Lezione 3-Metodi_di_studio 2015
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Metodi di studio UNITA’ DI MISURA μm 20 μm 25 nm 1X5 μm 7 nm 2nm Visualizzazione di cellule e tessuti microscopia ottica microscopia elettronica Visualizzazione di cellule e tessuti Il microscopio è uno strumento fondamentale Gli studi su cellule, tessuti e organi si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi e sulle relative procedure Esistono diversi metodi di microscopia: - la microscopia ottica - la microscopia elettronica INGRANDIMENTO capacità di fornire un’immagine ingrandita dell’oggetto osservato. L’ingrandimento dipende dall’obiettivo e dall’oculare e corrisponde al prodotto degli ingrandimenti delle singole lenti. Microscopia ottica: fino a 1000 volte Microscopia elettronica: oltre 106 volte E’ limitato dal potere di risoluzione Risoluzione: la distanza minima a cui si distinguono due oggetti Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del Microscopio ottico: 200 nm = 2,000 Angstroms Risoluzione del Microscopio Elettronico a Trasmissione: 0,2 nm = 2 Angstroms Risoluzione di un microscopio dipende da: - Caratteristiche della luce (lunghezza d’onda: λ) - Caratteristiche delle lenti (apertura angolare: α) - Caratteristiche del mezzo in cui si svolge l’osservazione (indice di rifrazione: n) R= λ 2n x sen α Lunghezza d’onda R= λ 2n x sen α Apertura angolare R= λ 2n x sen α Indice di rifrazione R= λ 2n x sen α Microscopia Ottica Microscopia Ottica in Campo chiaro Immagine si forma perché l’oggetto scherma la luce trasmessa Preparati in campo chiaro Un batterio Campo chiaro, 1000x Cellule Microscopia ottica a contrasto di fase • Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto • Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante • I raggi di luce che attraversano le cellule subiscono un leggero rallentamento che risulta una variazioni della fase dell’onda luminosa • Un anello di fase posto sopra l’obbiettivo trasforma questa variazione di fase in cambiamenti della luminosità che permettono di visualizzare l’oggetto Citologia, Istologia e Anatomia microscopica © Pearson Italia S.p.A. 15 Microscopia ottica a contrasto di fase Un batterio 400x Un lievito (S. cerevisiae) 400x Cellule staminali neuronali in coltura 100x Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio Coloranti vitali Le cellule possono essere colorate senza fissazione. Coloranti che richiedono fissazione Le cellule devono essere fissate e permeabilizzate. Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica • • • • • Prelievo del campione Fissaggio (formaleide o alcol) Preparazione delle sezioni Taglio (microtomo) Colorazione (paraffina) Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 µm Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia Sezione non colorata Diversi tipi di Sezioni Sagittali: Separano destra-sinistra Coronali o frontali: Separano davanti-dietro Ematossilina/Eosina • Ematossilina • Ha affinità per le molecole cariche negativamente (principalmente DNA ed RNA)…maggiore concentrazione nel nucleo • Eosina • Ha affinità per le molecole cariche positivamente (ad esempio alcune classi di proteine presenti nel citosol) Cosa è colorato in questa sezione? • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di violetto, viene detta basofila • È colorata dall'ematossilina • I Nuclei generalmente sono basofili zoom • Se una porzione si colora in rosa, viene detta acidofila o eosinofila • È colorata dall'eosina • Colora il citosol zoom Impregnazione argentica Tricromica o Hazan-Mallory •Per i tessuti connettivi •Le fibre di matrice extracellulare si colorano in blu •Con E&E sono rosa Giemsa • Per le cellule del sangue • Simile ad E&E Cellule del sangue Colorazioni di specifiche componenti: muco. Alcian Blu E le aree "bianche"? • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali si colorano debolmente con Ematossilina & Eosina • • • Sangue, linfa etc. Si riconoscono come ampi spazi bianchi Anche i lipidi ed il grasso non si colorano con Ematossilina & Eosina Mesenchima Immuno-marcatura: Immunoistochimica e Immunofluorescenza Anticorpi sono coniugati con molecole «visibili» Citologia, Istologia e Anatomia microscopica © Pearson Italia S.p.A. Microscopia a Fluorescenza • Il campione viene colorato con anticorpi (o altre molecole) coniugati a fluorocromi • La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi • I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde Citologia, Istologia e Anatomia microscopica © Pearson Italia S.p.A. 32 Citologia, Istologia e Anatomia microscopica © Pearson Italia S.p.A. 34 Utilizza raggio laser e diaframmi che permettono di bloccare il segnale proveniente da altri piani focali 35 Microscopia Elettronica a Trasmissione Microscopia Elettronica a Trasmissione • Utilizzano gli elettroni invece che la luce • Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta – Alta risoluzione • Gli elettroni passano attraverso il campione • Sezioni molto sottili colorate con sostanze “coloranti” elettrondense MICROSCOPIA ELETTRONICA Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo fluorescente che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse. Citologia, Istologia e Anatomia microscopica © Pearson Italia S.p.A. 39 La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Pinocitosi Microscopia elettronica - I campioni devono essere fissati e tagliati in sezioni molto più sottili (50-100 nm) di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa (ultramicrotomo) - Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni sia semplicemente per dare contrasto (metalli pesanti come i sali di piombo) o anche per marcare gli anticorpi (Immunogold) Vari tipi di Microscopia Elettronica • Transmissione (TEM) • Scansione (SEM) • Shadow-casting • Freeze-fracture • Freeze-etching • CryoEM • Negative Staining Microscopia Elettronica a Scansione SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D Microscopia Elettronica a Scansione Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione, bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso Immagini al SEM Tridimensionalità La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità - Ciglia e microvilli
