TECNOLOGIE DI STUDIO DELLE CELLULE STAMINALI Studiare le

TECNOLOGIE DI STUDIO DELLE CELLULE STAMINALI
Studiare le cellule staminali è piuttosto complesso.
Per trovarle è necessario individuare quelle cellule capaci di auto-rinnovamento e pluri/multi potenza, le
quali si trovano spesso in tessuti complessi, tra molte cellule simili e proliferanti.
Per raggiungere questo fine i ricercatori associano tecniche classiche di analisi morfologica e istologica ad
approcci innovativi basati su tecnologie biomolecolari che permettono di isolare le cellule dal tessuto,
studiarne il comportamento, seguirne la progenie o modificare l’espressione genica.
Il primo passo nello studio delle cellule staminali è localizzarle e capirne le caratteristiche, in modo da
distinguerle dalle altre cellule.
Questo è l’obiettivo dell’analisi istologica dei campioni.
Le tecniche dell’analisi istologica colorano cellule e tessuti basandosi su anticorpi che si legano a specifiche
molecole e riconoscono quelle d’interesse . A seconda del tipo di molecola con cui questi anticorpi possono
legarsi, si distinguono due tecniche:

IMMUNOFLUORESCENZA: molecole fluorescenti

IMMUNOISTOCHIMICA: enzimi capaci di produrre precipitati colorati
I fluorocromi e i precipitati colorati sono visibili al microscopio quando illuminati da fonti luminose
appropriate.
Questi metodi funzionano bene durante lo sviluppo embrionale, quando sono facilmente osservabili i
macchinari molecolari (?) attivi durante la divisione delle cellulare.
Nell’organismo adulto, invece, la mitosi delle staminali avviene molto più lentamente, ed è quindi
improbabile riuscire a osservare i macchinari della divisione.
Per ovviare a questo problema, prima che avvenga la mitosi, nelle cellule viene inserita una molecola
chiamata bromodesossiuridina, è simile alle basi azotate del dna, ed è visualizzabile con alcuni anticorpi.
Questa rimane inserita nel dna anche dopo la fine della duplicazione, in modo da poter osservare la
progenie nel corso del tempo.
Altri particolari sulla morfologia e la struttura delle cellule staminali sono la ricerca di determinate proteine
o molecole o la microscopia elettronica.
Per dimostrare che le caratteristiche rilevate siano effettivamente tipiche di cellule staminali, vengono
eseguite tecniche di selezione dal tessuto (ex vivo), saggi di funzionamento in provetta, e analisi del tessuto
(in vivo).
Una delle tecniche di selezione più innovative consiste nella selezione basata sull’espressione di particolari
molecole presenti sulla superficie delle cellule. Le cellule così selezionate possono essere analizzate,
trapiantate e studiate.
Per la selezione, le cellule del tessuto sono dissociate fino a formare una sospensione di singoli elementi,
esposti poi al legame con anticorpi e fluoro cromi. Gli anticorpi sono capaci di riconoscere le molecole di
membrana d’interesse.
Le cellule così marcate vengono analizzate da uno strumento chiamato FACsorter, (fluorescence activated
cell sorter) selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza.
Nel dispositivo le cellule viaggiano sospese in fila indiana in un fluido. Lo strumento, illuminando le singole
cellule con uno o più raggi luminosi ne rileva la fluorescenza e misura parametri come dimensione, orma e
complessità.
Le cellule positive al segnale fluorescente, quindi quelle d’interesse, sono indirizzate a fluire in direzione
diversa da quelle negative.
MACs: magnetic-activated cell sorting. Un’alternativa alla fluorescenza, le cellule possono essere
selezionate con anticorpi coniugati a microscopiche biglie magnetiche.
Le cellule legate dagli anticorpi sono trattenute da apposite colonnine magnetiche mentre tutte le altre
sono raccolte separatamente. Le cellule trattenute dalla colonnina sono poi staccate con un liquido speciale
e pronte per successivi esperimenti.
Saggio di formazione neurosfere  utile per determinare la presenza nel tessuto di elementi dotati di
autorinnovamento e multipotenzialità (caratteristiche delle staminali).
Cellule direttamente dissociate dal tessuto vengono esposte a fattori trofici, che ne stimolano la
proliferazione.
Questa procedura elimina le cellule completamente differenziate.
Le cellule staminali, invece, proliferano, e generano gruppetti sferici di cellule, le neurosfere.
Se dopo sei passaggi di successiva dissociazione e amplificazione per proliferazione si ottengono nuove
neurosfere, si può affermare che il tessuto di partenza conteneva cellule capaci di auto-rinnovamento.
Per dimostrarne la multipotenza, le neurosfere vengono poste in una cultura senza fattori trofici. In queste
condizione, le cellule maturano in tre tipi neurali: neuroni, oligodentrociti, astrociti.
Utili per testare prodotti farmacologici ed avere grandi numeri di cellule indifferenziate.
Le cellule staminali prodotte in vitro producono prevalentemente cellule gliali (cellule con funzione
nutritiva e di sostegno per i neuroni) e pochi neuroni. In vivo succede l’opposto.
Difficoltà dovute alla non perfetta riproduzione della nicchia staminale.
La forma tridimensionale non permette la corretta diffusione delle sostante necessarie.
Fettine o pezzetti di cervello possono essere prelevati dal sistema nervoso durante lo sviluppo embrionale,
in quando una cultura ex vivo (fuori dall’organismo e dalla nicchia staminale) è più facile da manipolare e
ispezionare. Questo permette anche l’aggiunta e la sperimentazione di altre sostanze.
Metodo utile per seguire la migrazione dei giovani neuroni, ma non per lo studio del comportamento delle
staminali, perché dopo un breve periodo queste perdono le loro proprietà.
Trapianto cellule staminali, utile per scopi:
1. Terapeutici  cellule staminali ematopoietiche per le malattie ematologiche
2. Per studiare come l’ambiente influenza il loro funzionamento.
Cellule staminali o progenitori neurali  ottenute tramite dissezionando o dissociando le aree nelle quali si
trovano e subito trapiantati o espansi in coltura prima del trapianto intracerebrale. In genere esse vengono
iniettate per via endovenosa nell’animale ospite, e in genere il trapianto è distinto dal tessuto ospite grazie
l’espressione di una proteina fluorescente.
L’iniezione delle cellule nel tessuto a diversi stadi di evoluzione (embrionale/adulta), in aree diverse (zone
neurogeniche e non, cervello o midollo) e in condizioni diverse (cervello sano o no, es. ischemia cerebrale)
permette di capire le capacità di sopravvivenza, proliferazione, differenziamento e integrazione delle cellule
nel tessuto ospite nei vari casi.
Per esempio, permette di capire se le cellule trapiantate in grado di sostituire popolazioni neuronali o gliali
(come la mielina prodotta dagli oligodendrociti che vengono distrutti nella sclerosi multipla)
I risultati degli studi effettuati sono complessivamente deludenti, infatti al di fuori delle zone neurogeniche,
il tessuto nervoso è restio ad accogliere cellule staminali e/o progenitori neurali. Serve molto lavoro per
permettere che vengano accettate e perché abbiano capacità di differenziamento.
Sono state sfruttate numerose tecniche di ingegneria genetica per soddisfare l’esigenza di vedere
le cellule staminali e per modificarne il funzionamento nei trapianti e in coltura.
Grazie a queste metodiche, è possibile inserire geni esogeni (non presenti nell’organismo ospite)
nello zigote o nelle prime fasi dell’embriogenesi (transgenesi)  in questo modo vengono creati
animali da laboratorio detti animali transgenici. Tra questi geni esogeni vengono introdotti anche
quelli che permettono la produzione di proteine fluorescenti. Inoltre la loro espressione può
essere vincolata alla produzione di altre proteine prodotte dall’organismo o dalla cellula. Per
esempio la proteina fluorescente può essere associata a proteine di riferimento espresse dalle
cellule staminali. Risultato  animali nei quali le cellule staminali sono fluorescenti finché le
proteine associate sono espresse, mentre quelle derivate,non contenendo le proteine
d’interesse, saranno negative.
Altri approcci di ingegneria genetica permettono di attivare l’espressione di una molecola
fluorescente nelle cellule d’interesse in una precisa fase dello sviluppo o della ricerca
sperimentale. Tale attivazione persiste anche nelle cellule figlie. L’espressione di una molecola
colorata è vincolata all’espressione di una proteina di riferimento, ma viene utilizzata solo a
discrezione dello sperimentatore, tramite l’iniezione di un agente farmacologico. Le cellule madri
allora inizieranno la produzione stabile della molecola fluorescente, passandola anche alle cellule
figlie.
Modificazioni di questo tipo possono essere anche ottenute in un ristretto numero di cellule
staminali e progenitori anche grazie all’uso di vettori virali. Particolari virus possono essere
ingegnerizzati, e quindi perdere la loro capacità di riprodursi e da veicolare nelle cellule infettate
geni esogeni o modificati a scelta dello sperimentatore, inclusi quelli che modificano molecole
fluorescenti. I vettori virali sono iniettati nelle zone neurogeniche o nel mezzo delle colture. A
seconda del tipo, la sequenza genica che esso porta può introdursi nel DNA della cellula infetta o
restare nel citoplasma. Se si integra nel genoma, la progenie erediterà l’espressione della molecola
fluorescente, altrimenti no. Inoltre, alcune particelle virali riescono a modificare solo cellule in
attiva proliferazione, altre invece riescono a infettare anche cellule poco proliferative, come le
cellule staminali. L’insieme di queste manipolazioni biotecnologiche permette di studiare il
funzionamento delle cellule staminali e della loro progenie nella situazione nativa e a seguito di
particolari trattamenti farmacologici.
I vettori virali sono anche utilizzati per indurre o spegnere l’espressione di specifiche proteine
all’interno del bersaglio. Questo tipo di manipolazione permette di capire quel è il ruolo di un
certo macchinario molecolare nel funzionamento dei progenitori staminali neurali e delle cellule
che da essi derivano. Sovraespressione o inattivazione di specifiche proteine sono anche ottenute
in animali transgenici o mutanti, secondo le procedure della transgenesi classica, condizionale o
knock-out (procedura di rimozione di un certo gene, completa o condizionale).