MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

MICROSCOPIA
A FLUORESCENZA
Microscopia a fluorescenza
Fluorescenza
Capacità di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa
lunghezza d'onda e di emettere una frazione dell’energia assorbita
con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d’onda
differente e superiore a quella assorbita.
Microscopia a fluorescenza
Usa la luce ultravioletta, a una lunghezza d’onda 200-400
nanometri le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza
che emettono nello spettro visibile.
 AUTOFLUORESCENZA
Prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto.
Es: citoplasma (debole luce bluastra), i granuli (intensa luce
giallognola), e i mitocondri (forte emissione fluorescente). Il nucleo,
al contrario, non è autofluorecente.
 FLUORESCENZA SECONDARIA
Indotta da una colorazione con sostanze fluorescenti, dette
fluorocromi (fluoresceina o rodamina).
Microscopia a fluorescenza
Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON HOECHST
Il colorante HOECHST fa parte della famiglia di coloranti che
evidenziano il DNA al microscopio a fluorescenza.
Pertanto è utilizzato per visualizzare i nuclei e i mitocondri.
Microscopia a fluorescenza
Studio morfologia nucleare:
COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA
L’arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi
nucleici. In particolare colora in verde il DNA e in rosso l’ RNA
Immunofluorescenza
 UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA
FLUORESCENTE
 TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI
ANTICORPI MARCATI
 OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
METODO DIRETTO
La sostanza fluorescente è legata direttamente all’anticorpo prodotto
contro l‘antigene cercato.
METODO INDIRETTO
Anticorpo primario che riconosce l’antigene cercato.
Antcorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che
riconosce l’anticoro primario
Immunofluorescenza
- ESTRAZIONE proteine di membrana
(cellule di topo e cellule di uomo)
- INOCULAZIONE in conigli diversi
- ESTRAZIONE anticorpi
(anti-topo e anti-uomo)
- MARCATURA differenziale anticorpi
- FUSIONE CELLULARE (Virus Sendai)
- TRATTAMENTO con i due anticorpi
- OSSERVAZIONE della marcatura al
microscopio a fluorescenza
MODELLO DI MEMBRANA
A MOSAICO FLUIDO
Topo
Uomo
FUSIONE
Immunofluorescenza
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Microscopia elettronica

Limite di risoluzione molto più grande di
quello
ottico
 Non viene utilizzata la luce per rivelare il preparato,
ma un fascio di elettroni accelerato fortemente
 Immagini ultrastrutturali del preparato in bianco e
nero, e non colorate come nella microscopia ottica
1) MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE
Il preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture
interne
2) MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
Il preparato NON è sezionato e sono visualizzate le
strutture esterne, quindi la struttura tridimensionale
del campione
Microscopia elettronica a trasmissione
filamento
(catodo)
anodo
condensatore
preparato
obiettivo
proiettore
schermo
fluorescente
Microscopio elettronico
a trasmissione
Microscopia elettronica
Prelievo
Lavaggio in tampone fisiologico
Taglio in frammenti molto piccoli (1mm diametro)
Fissazione
Glutaraldeide
lavaggi in tampone
Tetrossido di osmio (OsO4)
Disidratazione
Etanolo, simile alla microscopia ottica
Inclusione
Resine liquide che solidificano a 70°C
Piccoli contenitori cilindrici
Microscopia elettronica a
trasmissione
Sezionamento
Ultramicrotomo
- Lama di diamante
- Sezioni ultrafini (50-70 nm)
- Retini dotati di griglia.
Colorazione
Sali di metalli pesanti
- URANIO
(acetato di uranile)
- Lavaggi in acqua distillata
- PIOMBO (citrato di piombo)
Microscopia elettronica a trasmissione
Microfotografia al microscopio elettronico di un linfocita B umano
Microscopia elettronica a trasmissione
Mitocondrio
Lisosomi
Mitocondrio
Apparato di Golgi
RER
Microscopia elettronica a scansione
Mentre
nel
MICROSCOPIO
ELETTRONICO
A
TRASMISSIONE, gli elettroni accelerati attraversano
la sezione del campione e producono un’immagine
fortemente ingrandita su uno schermo fluorescente,
col risultato di un’immagine in bianco e nero
dell’ultrastuttura
interna
del
campione,
nel
MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE gli
elettroni colpiscono il campione non sezionato, che
produce elettroni secondari che vengono raccolti da
uno schermo che, integrando gli impulsi provenienti
da tutte le direzioni, producono un’immagine in
bianco e nero della struttura esterna tridimensionale
del campione
Microscopia elettronica a scansione
Osservazione particolareggiata della
superficie dei campioni
- Prelievo, lavaggio, fissazione
- Essiccamento (essiccatore)
- Ricopertura con oro o argento
(metallizzatore)
Microscopio elettronico
a scansione
- Il fascio elettronico urta il campione.
Produzione di elettroni secondari
raccolti da un sensore ed integrati in
un monitor a formare l’immagine
tridimensionale della struttura
esterna
Microscopia elettronica a scansione
Microscopia elettronica
Immunolocalizzazione al microscopio elettronico:
Tecnica dell’immunogold
• Particelle sferoidali di oro colloidale (5-30 nanometri) coniugate
con anticorpi specifici per l’antigene cercato
• Oro è opaco agli elettroni
• Possibilità di doppie localizzazioni
Trasmissione
Scansione