Organismi modello
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APPENDICE Organismi modello Batterio, Escherichia coli Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae Muffa del pane, Neurospora crassa Nematode, Caenorhabditis elegans Arabetta comune, Arabidopsis thaliana Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster Topo domestico, Mus musculus Gli uomini si distinguono dagli altri organismi per le loro capacità cognitive e per lo stupore nei confronti di ciò che li circonda, ed è questa curiosità che ci porta a studiare la vita. Come siamo fatti? Come funzioniamo? Per comprendere gli uomini e le altre creature viventi, i ricercatori hanno studiato una grande varietà di organismi viventi. Questi studi hanno portato a molte scoperte, comprese alcune incredibili caratteristiche universali condivise da tutti gli esseri viventi. Tutti gli organismi usano gli stessi amminoacidi, gli stessi nucleotidi e praticamente lo stesso codice genetico. Nella biologia molecolare c’è qualcosa di più del desiderio di soddisfare la nostra curiosità sul funzionamento della vita. Cerchiamo anche di comprendere le cause delle malattie e di applicare le nostre conoscenze alla medicina, all’agricoltura e alla tecnologia. In questo libro diverse volte abbiamo riportato parecchi esempi di come abbiamo acquisito informazioni sulle malattie umane, le loro cause e talvolta su come affrontarle, curarle o prevenirle. Gli scienziati hanno scoperto gli antibiotici per curare la maggior parte delle infezioni batteriche, sviluppato vaccini per molti tipi d’infezioni virali e oggi sanno molto di più sul cancro e sono disponibili più terapie. La maggior parte di queste scoperte e progressi deriva dallo studio degli organismi modello. Pochi organismi costituiscono dei modelli per la comprensione dei processi vitali comuni Gli scienziati studiano vari organismi. Quando una specie particolare viene scelta da molti laboratori per ricerche intense viene definita organismo modello. Questo interesse per una specie da parte di molti laboratori permette di ottenere una grande quantità di informazioni che ci forniscono conoscenze approfondite sulle funzioni di quell’organismo vivente. L’organismo è considerato un modello perché i ricercatori ipotizzano che quello che hanno appreso su di esso sarà vero anche per organismi affini. Lo specifico organismo selezionato per uno studio dipende dal problema in esame. In questo libro, abbiamo visto il contributo degli organismi modello alla nostra conoscenza di biologia molecolare e molti degli organismi utilizzati più frequentemente vengono passati in rassegna in questa Appendice. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 2 APPENDICE Organismi modello Dobbiamo osservare, però, che a volte, un organismo che si trova “fuori dal cammino tracciato” viene studiato solamente da pochi laboratori, semplicemente per curiosità e anche questi studi possono avere un grande impatto sulla ricerca. Per esempio, Thermus aquaticus ci ha fornito la Taq polimerasi per la reazione a catena della polimerasi (PCR; vedi Capitolo 7 Come è stato scoperto). Lo studio di Tetrahymena thermophila ha portato a scoprire gli RNA catalizzatori (come i ribozimi; vedi Capitolo 16). E gli studi di alcuni virus poco noti degli insetti, i baculovirus, hanno dato origine a sistemi di espressione delle proteine ricombinanti oggi ampiamente utilizzati (vedi Capitolo 7). Focalizzare l’attenzione su pochi organismi diversi è importante a livello pratico perché ci sono molte più specie che scienziati. In effetti, fare di un organismo uno strumento scientifico per la ricerca non è semplice. Sono necessari molti anni di studio per comprendere l’organismo e acquistare familiarità con il suo ciclo vitale, la sua corretta alimentazione, la sua crescita ottimale e le condizioni di conservazione. Particolarmente dispendioso in termini di tempo è lo sviluppo di tecniche genetiche per la manipolazione del genoma dell’organismo. Non ci sono “procedure standard” per questo; le tecniche genetiche sono per lo più specifiche per quell’organismo e spesso vengono trovate per tentativi ed errori. Questa è la ragione per cui è importante che molti laboratori lavorino sullo stesso organismo e condividano le loro conoscenze. Una massa critica d’interesse per un organismo modello porta alla fine a congressi internazionali, banche dati online, e alla formazione di centri di stoccaggio che mantengono e distribuiscono i ceppi. Perché fra tutti gli organismi esistenti al mondo ne sono stati scelti proprio alcuni? Le scelte sono spesso state fatte con una buona dose di casualità. Tuttavia, alcune caratteristiche comuni sottolineano l’utilità di un organismo come modello. Gli organismi modello devono avere un ciclo di vita rapido. Devono dar vita a un’ampia progenie, così che i ricercatori possano trovare e studiare eventi genetici rari. Anche la dimensione è importante, perché gli organismi grandi e la loro ampia progenie esaurirebbero velocemente lo spazio di un laboratorio. Gli organismi modello dovrebbero potersi propagare velocemente usando una fonte alimentare semplice ed economica. Ci dovrebbe essere un modo conveniente per una conservazione a lungo termine in modo da poter accumulare i ceppi per studi successivi. La Tabella A.1 riassume alcune caratteristiche degli organismi modello qui descritti. Gli studi di genetica e delle vie metaboliche dei primi anni del Novecento utilizzarono organismi pluricellulari complessi come le piante, i moscerini della frutta, i ratti e i topi. Poi i ricercatori si accorsero che © 978-88-08-19531-9 anche gli organismi unicellulari sono idonei per studi fondamentali sui geni e sul metabolismo cellulare. Negli anni Quaranta, microrganismi come Escherichia coli, il lievito e Neurospora crassa sono diventati i modelli più utili per la comprensione della chimica di base della vita. Forniscono anche un materiale di partenza migliore per i biochimici rispetto ai tessuti animali, perché gli organismi unicellulari sono una popolazione di cellule identiche, mentre i tessuti sono costituiti da tipi cellulari diversi. Nessun organismo modello può fornire le risposte a tutte le domande sulla vita. Gli organismi unicellulari continuano a dirci molto sugli aspetti centrali dei processi fondamentali della vita, come la replicazione cromosomica, la riparazione del DNA, la ricombinazione, l’espressione genica, le vie di trasduzione del segnale e il controllo del ciclo cellulare. Ma gli organismi unicellulari non sono sufficienti per rispondere a domande sullo sviluppo degli organismi pluricellulari e sulla maggior parte delle malattie. Per questo vengono molto utilizzati il verme nematode e il moscerino della frutta, per scoprire come sono organizzati gli organismi pluricellulari e per i fondamenti di base di come è determinato il piano di sviluppo corporeo animale. Questi organismi ci forniscono anche informazioni su molti tipi di malattie. Allo stesso modo, Arabidopsis thaliana è stata scelta come organismo modello per lo sviluppo delle piante. Fra tutti, il modello più utile per lo studio delle malattie umane è il topo. Questo non è però il più semplice tra gli organismi modello. Per facilità di allevamento e manipolazione del DNA, il topo crea molte più difficoltà degli altri organismi modello. Ottenere ceppi di topo geneticamente alterati è costoso e lungo. Ma uno dei grandi vantaggi del topo è che il 99% dei suoi geni ha degli omologhi nell’uomo, e tra questi ci sono anche geni associati a malattie umane. Quindi, nonostante le difficoltà, il topo è un modello interessante per studiare le malattie che ci colpiscono. In questa Appendice presentiamo una breve panoramica dei diversi organismi modello oggi in uso, spiegando anche come hanno contribuito e continuano a contribuire alla nostra comprensione della vita. Come abbiamo notato, anche molti altri organismi hanno contribuito significativamente alla nostra comprensione dei processi viventi, tra cui i batteriofagi e altri virus, Tetrahymena thermophila (un protozoo), Schizosaccharomyces pombe (un lievito che si divide per scissione), Xenopus laevis (un rospo), e Brachydanio rerio (pesce zebra). Prima di entrare nei dettagli di particolari organismi modello, descriviamo brevemente alcuni episodi di come, studiando gli organismi modello e utilizzando la genomica e le tecniche di coltura cellulare, abbiamo ampliato le nostre conoscenze sulle malattie umane. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore Intestino dell’animale 1-2 μm Fissione asessuata; a volte coniugazione 20 minuti Capsule Petri o colture liquide Estratto di lievito e brodo di triptoni; si possono usare terreni definiti Stock congelati in glicerolo; cellule liofilizzate Habitat naturale Dimensione Riproduzione Tempo di generazione Condizioni di crescita Fonte alimentare Conservazione Caratteristiche di base Tipo di organismo Batterio unicellulare E. coli M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore Stock congelati in glicerolo; cellule liofilizzate Estratto di lievito, peptone; si possono usare terreni definiti Capsule Petri o colture liquide 70-90 minuti Asessuata, gemmazione (mitosi); sessuata, sporulazione (meiosi) 4-6 μm Superficie delle piante Eucariote, fungo ascomicete unicellulare S. cerevisiae Spore congelate-anidre Mezzi completi o definiti (zuccheri, sali inorganici, biotina e azoto) Capsule Petri, provette graduate o coltura liquida 3-4 settimane (per riproduzione sessuata) Asessuata, formazione di filamenti; asessuata, sporulazione Irregolare Eucariote, fungo ascomicete filamentoso multinucleato Vegetazione morta N. crassa TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni 10-20 cm Clima temperato globale Eucariote, pianta angiosperma A. thaliana 2,5 mm Frutta marcia Eucariote, insetto D. melanogaster Congelati a –80 °C Batteri (E. coli) Capsule Petri o colture liquide 50 ore Semi Luce, acqua, fonte di azoto e altri minerali (per esempio fertilizzanti) Capsule Petri o piccoli vassoi orticoli 6 settimane Propagazione vitale Lievito e melassa, frutta Bottiglie o provette 12 giorni Sessuata, auto- e Sessuata, auto- e Sessuata, cross-fecondazione; cross-fecondazione accoppiamento alcuni asessuati 1 mm Suolo Eucariote, verme nematode C. elegans (segue) Embrioni congelati Sostanze vegetali Gabbie 9 settimane Sessuata, accoppiamento 17 cm Abitazioni, campi Eucariote, mammifero M. musculus © 978-88-08-19531-9 APPENDICE Organismi modello 3 1 (aploide) 4 639 675 bp Numero di geni 4410 Geni simili all’uomo 8% Nomenclatura dnaA genica convenzionale Nomenclatura DnaA proteica convenzionale Sito web www.ecocyc.org del genoma Numero di cromosomi Statistica genetica Dimensione del genoma E. coli ww.broadinstitute. www.wormbook.org w org/annotation/ genome/ neurospora/ MultiHome.html www.yeastgenome. org FEM-3 arg Gcn4 21 035 25% fem-3 11 (diploide, maschio), 12 (diploide, ermafrodita) 100 269 917 bp C. elegans 11 000 6% arg 7 (aploide); 14 (diploide) 42 900 000 bp N. crassa 6000 30% GCN4 16 (aploide); 32 (diploide) 12 070 898 bp S. cerevisiae TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni (continua) RY 14 065 50% ry 8 (diploide) 166 600 000 bp D. melanogaster www.arabidopsis.org www.flybase.org AAO 25 540 18% AAO 10 (diploide) 119 186 997 bp A. thaliana www.jax.org Cdc20 29 083 99% Cdc20 40 (diploide) 2 729 273 687 bp M. musculus 4 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 5 © 978-88-08-19531-9 Per studiare le malattie umane si usano tre metodi Che cosa determina un infarto, il diabete, le malattie neurodegenerative o il cancro? Come possono queste o altre malattie essere prevenute, trattate o curate? Lo studio degli organismi modello è in genere il primo passo per comprendere i processi cellulari che possono essere modificati nelle malattie umane. Usando un omologo, possiamo studiare una mutazione che porta a una malattia umana in un organismo modello e capire come la mutazione alteri processi molecolari, cellulari o dell’organismo. Inoltre, i modelli murini sono spesso usati per valutare approcci terapeutici per le malattie, come primo passaggio nello sviluppo di un farmaco. Gli organismi modello sono spesso il primo passo per la comprensione delle malattie umane, ma la genomica umana e le colture cellulari possono fornire una comprensione ancora più profonda. La disponibilità della sequenza del genoma umano completa è stata di enorme aiuto sia per la comprensione a livello molecolare dei geni coinvolti nelle malattie umane, che per gli studi bioinformatici sull’evoluzione umana e sulle migrazioni (vedi Capitolo 8). Importanti sono stati i progressi nella comprensione della genetica delle malattie umane. In particolare, le persone cercano attivamente opinioni mediche e scientifiche su una malattia e spesso possono costruire un albero genealogico familiare andando indietro per generazioni, che può fornire informazioni sulla modalità di trasmissione della malattia. In questo testo vi sono esempi di tutto ciò, come l’emofilia nella famiglia reale (vedi Figura 2.27), l’anemia falciforme (vedi Approfondimento 2.1) e l’Alzheimer a esordio rapido (vedi Figura 8.11). L’identificazione dei geni coinvolti nelle malattie umane è un compito difficile ma importante e si sta realizzando sempre più velocemente. La conoscenza della genetica coinvolta nella trasmissione di una malattia può aiutare le coppie a pianificare le loro famiglie e ad affrontare le possibili malattie che possono essere trasmesse ai figli o alle figlie. Per i ricercatori, la conoscenza di un gene responsabile di una malattia può aiutare a sviluppare un trattamento o una cura. Un terzo modo con cui studiamo noi stessi è mediante la coltivazione di specifiche cellule umane in vitro. Le cellule primarie, prese direttamente dal corpo e poi cresciute in coltura, muoiono di norma in 40 (o meno) generazioni. Ma le cellule ottenute dal tessuto tumorale hanno un controllo della crescita alterato e spesso possono essere fatte crescere per un indefinito numero di generazioni; sono dette, quindi, “immortalizzate”. A volte le cellule possono essere perfino rimosse dal tessuto normale e poi immortalizzate in coltura mediante l’infezione con particolari virus. Con questi e altri mezzi, vengono cresciuti e mantenuti in coltura molti tipi diversi di cellule di tessuti umani, tra cui gli epatociti (fegato), le cellule renali (rene), i fibroblasti (pelle), le cellule gliali (tessuto nervoso), i linfociti (sangue) e i miociti (muscoli). Analizzando le cellule cancerose e gli agenti di trasformazione, abbiamo anche imparato molto sui geni coinvolti nel cancro (vedi Approfondimento 12.1). Gli studi di colture cellulari di cellule umane e di altri primati hanno fornito importanti informazioni sui recettori di superficie, sul traffico proteico, sull’infezione virale e sulla riproduzione cellulare. Le cellule umane possono anche essere fatte crescere in quantità idonee agli studi biochimici (vedi Capitolo 7). Gli studi recenti nel campo della ricerca sulle cellule staminali sono promettenti per il trattamento di molte malattie e per lo sviluppo di tessuti sostitutivi (vedi Capitolo 22). M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 6 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Batterio, Escherichia coli Escherichia coli è un batterio unicellulare, che risiede normalmente nell’intestino animale e in genere non è dannoso, anche se esistono rare varietà tossiche. E coli è piccolo (microscopico), si riproduce Janice Haney Carr/CDC velocemente per scissione, formando colonie di cloni sulle piastre di agar, producendo decine di milioni di cellule in un giorno e può crescere anche sui mezzi liquidi, producendo un numero incredibile di cellule figlie, una caratteristica importante per studi di eventi genetici rari. E. coli ha un solo cromosoma circolare, e studiare i mutanti è molto più facile in un organismo aploide che diploide, perché non ci sono geni dominanti a mascherare la mutazione. Fenotipi mutanti comuni sono la resistenza ai batteriofagi, la capacità di crescere su alcune fonti di carbonio, la resistenza agli antibiotici e la dimensione e forma della colonia. E. coli fornisce anche una ricca e uniforme fonte di materiale di partenza per studi biochimici. Quindi, lo studio di E. coli combina la forza della genetica con il potere della biochimica per comprendere i processi vitali a livello molecolare. E. coli non è un eucariote e quindi ha poca omologia con gli uomini. Questo limita la sua utilità nello studio di tutti i processi tranne di quelli cellulari di base. Per esempio, E. coli è privo di nucleosomi e nella maggior parte le sue proteine non sono modificate. Le proteine eucariotiche espresse in E. coli trasformato a volte non funzionano, perché richiedono modificazioni post-traduzionali che il batterio non riesce a compiere. I primi studi con E. coli come organismo modello L’unione della biochimica e della genetica rese E. coli una ricca risorsa per la scoperta di nuove informazioni. Il famoso “test di fluttuazione” di Salvador Luria e Max Delbruck nel 1943 dimostrò che E. coli muta spontaneamente per diventare resistente al batteriovirus a e trasmette questa resistenza al fago alla nuova progenie, rendendo quindi E. coli un sistema modello per comprendere la natura e la funzione dei geni. La scoperta da parte di Joshua Lederberg e Edward Tatum che E. coli va incontro a una sorta di incrocio e crossing over (coniugazione del DNA mediata dal plasmide F) rende possibile lo scambio del DNA e i saggi di complementazione e rende E. coli un valido modello per la genetica. Nel 1952, Alfred Hershey e Martha Chase usarono E. coli per dimostrare che il DNA è il materiale genetico del fago T2 (vedi Capitolo 2, Come è stato scoperto). Nel 1958, Matthew Meselson e Frank Stahl selezionarono E. coli per i loro studi, per dimostrare che la replicazione del DNA avviene con un meccanismo semiconservativo (vedi Figura 11.1). Nello stesso anno, Arthur Kornberg e i suoi collaboratori pubblicarono i risultati sulla purificazione e la caratterizzazione della prima DNA polimerasi scoperta (vedi Capitolo 11, Come è stato scoperto). Francis Crick e Sydney Brenner usarono la genetica di E. coli per stabilire la tripla natura del codice genetico nel 1961. Nel 1966 il codice genetico era stato descritto da Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei, Gobind Khorana e i loro collaboratori, usando oligonucleotidi sintetici ed estratti di E. coli (vedi Capitolo 17). Il lavoro di François Jacob e Jacques Monod con gli studi dettagliati dell’operone lac aveva aperto un’era completamente nuova della ricerca sulla regolazione genica (vedi Capitolo 20 e Capitolo 5, Come è stato scoperto). L’identificazione di plasmidi in E. coli e delle tecniche per maneggiarli ci ha portato nell’era della tecnologia del DNA ricombinante. I plasmidi continuano a essere degli strumenti meravigliosi per le biotecnologie, dal valore ancora incommensurabile (vedi Capitolo 7). Ciclo vitale Come la maggior parte dei batteri, E. coli si riproduce per scissione binaria (Figura A.1). Man mano che la cellula cresce, percepisce quando ha raggiunto la dimensione giusta per iniziare la replicazione. I cromosomi duplicati si distribuiscono ai poli opposti della cellula. La citochinesi divide la cellula a metà, formando due cellule figlie, ciascuna delle quali contiene un cromosoma identico. L’intero processo richiede solamente 20 minuti circa a 37 °C, la temperatura corporea media dei mammiferi. Quindi in appena 24 ore su una piastra Petri contenente un mezzo completo si forma una colonia grande e visibile, con milioni di batteri identici. Grosse quantità di E. coli possono essere cresciute anche in una coltura liquida in un giorno. Tecniche genetiche Per una descrizione completa di molte di queste tecniche vedi Capitolo 7. Mutagenesi La frequenza di mutazione in E. coli può es- sere aumentata con sostanze chimiche o con la luce UV. Le cellule mutanti possono essere selezionate in base al fenotipo oppure ricercate mediante piastratura delle repliche su mezzi di coltura diversi. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 7 © 978-88-08-19531-9 ni positivi (cellule che sopravvivono in condizioni in cui il mutante non sopravvive) possono poi essere sequenziati per identificare il gene di complementazione. E. coli DNA Il ciclo si ripete Replicazione del DNA Espressione di una proteina ricombinante La crescita ve- loce e non costosa di E. coli fa di questo organismo il veicolo più ampiamente usato per l’espressione e la purificazione di proteine estranee. Queste in genere sono espresse da geni posti su plasmidi presenti in un elevato numero di copie. L’espressione è indotta usando elementi di regolazione derivanti da promotori ben noti di E. coli e di fagi. Formazione delle cellule figlie E. coli come organismo modello ai nostri giorni Citochinesi Separazione dei filamenti di DNA FIGURA A.1 Il ciclo vitale di Escherichia coli. Plasmidi E. coli possiede molti plasmidi naturali che pos- sono portare del DNA estraneo nella cellula. Questi plasmidi sono utili ai ricercatori per far esprimere delle proteine, come vettori navetta, o per costruire e sequenziare grossi genomi. Macchine multiproteiche Gli studi biochimici e struttura- li stanno oggi descrivendo i dettagli atomici di strutture e processi di trasferimento dell’informazione che un tempo erano sconosciuti. Tra questi ci sono la struttura e la funzione dell’apparato di replicazione del DNA, delle proteine di riparazione e ricombinazione del DNA, della regolazione dell’RNA polimerasi e della struttura e della chimica del ribosoma. Queste strutture e processi multiproteici si trovano sia nei batteri che negli eucarioti, ma sono esemplificati nella semplice cellula di E. coli. Studi citologici I processi possono essere visualizzati nel- Introduzione di DNA Mediante trasformazione chimica o con l’elettroporazione, E. coli può essere reso in grado di accettare del DNA estraneo. Le cellule trasformate con un plasmide contenente un gene per la resistenza all’antibiotico possono essere selezionate e mantenute aggiungendo l’antibiotico al mezzo di coltura. le cellule viventi di E. coli grazie all’uso di proteine di fusione fluorescenti. Per esempio, studi recenti di questo tipo hanno permesso di rilevare le proteine coinvolte nella replicazione del cromosoma e il loro movimento lungo il cromosoma durante la replicazione. Tecnologia del DNA ricombinante E. coli detiene una po- Knockout genico I plasmidi privi di un’origine di replica- zione ma contenenti un gene che conferisce resistenza a un antibiotico possono essere selezionati per essere integrati in un cromosoma batterico. L’integrazione di norma viene ottenuta con la ricombinazione omologa, utile per la delezione genica, o knockout. sizione centrale nella tecnologia del DNA ricombinante. I suoi plasmidi sono ampiamente usati come vettori navetta per amplificare e mantenere le librerie di DNA di altri organismi. E. coli è ancora uno dei veicoli più utilizzati per l’espressione e la purificazione di proteine estranee. Biologia dei sistemi Il suo genoma piuttosto piccolo fa Complementazione Questa tecnica viene spesso utilizza- ta per dimostrare che una mutazione si trova in un gene particolare e consiste nell’aggiunta di un gene wild-type che ristabilisca la funzione. L’analisi di complementazione delle cellule mutanti può essere effettuata con plasmidi che contengono una copia wild-type del gene d’interesse. L’analisi di complementazione di mutazioni sconosciute spesso utilizza una libreria di plasmidi genomici. I clo- di E. coli un sistema interessante in cui tentare studi di biologia dei sistemi. Sono stati costruiti chip di DNA per esaminare la risposta di ogni trascritto in molte condizioni diverse. La funzione di circa il 35% dei geni di E. coli è ancora sconosciuta e una raccolta genomica di knockout dei geni di questo batterio sta permettendo di assegnare una funzione a questi geni e di identificare nuove reti di interazioni geniche. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 8 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae è un fungo ascomicete microbico, usato per secoli dagli uomini per fare il pane, la birra e il vino. Generalmente gli scienziati lo chiamano lievito gemmante, ma è detto anAlamy che lievito del pane, lievito di birra o semplicemente lievito. Il lievito ha molte caratteristiche che lo rendono adatto come organismo modello. È un organismo unicellulare aploide, si riproduce velocemente nei terreni liquidi, forma colonie clonali sulle piastre di agar e può essere conservato congelato. Come per E. coli, queste caratteristiche fanno del lievito un eccellente organismo modello per studiare la genetica e la biochimica di processi vitali fondamentali, come la replicazione, la trascrizione e la traduzione. Però, a differenza di E. coli, il lievito è un eucariote dotato di tutti gli organelli intracellulari, come i mitocondri e il nucleo, ha il DNA compattato nella cromatina e una struttura citoscheletrica. Quindi S. cerevisiae è un modello adatto per studiare meccanismi unici degli eucarioti, come il controllo del ciclo cellulare, la regolazione delle proteine mediante fosforilazione, la struttura cromosomica e la funzione mitocondriale. Il genoma di S. cerevisiae è lungo solamente 12 Mbp e contiene circa 6000 geni. Contiene anche omologhi di molti geni umani responsabili di malattie e questo lo rende un modello per la comprensione delle funzioni di base dei prodotti genici coinvolti in alcune malattie; inoltre questi omologhi indicano come alcune malattie umane derivino dalla distruzione di processi vitali piuttosto semplici e fondamentali. Però, il lievito unicellulare non serve come modello di sviluppo e le molte malattie umane che derivano da mutazioni che provocano difetti dello sviluppo non possono essere studiate nel lievito, limitandone l’utilità nella ricerca medica. La natura aploide del lievito rende possibili alcuni utili studi di mutazione. Il lievito viene anche facilmente trasformato con il DNA esogeno. Il DNA si integra frequentemente nel cromosoma per ricombinazione omologa, rendendo possibile la costruzione di ceppi knockout per un gene specifico. La facilità della genetica, unita alla facilità di crescita, fa di S. cerevisiae, come di E. coli, un organismo modello che combina perfettamente gli studi genetici con quelli biochimici. I primi studi con il lievito come organismo modello zucchero ad alcool e CO2, e stabilì che la fermentazione è una forza vitale che non può essere separata dagli organismi viventi. Nel 1897, Eduard Buchner notò casualmente che un estratto di cellule di lievito fermentava e chiamò la sostanza fermentante “zimasi”. Studi successivi dimostrarono che la zimasi era di fatto una miscela di molti enzimi differenti. Il suffisso –asi è usato per molti nomi di enzimi anche oggi. Ciclo vitale Il lievito gemmante può esistere sia allo stato aploide che diploide (Figura A.2). Entrambe le cellule aploidi e diploidi si possono riprodurre asessualmente per gemmazione. Il sesso in S. cerevisiae è determinato dai prodotti del gene del locus del tipo sessuale (MAT), per il quale esistono due alleli, a e a (vedi Figura 13.22). Aploidi di tipi sessuali diversi possono essere incrociati per formare dei diploidi piastrandoli insieme. Il lievito diploide a/a può essere convertito allo stato aploide in terreni che lo inducono a sporulare, andando incontro a meiosi per produrre quattro spore aploidi contenute in un asco. La tetrade di spore può essere dissezionata con un micromanipolatore e ciascun fenotipo aploide può essere analizzato dopo che le spore sono cresciute formando delle colonie. Tecniche genetiche Mutagenesi Gli studi mutazionali in S. cerevisiae sono semplificati dalla sua capacità di crescere come aploide. Il lievito può essere replicato su piastra per studiare i fenotipi mutanti per la capacità di crescere su fonti di carbonio differenti e per cercare la presenza di geni letali condizionali (per esempio geni che, se mutati, permettono all’organismo di crescere solamente a particolari temperature). Complementazione Il lievito aploide può essere incrocia- to per produrre cellule diploidi per l’analisi di complementazione dei mutanti aploidi. Le mutazioni nei geni essenziali possono essere mantenute portandoli allo stato diploide. Quando un diploide con una mutazione in un gene essenziale va incontro a sporulazione, due delle quattro spore non saranno vitali. L’isolamento di tutti e quattro i prodotti della meiosi in un asco è utile per l’analisi della ricombinazione durante la meiosi. Introduzione del DNA Il DNA può essere introdotto in S. Il lievito è stato un organismo modello per più di cento anni e, di fatto, ha dato origine alla biochimica moderna. Louis Pasteur dimostrò che il lievito fermenta lo cerevisiae per abrasione chimica o fisica della spessa parete cellulare. Il DNA lineare, con un marcatore selezionabile ed estremità omologhe al cromosoma, s’integra fa- M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 9 © 978-88-08-19531-9 del genoma (vedi Figura 7.7). Inoltre, S. cerevisiae è dotato di un plasmide naturale di 2 m che può essere usato per mantenere nella cellula il DNA esogeno. Tetrade di spore a a a Il lievito come organismo modello ai nostri giorni Asco di S. cerevisiae Sporulazione (meiosi) a a Gemmazione aploide (mitosi) a a Gemmazione aploide (mitosi) Meccanismi fondamentali di trasmissione dell’informazione La struttura semplice e unicellulare, la capacità di a crescere in grandi quantità per studi biochimici e la facilità della manipolazione genetica, tutto ciò rende il lievito ideale per lo studio di meccanismi dettagliati dei processi fondamentali, quali la replicazione, la regolazione genica, la riparazione del DNA, la trascrizione, la traduzione e la ricombinazione. a/ Il ciclo di divisione cellulare Quando il lievito si divide, la a/ Gemmazione a/ diploide a/ (mitosi) a/ a Incrocio FIGURA A.2 Il ciclo vitale di Saccharomyces cerevisiae. cilmente nel genoma per ricombinazione omologa. Questa configurazione può portare le estremità a ricombinare con le sequenze a loro omologhe nel cromosoma di lievito, sostituendo il gene d’interesse con un marcatore selezionabile e distruggendo il gene. gemma è visibile al microscopio così come i cambiamenti di forma nelle diverse fasi del ciclo cellulare. L’accumulo di cellule mutate, bloccate nella fase gemmante, è stato usato come fenotipo tramite il quale identificare diversi mutanti del ciclo cellulare (cdc), utili per la dissezione genetica e biochimica del ciclo cellulare. Gli uomini hanno omologhi di molti dei geni del ciclo cellulare scoperti nel lievito. Le vie di trasduzione del segnale Il lievito è un model- lo per lo studio delle vie di trasduzione del segnale, come quelle coinvolte nelle risposte di accoppiamento ai feromoni prodotti da cellule di tipi sessuali opposti. Ricombinazione meiotica Dato che S. cerevisiae produce un asco con quattro spore derivanti da una sola cellula, i ricercatori possono seguire gli eventi che avvengono durante la meiosi. Questo ha portato a modelli molecolari dettagliati della ricombinazione meiotica. Marcatori selezionabili La selezione nel lievito è effettua- ta principalmente con gli auxotrofi, ceppi che sono privi di un gene che codifica un enzima di una via della biosintesi degli amminoacidi e quindi richiedono quell’amminoacido per crescere. Le cellule vengono fatte crescere in mezzi definiti privi di quell’amminoacido ora essenziale. Solamente le cellule che hanno acquisito il marcatore e quindi sono in grado di sintetizzare l’amminoacido a partire da materiale grezzo sopravviveranno. Per la selezione possono anche essere usati marcatori di resistenza ai farmaci. Plasmidi Il DNA può anche essere mantenuto nel lievito come plasmide circolare, usando una fra le tante origini cromosomiche note come ARS (autonomously replicating sequence, sequenza di replicazione autonoma). Gli YAC (yeast artificial chromosome, cromosomi artificiali di lievito) possono mantenere inserti molto grandi (da 300 kbp a 1 Mbp), e questo è utile nei progetti di sequenziamento Biologia dei sistemi Uno degli scopi della biologia dei si- stemi consiste nel comprendere la maggior parte delle interazioni genetiche, fisiche e molecolari dei 6000 geni di lievito. Allo stesso modo lo studio delle interazioni genetiche tra i knockout di questi geni sta portando alla scoperta di nuove vie. Gli approcci proteomici sono stati usati per le prime volte nel lievito. È stato determinato il numero delle copie intracellulari di quasi tutte le proteine di lievito su tutto il genoma. Sono state determinate anche le interazioni proteina-proteina e proteina-RNA a livello globale, usando le tecniche del doppio ibrido e del triplo ibrido (vedi Capitolo 7) e la spettrometria di massa dei complessi proteici. Gli studi di biologia cellulare sono facilitati da una libreria di marcatori proteici fluorescenti posti, nel genoma di lievito, in ogni cornice di lettura aperta. Inoltre, il lievito è usato come sistema di espressione proteica per lo studio di geni esogeni. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 10 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Muffa del pane, Neurospora crassa La muffa del pane, Neurospora crassa, è un fungo ascomicete filamentoso. È stato uno dei primi microrganismi eucariotici utilizzato per studi genetici. All’incirca il 75% di tutti i funWoodfall Wild Images/Photoshot ghi è ascomiceto; la restante parte è data dai basidiomiceti (funghi). Circa il 90% degli ascomiceti è filamentoso (ovvero multinucleato, come spiegato meglio di seguito), mentre il resto è costituito da lieviti unicellulari. Il genoma di N. crassa (spesso detto semplicemente Neurospora) è dato da circa 43 Mbp e 11 000 geni, paragonabile al moscerino della frutta per complessità genomica. La lotta tra funghi filamentosi e batteri ha prodotto importanti antibiotici, inclusa la penicillina. Queste molecole organiche complesse non si trovano da nessuna altra parte in natura e, in accordo con ciò, più del 40% dei geni di Neurospora non ha una controparte simile in nessun altro organismo studiato. La nicchia ecologica occupata dai funghi filamentosi comprende molti tipi di materiali biologici in decomposizione. Questo può spiegare perché Neurospora può crescere su fonti di carbonio e azoto insolite, il che probabilmente si riflette nella presenza di altri geni insoliti. Una caratteristica unica di Neurospora è la disposizione delle spore prodotte dalla meiosi di un solo nucleo diploide nell’apposito involucro (asco). Le spore sono disposte linearmente nell’ordine in cui sono state prodotte con le divisioni meiotiche. Con la possibilità di separare le spore precisamente e di studiarle singolarmente, i ricercatori hanno un modello ideale per l’analisi della ricombinazione meiotica. Neurospora è interessante anche per lo studio di numerosi meccanismi di silenziamento genico, alcuni dei quali esistono anche negli eucarioti pluricellulari. I primi studi con Neurospora come organismo modello All’inizio Neurospora è stato un modello importante per il suo stato aploide, la sua crescita veloce, la produzione di milioni di spore per colonia e la facilità di coltura su terreni semplici e definiti. Negli anni Quaranta, la capacità di sintetizzare tutte le biomolecole essenziali a partire da terreni di coltura dalla composizione nota ha velocemente portato Neurospora alla ribalta, come modello ideale in cui studiare la genetica delle vie metaboliche conservate in tutte le cellule. Un’importante nota storica è stato l’uso di Neurospora da parte di George Beadle e Edward Tatum negli studi che hanno portato all’ipotesi “un gene-un po- lipeptide”. Questo lavoro ha dato l’avvio a una nuova era della genetica molecolare e all’uso dei microrganismi in studi di genetica (vedi Figura 2.23). Ciclo vitale Il ciclo vitale asessuato di Neurospora inizia con le spore aploidi rilasciate dai microconidi e dai macroconidi (Figura A.3, in alto). Quando la spora aploide germina, dall’estremo in crescita si allunga una proiezione tubolare che porta alla formazione di un micelio, contenente le ife ramificate. La crescita avviene mediante la replicazione e divisione dei nuclei aploidi e non è accompagnata dalla formazione di setti cellulari. La crescita è veloce, fino a 10 cm in un solo giorno. Sulle piastre Petri, la rete compatta di filamenti produce una colonia. Di fatto questa rete di ife in una colonia è essenzialmente una sola grande cellula continua, con molti nuclei aploidi. La colonia aploide sporula formando i sacchi dei conidi e una colonia può produrre milioni di spore. Due diversi alleli del gene del tipo sessuale, MATA e MATa, controllano il ciclo sessuale di Neurospora. Le spore contengono l’allele MATA o MATa e il contatto tra le colonie dei diversi tipi sessuali porta alla fusione della parete cellulare seguita dalla fusione dei nuclei aploidi. I nuclei diploidi ottenuti vanno velocemente incontro a divisioni meiotiche e ogni nucleo diploide produce quattro spore aploidi in un asco (Figura A.3, in basso). Le spore aploidi vanno incontro a un’altra divisione mitotica, producendo otto spore disposte secondo la loro origine cellulare, e s’impilano in fila all’interno di un asco lungo e sottile. Più aschi sono contenuti in una struttura detta peritecio. Ogni spora nel peritecio è aploide e può formare un’altra colonia di Neurospora. Ci vogliono circa 3-4 settimane per passare da spora, a ifa aploide, a nuclei diploidi, e per tornare indietro alla produzione di spore. Tecniche genetiche Mutagenesi Neurospora può essere mutagenizzata trat- tando le spore con radiazioni ionizzanti. Le spore irradiate vengono fatte germinare in un terreno completo e lasciate sporulare, producendo una grande quantità di spore. Le spore possono essere poi analizzate per la presenza di mutazioni. Introduzione del DNA Neurospora assume facilmente il DNA del plasmide esogeno grazie al meccanismo di trasformazione. Il DNA deve integrarsi nel genoma per poter essere ereditato stabilmente. L’antibiotico igromicina può M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 11 © 978-88-08-19531-9 Asessuato (aploide) Macroconidi (multinucleati) e microconidi (uninucleati) Dispersione tation; mutazione puntiforme indotta dalla ripetizione). La RIP avviene nei nuclei aploidi delle cellule premitotiche; il DNA ripetuto viene cercato e distrutto mediante l’introduzione di transizioni da GC a AT, su entrambe le copie del gene duplicato. Questo processo porta di fatto a un ceppo knockout. Sporulazione Non appena i cromosomi di Neurospora se- gregano durante la meiosi, le cellule figlie si dispongono linearmente su un asse lungo. La frequenza di crossing over può essere usata per mappare la distanza di un locus allelico mutante dal centromero. Micelio Germinazione Sessuato (diploide) Singolo asco con 8 spore aploidi Il contatto tra colonie MATA e MATα produce cellule diploidi 2n Meiosi 1 Meiosi 2 Mitosi n a a a a A A A A Sviluppo dell’asco Neurospora come organismo modello ai nostri giorni Ricombinazione meiotica Come abbiamo visto, Neuro- spora, a partire da un solo evento meiotico, impacchetta le proprie spore con una disposizione (nell’asco) che rispecchia l’ordine di segregazione cromosomica durante la meiosi. Questa caratteristica rende Neurospora un sistema interessante per gli studi di ricombinazione da crossing over durante la meiosi. Ritmi circadiani Neurospora segue un ritmo circadiano Peritecio con più aschi FIGURA A.3 Il ciclo vitale di Neurospora crassa. [Fonte: (Micelio) da Neurospora: Contributions of a Model Organism by Roland Davis. © 2000 Oxford University Press, Inc. Fotografia per gentile concessione di Matthew L. Springer, University of California, San Francisco. (Germinazione) M. G. Roca et al., Eukaryot. Cell 4: 911-919, 2005. (Asco singolo) Per gentile concessione di Namboori B. Raju, Stanford University. (Peritecio) Per gentile concessione di Louise Glass.] giornaliero nella formazione delle spore dei conidi. Queste sono visibili a occhio nudo e, quindi, il fenotipo di un comportamento ritmico può essere studiato nelle piastre Petri o in tubi graduati, lunghe provette in cui si può misurare la crescita rapida delle ife. Perché esista questo ritmo in Neurospora non è chiaro, ma è un modello utile per la comprensione delle basi molecolari del comportamento ritmico. Meccanismi di silenziamento Neurospora è dotata di al- essere usato per selezionare la Neurospora con un transgene. A differenza del lievito, l’inserzione del DNA in Neurospora avviene raramente per ricombinazione omologa; l’inserzione è più spesso casuale e senza alcun bersaglio. Knockout genico Il modo per produrre uno specifico knockout in Neurospora è insolito. Con un processo a quanto pare specifico di questo organismo, una cellula con un gene duplicato, quando viene incrociata va incontro a un processo detto RIP (repeat-induced point mu- meno tre meccanismi di silenziamento diversi, che probabilmente si sono evoluti come difese genomiche contro il DNA invasore, come i trasposoni e i virus. Il silenziamento meiotico è un processo tramite il quale un gene non appaiato, rilevato durante la meiosi, viene silenziato. L’inibizione detta “quelling” avviene nelle cellule aploidi e rivela le sequenze duplicate. La RIP rivela le sequenze duplicate subito prima della meiosi, mutando da GC ad AT entrambe le copie della sequenza duplicata. Il silenziamento meiotico e la RIP sembrano essere meccanismi specifici di Neurospora, mentre il quelling sembra essere correlato all’interferenza da RNA. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 12 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Nematode, Caenorhabditis elegans I piccoli microrganismi unicellulari, come E. coli e il lievito, sono modelli di incredibile successo per lo studio a livello cellulare Per gentile concessione di Wormatlas della chimica fondamentale dei (www.wormatlas.org). processi vitali, ma per studiare la complessità dello sviluppo e del sistema nervoso servono modelli pluricellulari. Nel 1960, Sideny Brenner si rese conto che era il momento di porsi delle domande sul sistema nervoso e su come un organismo pluricellulare si formi a partire da una sola cellula. Brenner decise di usare come modello per studiare questi argomenti un verme nematode, un piccolo metazoo traslucido. Caenhorabditis elegans è un membro della famiglia Rhabditidae dei nematodi, ma, a differenza di altri membri della famiglia, non è patogeno o parassita di altri animali. C. elegans è una buona scelta come modello di sviluppo animale perché cresce velocemente e, in funzione della temperatura, si può sviluppare da uovo ad adulto sessualmente maturo in 21/2-31/2 giorni. I vermi sono facili da crescere su piastre di agar con E. coli come fonte di nutrimento, e possono perfino essere congelati per una conservazione a lungo termine. Gli ermafroditi di C. elegans si possono autofecondare, una caratteristica che permette di ottenere velocemente mutanti omozigoti a partire da una popolazione di vermi mutagenizzati. I maschi, che si formano in piccola percentuale, possono accoppiarsi con gli ermafroditi, formando dei ceppi con nuove combinazioni di mutanti, un aspetto essenziale di qualunque organismo modello genetico. Inoltre, C. elegans è trasparente, e questo permette di vedere ogni cellula durante lo sviluppo. Anche se l’ermafrodita contiene solamente 959 cellule somatiche, il nematode è molto complesso ed è dotato di un sistema nervoso, di muscoli, di sistemi digestivi e riproduttivi e mostra una serie di comportamenti utili per gli studi di genetica neurologica. Ciascun verme produce centinaia di discendenti, permettendo la ricerca di mutanti per tutti i tipi di cambiamenti morfologici e comportamentali. I primi studi con C. elegans come organismo modello Per porre le fondamenta degli studi sullo sviluppo di un organismo pluricellulare, Brenner e altri hanno mappato la posizione di tutte le 959 cellule presenti nel verme ermafrodita, ricostruendo immagini tratte da fettine di tessuto. Durante lo sviluppo, ciascuna cellula migratoria si muove verso una posizione precisa nell’animale. Ulteriori studi hanno portato i ricercatori a scoprire che circa il 12% delle cellule muore sempre durante lo sviluppo e che la morte cellulare è programmata genetica- mente. Oggi sappiamo che la morte cellulare programmata è importante per lo sviluppo di organismi superiori, tra cui l’uomo, e che difetti in questo processo possono portare allo sviluppo del cancro. Uno dei primi esempi di C. elegans come modello di sviluppo è dato dagli studi sulla vulva. Lo sviluppo di questo organo di 22 cellule è stato studiato intensamente, perché le sue singole cellule sono facilmente visibili al microscopio. Le ricerche per identificare i difetti nello sviluppo della vulva sfruttano il fatto che le uova fecondate nell’utero devono essere deposte nella vulva per poi schiudersi al di fuori del corpo. Se la vulva ha difetti di sviluppo, le uova non possono essere depositate e si schiudono all’interno. Il microscopio evidenzia molti vermi interni alla madre (a volte si parla di “un sacco di vermi”). Utilizzando questo evidente fenotipo mutato, i ricercatori hanno identificato molti geni che controllano lo sviluppo della vulva, tra cui geni appartenenti a una via di fosforilazione conservata che controlla la crescita cellulare. Gli omologhi di alcuni di questi geni nei mammiferi codificano soppressori tumorali e oncogeni. La morte cellulare programmata nello sviluppo di C. elegans porta alla morte di una delle due cellule della progenie che derivano dalla divisione cellulare durante diversi stadi di sviluppo. Questo meccanismo è essenziale in diversi stadi dello sviluppo affinché la progenie cellulare sopravvissuta si sviluppi correttamente. In C. elegans ci sono numerosi esempi di morte cellulare programmata, molti dei quali avvengono durante lo sviluppo del sistema nervoso. La morte cellulare programmata è importante anche nello sviluppo embrionale umano, come, per esempio, nella rimozione di tessuto tra le dita. Ciclo vitale In C. elegans ci sono due sessi, ermafrodita e maschio. Gli ermafroditi sono dotati di due copie del cromosoma X. Una piccola percentuale di cellule germinali dell’ermafrodita (dallo 0,05% all’1,0%) va incontro a una nondisgiunzione dei cromosomi X durante la meiosi, formando dei gameti detti gameti X-nulli, e quindi una progenie (maschile) X0. Gli ermafroditi sono molti di più dei maschi e quindi la maggior parte della progenie è prodotta per autofecondazione, la quale in genere dà origine a 200-300 uova fecondate che vanno incontro a un ciclo vitale a più stadi (Figura A.4). Dopo l’embriogenesi, che richiede circa 12 ore a 25 °C, le uova si schiudono, producendo delle larve lunghe 80 mm. La larva iniziale contiene 558 cellule. Lo sviluppo procede attraverso quattro stadi larvali (da L1 a L4) separati da mute. La muta finale porta a vermi adulti sessualmente maturi. L’intero processo M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 13 © 978-88-08-19531-9 Uovo 25˚C Adulto L1 (12 h) di inserimento casuale di un trasposone. L’integrazione del DNA in un gene d’interesse può essere cercata mediante PCR usando un primer interno al trasposone e un altro primer che ibrida con il gene in esame. Interferenza da RNA L’interferenza da RNA, originaria- mente scoperta nel nematode, può essere usata per silenziare la funzione di un gene introducendo RNA a doppio filamento omologo al gene in esame (vedi Capitolo 22). Dauer L2 (7 h) L4 (9 h) C. elegans come organismo modello ai nostri giorni L3 (7 h) Vie di trasduzione del segnale La morte cellulare pro- FIGURA A.4 Il ciclo vitale di Caenorhabditis elegans. [Fonte: (Uovo) Center for Cell Dynamics. (L1-L4 e Dauer) ristampato per gentile concessione di Wormatlas (www.wormatlas.org). (Adulto) Per gentile concessione di Ian Chin-Sang, PhD, Queen’s University, Kingston, Ontario.] grammata e lo sviluppo della vulva utilizzano vie di trasduzione del segnale che sono utili modelli per le vie di segnalazione umane. Gli studi eseguiti sullo sviluppo di C. elegans continuano a rivelare caratteristiche importanti di questi processi. richiede circa 52 ore a 25 °C. Gli adulti vivono approssimativamente 15 giorni. In condizioni di stress, le larve L2 possono entrare in una fase dormiente, la larva “dauer” che può sopravvivere per diversi mesi, aspettando che le condizioni migliorino. Tecniche genetiche Mutagenesi I vermi possono essere mutagenizzati con trattamenti chimici o irradiazioni. I vermi mutanti possono essere osservati direttamente al microscopio, per cercare la presenza di alterazioni fenotipiche che determinano un comportamento o uno sviluppo aberrante, l’incapacità di alcune cellule di andare incontro a morte cellulare programmata, un’aspettativa di vita modificata, l’incapacità delle larve di entrare nello stadio dauer. Autofecondazione e fecondazione incrociata L’autofe- condazione porta da un solo ermafrodita a circa 300 discendenti e permette di ottenere velocemente, a partire da singoli vermi mutanti, alleli mutanti recessivi. Anche se i maschi vengono prodotti solo raramente, questi forniscono un’opportunità di produrre nuovi ceppi genetici incrociandoli con un ermafrodita. Introduzione di DNA Negli studi di trasformazione, del DNA ricombinante lineare viene iniettato direttamente nella gonade prima che si formino le uova. Rari eventi d’integrazione portano a ereditare stabilmente più transgeni. Raramente si ha un’integrazione per ricombinazione omologa. Knockout genico La distruzione per mezzo di un traspo- sone sopprime la funzione di un gene. Negli organismi dotati di trasposoni attivi, le mutazioni insorgono per eventi Malattie umane C. elegans ha molti geni omologhi a geni umani responsabili di malattie, compresi quelli che appartengono alla via del segnale dell’insulina, così come i geni coinvolti nelle malattie cardiache, renali e neurologiche. Lo studio di questi geni dovrebbe portare a comprendere le basi delle malattie umane. Invecchiamento Gli studi genetici della larva dauer hanno portato a identificare una serie di geni che, quando vengono attivati nell’adulto, aumentano significativamente la durata della vita del verme. La presenza di omologhi di questi geni in altri animali ha ovvie implicazioni nello studio dell’invecchiamento. Controllo dell’espressione genica basato sull’RNA Gli studi sull’interferenza da RNA (scoperti per la prima volta nel nematode) hanno portato a identificare dei miRNA coinvolti nell’espressione genica. Infatti, è noto che i miRNA possono regolare l’espressione genica sia nelle piante che negli animali. Neurosviluppo Il sistema nervoso di C. elegans rappre- senta l’organo più grosso dell’animale e comprende più di un terzo delle sue cellule (302 neuroni e 56 cellule gliali). A differenza delle connessioni neuronali dei vertebrati, altamente ramificate, la connettività dei neuroni in C. elegans è piuttosto semplice, con circa 5000 sinapsi e 2000 giunzioni neuromuscolari. Le anomalie comportamentali sono facili da osservare e possono essere mappate con precisione su specifiche reti neuronali. La conoscenza della connettività neuronale completa permette ai ricercatori di studiare come viene guidata la crescita dell’assone e come si formano le sinapsi. Inoltre, C. elegans ha molte classi di neuroni differenti che permettono studi genetici sul differenziamento neuronale. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 14 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Arabetta comune, Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana è un’angiosperma, una dicotiledone della famiglia della senape (Brassicaceae) che comprende i più familiari broccoli, cavolo e rapanello. Arabidopsis è considerata generalmente un’erbaccia e non ha importanza economica, ma le sue caratteristiche la rendoNigel Cattlin/Alamy no speciale come modello sperimentale. Arabidospis è piuttosto piccola; pertanto possono essere fatte crescere molte piante in uno spazio ristretto. Ha un ciclo vitale breve, circa 5-6 settimane dal seme al fiore e ogni pianta è capace di autoimpollinazione, producendo migliaia di semi per ampi studi di mappatura genetica. Inoltre, il genoma di Arabidopsis ha una dimensione di meno del 5% del genoma del mais (2500 Mbp) e di meno dell’1% di quello del grano (16 000 Mbp). Molti laboratori nel mondo studiano Arabidospis e molti centri di stoccaggio pubblici conservano scorte di semi di linee mutanti e varianti naturali di Arabidopsis dette ecotipi, così come risorse genomiche. Arabidopsis rappresenta un modello per quel che riguarda fisiologia, sviluppo, genetica e struttura di tutte le piante. È anche un modello di come le piante interagiscono con l’ambiente e di come percepiscono la lunghezza del giorno, il freddo, l’aridità e la presenza di sale e di come rispondono ai patogeni. Potremmo aspettarci che ci siano molte differenze tra le piante e gli animali nella genetica dei programmi di sviluppo. Però gli studi sullo sviluppo della corona (whorl) del fiore mostrano uno stret- Pistillo (carpelli) Stigma Stilo Antera Petali Sepali (Whorl 1) Petali (Whorl 2) Stami (Whorl 3) Carpelli (Whorl 4) FIGURA A.5 Anatomia del perigonio del fiore di Arabidopsis thaliana. [Fonte: Per gentile concessione del Prof. Dr. Sabine Zachgo.] to collegamento con gli animali. La corona del fiore è formata da quattro anelli concentrici (Figura A.5). L’anello esterno (whorl 1) è costituito da quattro sepali; il whorl 2 da quattro petali, il 3 da sei antere e quello interno da due carpelli che si fondono, formando il pistillo. Lo studio delle piante con mutazioni omeotiche ha mostrato un’alterazione nell’identità dei whorl. Per esempio, in un mutante, i carpelli si ritrovano nel whorl 1 al posto dei sepali. Questo comportamento genetico ricorda le mutazioni nei geni omeotici in Drosophila, in cui gli arti si estendono da segmenti del corpo scorretti. Inoltre, come in Drosophila, i geni omeotici di Arabidopsis codificano fattori di trascrizione che agiscono tramite la formazione di gradienti di concentrazione nell’embrione in via di sviluppo (vedi Capitolo 22). I primi studi con Arabidopsis come organismo modello Arabidopsis è stato aggiunto piuttosto di recente al gruppo di organismi modello, ed è diventato un modello affermato solamente negli anni Ottanta. Nel 1907, Friedrich Laibach ha identificato il numero di cromosomi di Arabidopsis e nel 1940 ha proposto di usare questa pianta come organismo modello. Con l’aiuto di Albert Kranz, Laibach ha raccolto e organizzato molti ecotipi, che hanno contribuito alla collezione attuale di 750 ceppi di Arabidopsis. Il nascere di una comunità scientifica dedita alla ricerca su Arabidopsis divenne chiaro con la pubblicazione di un bollettino nei primi anni Sessanta, e con la prima Conferenza Internazionale su Arabidopsis tenutasi nel 1965. Negli anni Ottanta, Arabidopsis era uno tra i numerosi modelli vegetali tra i quali era anche compreso il mais, un modello genetico ben consolidato. Con lo sviluppo della trasformazione mediata dal T-DNA (vedi più avanti) nel 1986, Arabidopsis è diventato velocemente il modello principale per la ricerca vegetale. Ciclo vitale Arabidopsis ha un ciclo vitale comune delle piante (Figura A.6). Come in molte angiosperme, sia le cellule germinali maschili che quelle femminili risiedono nello stesso fiore e l’autofecondazione (autoimpollinazione) avviene facilmente. Le piante possono andare incontro anche a una fecondazione incrociata (impollinazione incrociata). Ciascuna pianta produce molti fiori che insieme possono produrre più di 10 000 semi. Il ciclo vitale completo, dalla germinazione del seme al nuovo raccolto di semi, richiede da 5 a 6 settimane, con lo sviluppo di radici, foglie, fiori, e alla fine i semi. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 15 © 978-88-08-19531-9 Giorno 0 Seme Giorno 1 Germinazione Giorno 45 Sviluppo del seme e senescenza Giorno 40 Giorno 2 Comparsa dell’ipocotile e dei cotiledoni Giorno 3 Sviluppo della radice Giorno 30 Infiorescenza Giorno 23 Gemma il primo fiore Giorno 7 Sviluppo della foglia Giorno 11 ne usata negli studi dei vegetali. Però sono disponibili vaste collezioni di mutanti di Arabidopsis sequenziati e nei centri di stoccaggio è possibile ordinare inserzioni specifiche in singoli geni. Interferenza da RNA Una funzione genica in Arabidop- sis può essere eliminata con efficacia utilizzando l’RNAi (vedi Capitolo 22). Arabidopsis come organismo modello ai nostri giorni Evoluzione della pianta I quasi 750 differenti ceppi di Arabidopsis sono molto diversi per sviluppo e forma (per esempio per la forma della foglia, il tempo di fioritura, la setosità e la resistenza alle malattie) e sono stati usati per spiegare l’evoluzione delle caratteristiche e le risposte della pianta all’ambiente. Sensibilità alla luce Le piante hanno molte risposte diver- FIGURA A.6 Il ciclo vitale di Arabidopsis thaliana. [Fonte: C. Douglas et al., Plant Cell 13: 1499-1510, 2001. Copyright © 2001, American Society of Plant Biologists.] Tecniche genetiche Mutagenesi Le piante possono essere mutagenizzate trattando i semi con radiazioni ionizzanti o mutageni chimici. Le piante che sono omozigoti recessivi per i geni mutati possono essere facilmente ottenute con l’autofecondazione. so alla luce e Arabidopsis è un modello genetico per alcune di queste. Una tipica risposta è quella di passare dalla produzione di foglie a quella di fiori. Arabidopsis fiorisce quando la lunghezza del giorno aumenta ed è un modello per la sensibilità alla luce del giorno. Inoltre, una ridotta luce nel periodo di germinazione dei semi porta a una crescita alterata a causa di una modificazione di sviluppo programmata che porta a piccole piante con un sistema radicale ridotto. Arabidopsis è stata usata come modello per comprendere la genetica che controlla come la luce influenzi questo sviluppo precoce. Un altro processo sensibile alla luce in Arabidopsis in studio è il modo in cui la pianta evita l’ombra. Complementazione Arabidopsis fiorita può essere auto- fecondata o incrociata con altre piante con tecniche simili a quelle usate da Gregor Mendel, in cui le antere vengono tagliate, permettendo quindi il controllo dell’impollinazione e l’incrocio genetico (vedi Capitolo 2). Ritmi circadiani Come potremmo aspettarci per organi- smi con uno stile di vita immobile e dipendenti dalla luce, le piante mostrano forti ritmi circadiani. Arabidopsis è un modello eccellente per studiare le basi genetiche dei ritmi circadiani e la natura del misterioso “oscillatore ritmico”. Introduzione del DNA La trasformazione con il DNA ri- combinante è mediata dal T-DNA (DNA di trasferimento) di Agrobacterium tumefaciens, che normalmente s’inserisce nei cromosomi in modo casuale. A. tumefaciens è un batterio gram-negativo che causa tumori nelle piante. Contiene un plasmide di 200 kbp che induce il tumore (Ti), il quale include geni che facilitano il trasferimento replicativo del DNA in una cellula vegetale. Una volta introdotto nella cellula vegetale, il plasmide integra un particolare segmento del suo DNA, il T-DNA, nel genoma della pianta. Quando nel T-DNA si trova del DNA ricombinante, anche questo viene inserito nel genoma. Knockout genico La ricombinazione omologa di DNA transgenico, determinando un knockout genico, avviene solo raramente nelle piante e normalmente non vie- Resistenza della pianta ai patogeni Le piante sono do- tate di un’ampia gamma di strategie per sopravvivere alle condizioni di stress, come l’invasione di patogeni, e Arabidopsis è un modello per lo studio dei patogeni e la difesa contro di essi. Tra queste difese ci sono le molecole antimicrobiche, lo sviluppo di barriere fisiche e l’induzione della morte cellulare programmata. Genetica di sviluppo delle piante Come organismo plu- ricellulare, Arabidopsis ha un’ampia varietà di organi e tipi tissutali, ciascuno dotato di una propria genetica di sviluppo. Le aree di studio dello sviluppo comprendono la crescita della foglia, la formazione della corona dei fiori, dei semi e delle radici, lo sviluppo del tessuto vascolare, l’embriogenesi e il piano di sviluppo del fiore. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 16 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster Siamo tutti abituati a considerare il moscerino della frutta come un fastidio cosmopolita, ma Drosophila melanogaster ha una storia lunga 100 anni come imPer gentile concessione di Marcos Teixeira de Freitas portante organismo modello per studi di genetica e dello sviluppo. Il corpo del moscerino della frutta è diviso in segmenti diversi che formano tre sezioni principali: la testa, il torace e l’addome. Le sezioni corporee sono racchiuse in una dura cuticola di chitina, secreta dalle cellule epidermiche sottostanti, e sono ricche di particolari anatomici (indentazioni, peli) che servono come marcatori fenotipici per gli studi di genetica. I primi studi con Drosophila come organismo modello Nel 1908 Thomas Hunt Morgan cercava un organismo idoneo per gli studi di genetica animale. A quel tempo i finanziamenti per la scienza erano ridotti e quindi alla fine decise di concentrarsi sulla Drosophila, in quanto economica e facile da crescere. Nel 1910, dopo due anni di studi senza successo, Morgan trovò un maschio con una mutazione spontanea che causava occhi bianchi (questa mosca normalmente ha gli occhi rossi). Studi eleganti e dettagliati di quest’unico mutante hanno dimostrato che i geni si trovano sui cromosomi, che ogni gene ha due alleli, che gli alleli si distribuiscono in maniera indipendente durante la meiosi e che i geni posti su cromosomi diversi si assortiscono in maniera indipendente. Queste e altre scoperte importanti hanno rafforzato le leggi di Mendel nel contesto fisico dei geni localizzati sui cromosomi (vedi Capitolo 2). Il moscerino della frutta è stato anche il primo organismo per il quale si è ottenuta una mappa genetica. Alfred Sturtevant, uno studente del laboratorio di Morgan, mappò la distanza relativa tra i geni lungo i cromosomi in funzione delle loro frequenze di ricombinazione per crossing over. Calvin B. Bridges portò ancora più avanti questi studi identificando la posizione esatta dei geni lungo i cromosomi politenici. Questi cromosomi giganti, posti nelle ghiandole salivari del moscerino della frutta, sono costituiti da gruppi di cromosomi impacchettati insieme e sono caratterizzati da schemi di bandeggio unici quando vengono colorati (Figura A.7). Bridge identificò più di 5000 bande disposte secondo uno schema tipico. Non si sa perché si formino i cromosomi politenici, ma potrebbero essere collegati al ruolo della ghiandola salivare di secrezione dell’involucro della pupa durante la metamorfosi. Molte mutazioni basate sulla ricombinazione sono state identificate con bande mancanti o con posizioni in cui i FIGURA A.7 Cromosoma politenico d’insetto. [Fonte: S. F. Werle et al., Can. J. Zool. 82: 118-129, 2004, Fig. 2. © 2004, NRC, Canada.] cromosomi si erano invertiti permettendo di mappare i geni su un cromosoma, così come di stabilire la posizione dei geni sui cromosomi. Ciclo vitale Le mosche hanno un breve ciclo vitale diploide (12 giorni) (Figura A.8). Il sesso nelle mosche è determinato dal numero di copie di cromosoma X, non dal cromosoma Y (XX è femmina e il raro X0 è maschio), anche se il cromosoma Y è necessario alla produzione dello sperma. All’incirca un giorno dopo l’accoppiamento, la femmina inizia a deporre centinaia di uova. Le divisioni nucleari nell’embrione sono le più rapide di qualunque altro organismo Femmina Maschio Embrione Pupa Ciclo vitale di Drosophila melanogaster 1° stadio larvale Prepupa 2° stadio larvale 3° stadio larvale FIGURA A.8 Ciclo vitale di Drosophila melanogaster. [Fonte: Prof. Dr. Christian Klambt, Westfalische Wilhelms-Universitat Munster, Institut fur Neuor- und Verhaltensbilogie.] M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 17 © 978-88-08-19531-9 pluricellulare e le uova si schiudono in un giorno circa. Il baco passa attraverso tre stadi larvali, separati da mute che richiedono circa 5 giorni. Le larve contengono i dischi imaginali di tessuto destinati a trasformarsi nelle appendici della mosca adulta (come gli occhi, le antenne, le zampe, le ali, le altere, cioè ali modificate che funzionano come stabilizzatori del volo) e le parti della bocca. Le ghiandole salivari del terzo stadio larvale secernono l’involucro della pupa, in cui la metamorfosi avviene in 31/241/2 giorni fino alla mosca adulta. Le mosche vivono approssimativamente 30 giorni. Tecniche genetiche Mutagenesi Le mosche possono essere mutagenizzate esponendole alle radiazioni ionizzanti o nutrendole con sostanze chimiche mutagene. Le mutazioni che portano a cambiamenti nel colore dell’occhio, nella forma dell’ala o di parti del corpo possono essere identificate mediante l’osservazione visiva. nell’adulto anche grazie all’uso di una ricombinasi di lievito inducibile dal calore (detta FLP) ingegnerizzata nel genoma. L’induzione del calore comporta un’elevata frequenza di ricombinazione mitotica nei tessuti riscaldati, formando dei mosaici genetici. Anche se le alterazioni genetiche possono essere letali per gli embrioni, non necessariamente uccidono l’adulto, dato che la loro espressione è localizzata solamente in alcune cellule. Knockout genici È difficile ottenere dei knockout genici in Drosophila perché le tecniche di ricombinazione omologa non sono ancora perfette. Esistono, però, delle procedure in due passaggi in cui un gene è inserito a caso, seguito dall’espressione delle proteine che determinano l’escissione del gene. Una volta escisso, il frammento di DNA lineare può andare incontro alla ricombinazione omologa con il gene wild-type. Interferenza da RNA L’RNAi può essere usata per dimi- nuire efficacemente il prodotto di uno specifico gene invece che eliminare realmente il gene. Introduzione di DNA Per inserire il DNA ricombinante viene usato un processo noto come trasformazione dell’elemento P, di norma usato per studiare gli effetti dell’espressione proteica sugli elementi di controllo della trascrizione. L’elemento P è un trasposone di 3 kbp che può portare una sezione di DNA ricombinante tra le sue ripetizioni terminali al posto della trasposasi e del repressore da esso codificati (vedi Capitolo 14). Il DNA dell’elemento P ricombinante viene iniettato nell’uovo fecondato, insieme a un plasmide che codifica una trasposasi. L’inserimento è casuale e il plasmide che codifica il gene della trasposasi viene perso durante le divisioni cellulari, impedendo in questo modo la reintroduzione del trasposone in altri punti nel genoma. Drosophila come organismo modello ai nostri giorni Malattie umane Il genoma di Drosophila, di circa 170 Mbp, è all’incirca venti volte più piccolo del genoma di topo e di quello umano, eppure codifica approssimativamente lo stesso numero di famiglie geniche. All’incirca il 60% dei geni noti per essere coinvolti in malattie umane ha degli omologhi nel moscerino della frutta. Per esempio, gli studi dei geni embrionali letali in Drosophila hanno permesso di spiegare la base genetica di difetti della nascita umana. Altri modelli di malattia sono i difetti immunologici, il diabete, il cancro, il morbo di Huntington, di Alzheimer e di Parkinson. Cromosomi bilanciatori Alleli letali recessivi possono essere mantenuti stabilmente nei moscerini della frutta quando sono appaiati a un cromosoma bilanciatore, un cromosoma che non può ricombinare con il suo omologo per la presenza di molte inversioni interne che impediscono l’allineamento completo durante la meiosi. I cromosomi bilanciatori sono letali quando sono omozigoti, quindi l’unica progenie che sopravvive è eterozigote per il gene letale recessivo e il bilanciatore. Piano di sviluppo del corpo La localizzazione dell’mRNA Mosaici genetici Con l’induzione della ricombinazione Comportamento Drosophila fornisce un modello per la mitotica mediante irradiazione con raggi X, nel moscerino della frutta adulto si possono formare dei mosaici genetici, porzioni di tessuti geneticamente alterati. I mosaici sono particolarmente utili quando si studiano i geni letali. I mosaici genetici dei geni letali possono formarsi comprensione della base cellulare e molecolare di alcuni tipi di comportamento. Le anomalie di comportamento del moscerino della frutta comprendono cambiamenti nell’apprendimento e nella memoria, nella ricerca del cibo, del riposo, e in altri comportamenti, e nell’alcoolismo. materno nelle uova porta a un’espressione genica localizzata che stabilisce gli assi antero-posteriore e dorso-ventrale in Drosophila. Questi geni controllano il piano di sviluppo corporeo e hanno i loro corrispondenti negli animali più complessi. Quindi il moscerino serve come sistema piuttosto semplice per comprendere la formazione del piano corporeo (vedi Figura 16.24 e Capitoli 21 e 22). M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore 18 APPENDICE Organismi modello © 978-88-08-19531-9 Topo domestico, Mus musculus Il topo domestico, Mus musculus, è stato collezionato e allevato dagli “amanti” dei topi per centinaia di anni, e alcuni dei ceppi puri, sviluppati da questi, sono usati oggi come standard per gli studi scientifici. Il topo iStockphoto domestico è il modello di mammifero principale ed è più simile agli uomini di quanto ci piaccia ammettere (vedi Figura 1.12). Il genoma del topo ha quasi la dimensione di quello umano e codifica essenzialmente lo stesso numero di geni; il 99% di questi ha un omologo nell’uomo. Infatti, una gran parte del genoma murino è sintenico con il nostro, ovvero interi blocchi di geni si ritrovano nello stesso ordine in entrambe le specie (vedi Figura 8.4). Rispetto ad altri organismi modello, lavorare con i topi è più complicato sotto ogni aspetto. Sono più grandi, ovviamente, ma hanno anche un tempo di generazione di circa 8-10 settimane e producono, in media, solamente da 6 a 8 piccoli per nidiata. Questi numeri sono molto interessanti se confrontati con altri mammiferi, ma poco se confrontati con altri organismi modello. Le colonie di topo sono anche costose da mantenere e non possono essere trattati i numeri necessari per attuare grandi screening genetici, come avviene con altri organismi modello. Però, a differenza del nematode e del moscerino della frutta, i topi hanno sistemi biologici senza paralleli in modelli animali inferiori, come il sistema immunitario e l’apparato scheletrico, o sono semplicemente modelli migliori per studi di sistemi complessi come l’apparato cardiovascolare, il sistema endocrino e molti altri. Il topo è un modello per le malattie umane, come il cancro, praticamente in tutti questi sistemi. I primi studi sul topo come organismo modello Gli studi genetici sui topi iniziarono nei primi anni del Novecento, quando la selezione e l’incrocio erano i principali metodi per ottenere una progenie con i caratteri desiderati. Questi primi studi portarono a un modello generale che spiegava il colore della pelliccia in tutti gli altri mammiferi con pelo. I topi e i ratti hanno anche una lunga storia negli studi nutrizionali, specialmente per l’identificazione di vitamine e sintomi causati dalla mancanza di vitamine nella dieta. L’utilizzo dei topi in un modello di malattia umana è stato avviato da Clarence Cook Little. Negli anni Venti, mediante incroci tra consanguinei, questi sviluppò un ceppo di topo, il C57BL/6 (comunemente detto Black6), che alla fine divenne il ceppo di topo usato per determinare la sequen- za del genoma. Little fondò anche il Jackson Laboratory in Bar Harbor, Maine, un centro di genetica del topo che serve anche come deposito pubblico di modelli murini per la ricerca scientifica. Ciclo vitale I cromosomi X e Y determinano il sesso nei topi, come negli uomini. La fecondazione dà origine a una blastocisti contenente alcune cellule non differenziate unite assieme nella massa cellulare interna, la fonte di cellule staminali embrionali. La gestazione dura 19-21 giorni e porta a una nidiata di 3-14 piccoli. La maturità sessuale richiede circa 6 settimane per le femmine e 8 settimane per i maschi, ma l’accoppiamento può avvenire in soli 35 giorni. I topi vivono 1-2 anni e le femmine possono dare 5-10 nidiate, sostanzialmente nel primo anno di vita. Tecniche genetiche Mutagenesi Gli incroci tra consanguinei per molte gene- razioni hanno portato a molti ceppi utili di topi mutati. L’aggiunta di sostanze chimiche mutagene al nutrimento facilita lo sviluppo di ceppi mutati. Introduzione di DNA Il DNA estraneo può essere inietta- to direttamente nel nucleo delle uova fecondate, seguito dall’impianto delle uova nell’ovidotto della femmina ricevente. L’integrazione casuale avviene con elevata frequenza. Il DNA ricombinante usato di norma ha un promotore di topo che dirige l’espressione di un gene reporter, come lacZ o GFP (proteina fluorescente verde), in modo che l’espressione del transgene possa essere seguita durante lo sviluppo. Circa metà dei topi transgenici contiene DNA ricombinante nella linea germinale e quindi passa il gene ricombinante alle generazioni future. Knockout genico Il knockout mirato come modello di una malattia murina viene ottenuto a partire dalle cellule staminali embrionali (Figura A.9). Le cellule staminali sono estratte dalla massa cellulare interna della blastocisti e fatte crescere in coltura. Le cellule staminali coltivate sono poi trasformate con del DNA lineare contenente una copia mutata del gene in esame, insieme ai geni per la resistenza alla neomicina (neor) e la timidina chinasi (tk). DNA omologo fiancheggia il gene mutato (genemut nella Figura A.9) e il gene neor, in maniera tale che l’integrazione omologa sostituisca il gene wild-type con il gene mutato insieme a quello per la neor. Al contrario, il DNA che si inserisce casualmente porta all’integrazione dell’intero frammento di DNA, compresa la tk. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore APPENDICE Organismi modello 19 © 978-88-08-19531-9 Blastocisti Cellule della massa interna (cellule staminali) Estratto di cellule staminali genemut neor tk Trasformazione genemut neor Nessuna integrazione Integrazione omologa genemut neor tk Integrazione non omologa Il topo come organismo modello ai nostri giorni Uso della neomicina per selezionare la neor genemut neor Nessuna integrazione Integrazione omologa genemut neor tk Integrazione non omologa Uso del ganglocivir per selezionare contro la tk genemut neor Integrazione omologa omologa, perché queste cellule contengono la tk, e la timidina chinasi trasforma il ganciclovir in una tossina che uccide queste cellule. Solamente le cellule che contengono i knockout genici prodotti dalla ricombinazione omologa sopravvivono a entrambe le selezioni. Le cellule staminali ingegnerizzate vengono iniettate in un embrione ospite wild-type allo stadio di blastocisti. Questo porta alla formazione di un embrione che è una chimera dell’ospite wild-type e delle cellule ingegnerizzate donatrici. Le chimere risultanti vengono incrociate per trasmettere la modificazione genetica attraverso la linea germinale. I topi eterozigoti della F1 (prima generazione) vengono poi incrociati per ottenere una progenie F2 wild-type, eterozigote e omozigote, nell’atteso rapporto mendeliano 1:2:1. Accoppiamenti selezionati portano a topi knockout omozigoti. Sono state sviluppate tecniche per conservare, tramite crioconservazione di sperma e di cellule uovo, ceppi di topo preziosi e difficili da ottenere. genemut neor tk Integrazione non omologa Malattie umane Il topo è un modello importante per lo studio delle malattie umane. I modelli delle malattie possono essere ottenuti tramite accoppiamento tra consanguinei o producendo knockout di noti geni responsabili di malattie. I modelli murini di malattie umane comprendono il cancro, l’arteriosclerosi, l’invecchiamento, l’ipertensione, le malattie metaboliche, le malattie del sistema immunitario, il diabete di tipo 1 e tipo 2, la sindrome di Down, il morbo di Alzheimer, il glaucoma, l’osteoporosi, l’obesità, l’epilessia, la malattia Lou Gehrig (la sclerosi laterale amiotrofica), il morbo di Huntington, le malattie del sangue e molte altre. Iniezione nell’embrione Mappatura dei geni mutati I geni mutati possono essere Eterozigote knockout Incrocio della progenie per ottenere un topo omozigote recessivo FIGURA A.9 Costruzione di un topo knockout. identificati più velocemente nel topo rispetto ai geni mutanti negli uomini. Ceppi di topo molto simili (come Mus musculus e Mus spretus) possono essere incrociati per produrre ibridi che generalmente presentano sequenze diverse in posizioni polimorfiche, permettendo ai ricercatori di usare l’analisi di associazione per sviluppare mappe genetiche dettagliate e localizzare un gene responsabile di una malattia. Comportamento Esistono modelli murini per certi tipi di comportamento, come l’alcoolismo, la dipendenza da droghe, disturbi ansiosi e comportamento aggressivo. Per selezionare le cellule con il gene knockout opportuno, sono necessari due passaggi. La selezione per la neor, grazie all’uso della neomicina, uccide tutte le cellule che non hanno integrato il DNA trasformante. La selezione contro la tk, con l’uso dell’antivirale ganciclovir, uccide le cellule che hanno integrato del DNA per ricombinazione non Sviluppo del mammifero I topi transgenici sono usati per studiare la posizione e la modalità di espressione di particolari geni in vari momenti dello sviluppo. Inoltre, esistono modelli per studiare alcune malattie dello sviluppo umano, come il labbro leporino e la palatoschisi. M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore
