ Per l’attuazione del controllo ufficiale da parte dei laboratori competenti ¾ Laboratori privati ¾ Per fornire servizio analitico ai richiedenti Elementi che permettono di individuare la presenza di OGM Presenza del “transgene” Presenza della proteina espressione del transgene inserito Bt toxin crystals METODI ANALITICI per la DIAGNOSTICA degli OGM DNA PROTEINE PCR Tecniche IMMUNOENZIMATICHE (ELISA) Metodi ELISA per la determinazione delle proteine Signal development proteine Recognition Sites (Epitopes) Enzima coniugato Anticorpi Anticorpo di cattura Applicazione di metodi immunologici agli OGM I Metodi rapidi qualitativi I Metodi quantitativi Soia RR e colza Mais Event 176 Mais Bt 11 Metodi rapidi Reservoir Pad Result Window Labelled Filter Cover Reagent Flow Lateral Flow Device Schematic Reagent Flow Reagent Flow Single band Negative Result Two bands Positive Result Metodi quantitativi ELISA Step 1. Campione Step 2. Aliquota da analizzare Step 5. Data analysis Step 4. Estrazione delle proteine Step 3. Dispensazione dell’estratto nei pozzetti della piastra Kit commerciali per l’analisi di OGM BT Cry 1A(b) Metodi ELISA SVANTAGGI VANTAGGI • Materie prime o prodotti non sottoposti a procedimenti tecnologici in grado di denaturare le proteine •Bassi costi rispetto PCR • Impossibilità di discriminare OGM diversi che esprimono la stessa proteina •Velocità del saggio • Non esiste perfetta correlazione fra proteina espressa e % di materiale OGM •Semplicità delle operazioni (effettuabili anche su campo TEST STRIP) Metodi basati sul DNA WT mRNA mRNA Proteina - enzima Proteina - enzima metaboliti OGM P E Gene T P E Gene T metaboliti mRNA mRNA mRNA Proteina - enzima Proteina - enzima Proteina - enzima metaboliti metaboliti metaboliti Metodi basate sul DNA Fasi analitiche di un metodo diagnostico basato sulla PCR Preparazione del campione Estrazione del DNA Valutazione quali-quantitativa del DNA Preparazione dei reattivi della PCR Amplificato PCR Preparazione Campione “Laboratory Sample” Materie prime 10.000 semi (CEN) 2500 2500 Omogeneizzazione/Macinazione Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3 O m o g e n e i t à Aliquota 4 200-300 mg Conservare a –20 qC R a p p r e s e n t a t i v i t à Alimenti processati 2 pacchetti 1 merendina 1 merendina Omogeneizzazione/Macinazione Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3 1-2 g “Test Portion” Estrazione Estrazione DNA DNA Conservare a –20 qC Aliquota 4 Estrazione del DNA (ambiente dedicato) Strumentazione Bagno termostatato Vortex mixer Centrifuga Reagenti e materiali monouso Provette tipo eppendorf da 2 e 1,5 ml Rack Reattivi per l’estrazione (prodotti per biologia molecolare) Kit di purificazione Acqua sterile Puntali sterili con filtro Pipette automatiche dedicate La PCR Reazione a Catena della Polimerasi DNA Primers dNTPs PCR tampone + MgCl2 Taq DNA polymerase Steps in a PCR Cycle Denaturation (90-95 º C) Primer Annealing (40-70 º C) Extension (72 º C) La PCR Reazione a Catena della Polimerasi Curve di amplificazione Numero di molecole di DNA 0 5 10 15 20 25 30 Numero di cicli 35 40 45 Metodi PCR per l’analisi di OGM DNA della pianta gene A gene B DNA della pianta evento specifico 5 PCR specifica pianta 4 PCR specifica construtto costrutto gene 3 PCR specifica del gene 2 PCR di screening OGM O non OGM 1 PCR specifica della specie DNA amplificabile Al DNA si aggiunge una soluzione colorata contenente un addensante che ne facilita il caricamento su un gel di agarosio. Analisi dell’amplificato MWM 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c MWM Zeina (specifico del mais) Lectina (specifico della soia) MWM = Marker Triplicati 1 = Mais 0% OGM 4 = Mais MON810 100% OGM 2 = Mais Bt-11 100% OGM 5 = Soia 0% OGM 3 = Mais Bt-176 100% OGM 6 = SoiaRR 100% GMO Analisi dell’amplificato MWM 1 2 3 4 5 6 7 C MWM 437 bp (Bt-11) 194 bp (MON810) 120 bp (Bt-176) MWM = Marker (Low Ladder 100 bp) 1 = MON810 0.5% OGM 2 = Bt-176 0.5% OGM 3 = Bt-11 0.5% OGM 4 = MON810 + Bt-11 0.25% OGM C= 5= 6= 7= No Template Control MON810 + Bt-176 0.25% OGM Bt-176 + Bt-11 0.25% OGM each MON810 + Bt-11 + Bt-176 0.16% OGM each GMO ? Yes/No *02GHWHFWLRQ Positive Negative 0.5% tolerance *02LGHQWLILFDWLRQ Yes *02TXDQWLILFDWLRQ No Assay individual ingredients Are they Authorised ? Yes/No Illegal Must be Labelled ? Yes/No 0.9% threshold Less than 0.9% No need for labelling More than 0.9% Labelling required Metodi quantitativi per l’analisi di OGM DNA Monitoraggio in TEMPO REALE dell’andamento della PCR Analisi strumentale: REAL TIME PCR Proteine Metodi immunoenzimatici ELISA Raccomandazione EU 787/04 Percentuale di DNA geneticamente modificato: percentuale delle copie di DNA geneticamente modificato rispetto alle copie di DNA specifico del taxon bersaglio, calcolata in termini di genomi aploidi Sonde di ibridizzazione SONDA ad IDROLISI TaqMan Reporter (FAM,VIC, TET) (Fluoresceina) Quencher (TAMRA) (Rodamina) Trasferimento di energia 5’ 3’ Fam Vic Tet Gruppo Fosfato Laser Excitation TaqMan™ Fluorogenic Probe Reporter (FAM,VIC, TET) (Fluoresceina) 5’ Quencher (TAMRA) (Rodamina) Distacco della sonda 3’ Fam Vic Tet Gruppo fosfato Laser Excitation CHIMICA TaqMan Annealing Denaturazione • Polimerizzazione R = Reporter (FAM, VIC) R forward primer Q Q Q = Quencher (TAMRA) 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Taqman PCR Chemistry Denaturation Annealing R = Reporter Q = Quencher • Polymerization R Q Q forward primer 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Taqman PCR Chemistry R = Reporter Q = Quencher R Q Q forward primer 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ reverse primer Taqman PCR Chemistry Denaturation Annealing R = Reporter Q = Quencher • Polymerization R Q Q forward primer 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ . Taglio della sonda R Emissione di fluorescenza Q Q R = Reporter forward primer 5’ Q = Quencher 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 8000 Campione positivo 7000 1st cycle 5th cycle 10th cycle Intensità di Fluorescenza 15th cycle 20th cycle 6000 5000 25th cycle 30th cycle 35th cycle Controllo negativo 40th cycle 45th cycle 50th cycle 4000 3000 2000 1000 EMISSIONE del EMISSIONE del REPORTER QUENCHER 0 480 500 520 540 560 1580 600 Lunghezza wave length (nm) d’onda 620 640 660 REAL-TIME PCR Permette di seguire la cinetica della PCR mentre è in atto: DURANTE LA FASE ESPONENZIALE •Campioni vengono irradiati da una sorgente luminosa Fluorescenza FLUORESCENZA •viene rivelata da una CCD camera sotto il controllo del computer Cicli Riduzione dei tempi di esecuzione dell’analisi Elimina manipolazioni successive VANTAGGI all’amplificazione (minore possibilità di contaminazione tra campioni) Elimina l’impiego di reagenti radioattivi o tossici (EtBr) SISTEMA DI QUANTIFICAZIONE Linea di base della curva Non è ancora misurabile 'Rn Linea soglia Taglia la curva del campione in fase di crescita esponenziale Ciclo soglia (Ct) Ciclo in cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea soglia 0.5% OGM 1%OGM Linea threschold 5%OGM 0.1%OGM Layout della piastra S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4 EN A A A B B B B B B DO 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 GE CCCNTC NTC NTC NO A A A C+ C+ C+ S1 S1 S1 S2 A A A A 1:10 C+ C+ C+ C1 S2 S2 A A 1:10 1:10 C1 C1 S3 S3 S3 S4 S4 S4 B B B B 1:10 B 1:10 B 1:10 NTC NTC NTC C+ controllo positivo C- controllo negativo NTC Amplification reagent control O G M ANALISI QUANTITATIVA OGM QUANTIFICAZIONE RELATIVA DNA SPECIE VEGETALE (lectina, invertasi, DNA GM (Soia RR, mais Bt 176-Bt 11 etc) zeina, HMG) % OGM DNA soia RR X 100 DNA soia ANALISI QUANTITATIVA OGM Calcolata Calcolata sull’ sull’ INGREDIENTE INGREDIENTE Quantificazione relativa DNA della SPECIE DNA GM della Soia RR VEGETALE SOIA (lectina) (EPSPS) DNA GM %OGM = DNA specie CALCOLO DEL CONTENUTO IN OGM Curva di calibrazione costruita con CRM (soia RR Fluka 0,1-0,5-1-2-5% RR) 1 Curva : mette in relazione la differenza in cicli soglia tra target e riferimento in funzione del log %OGM 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 ¨Ct Ct (OGM)-Ct(Lectina) = a log (% OGM) + b -1,5 -1 -0,5 0 0,5 log (% OGM) 1 Metodo della “curva standard” copie genomiche 2 curve di calibrazione (transgene + gene di riferimento) basate sul numero di copie genomiche 35,0 30,0 25,0 Ct Raccomandazione EU 787/04 Percentuale di DNA geneticamente modificato: percentuale delle copie di DNA geneticamente modificato rispetto alle copie di DNA specifico del taxon bersaglio, calcolata in termini di genomi aploidi y = -3.3707x + 37.404 R 2 = 0.9991 20,0 y = -3.4481x + 41.303 15,0 R 2 = 0.9994 10,0 5,0 0,0 0,00 Copie genomiche soia RR Copie genomiche soia x100 1,00 2,00 3,00 4,00 lo g (10) c o pie g e no mic he 5,00 1 copia •LOD valore al di sotto del quale il metodo non consente di determinare la presenza del parametro analizzato •LOQ indica il limite al di sotto del quale il metodo non consente di determinare l’esatta concentrazione del parametro analizzato 20 copie %OGM 0.001% (teorico) 0.01% (pratico) %OGM 0.01% (teorico) 0.1% (pratico) Principi di Base Miniaturizzazione e automazione di saggi biologici centinaia di migliaia di geni usati come sonde su una superficie di 2-3 cm Le sonde vengono attaccate su un supporto solido Con l’aiuto della “Robotica” L’informatica è una componente centrale in tutti gli “step” Tecniche Innovative Extraction of DNA Selective amplification (marker sequences) and labelling Food sample Activated glass surface with fixed specific capture probes Hybridisation of PCR products Diagnosis : presence of sequences specific to the GMO Latest GMOchips design + hy Ctl 3µM + hy Ctl 1.5µM + hy Ctl 750nM + hy Ctl 187.5nM + hy Ctl 93.75nM + hy Ctl 46.875nM + hy Ctl 11.72nM + hy Ctl 5.86nM Bt11 Bt176 - hy Ctl GA21 + hy Ctl 375nM + hy Ctl 23.44nM - hy Ctl Mon810 RRS Starlink a Starlink d Starlink e Starlink f OXY235-1 OXY235-2 OXY235-3 Mais Soybean Rapeseed T25,T45,Topas Tomato nptII test EF Bt11 Sugar beet CaMV test (a) EF Bt176 P35S test Tnos test CaMV test (b) Pat gene EF GA21 EF Mon810 EF RRS EF Starlink buffer buffer Fix Ctl 2.5nM Fix Ctl 5nM Fix Ctl 10nM Fix Ctl 20nM Fix Ctl 40nM Fix Ctl 80nM Fix Ctl 160nM EF T25 GMOchips T25 Mais Pos Hyb CTL Neg Hyb CTL Specific capture probes for Bt11 Capture probe for Pat gene Specific capture probes for T25 Specific capture probes for Mon810 Pos Fix CTL Specific capture probes for Bt176 Specific capture probes for GA21 Specific capture probe for RRS Capture probe for P35S
