microscopia_e_fluorescenza

ANATOMIA DEL MICROSCOPIO
1) Oculari
2) Torretta portaoculari
3) Braccio e basamento
4) Revolver portaobbiettivi
5) Obbiettivi
6) Tavolino traslatore
7) Condensatore
8) Fonte luminosa
Tutti i microscopi impiegati in campo biomedico hanno, nel loro corredo di ottiche,
un obbiettivo "ad immersione"; si tratta in generale di obbiettivi dotati di forte potere di ingrandimento
del campione e la sostanza in cui vengono immersi è quasi invariabilmente olio minerale per
microscopia, per cui portano scritto, sulla loro montatura. "oil" (oppure "oel" o ancora "Hl")
e sono in genere contrassegnati da una riga di colore bianco o nero.
Più specificamente si definiscono "ad immersione" quegli obiettivi
che possono essere usati unicamente interponendo una goccia di liquido
(in genere olio minerale, appunto) fra la loro lente frontale ed il vetrino coprioggetto del campione.
Ingr. oculare X Ingr. obiettivo = Ingr. totale
L’oculare porta inciso un numero sulla montatura che indica il suo potere di ingrandimento. Questo valore, moltiplicato per
l’ingrandimento dell’ obiettivo dà l’ingrandimento totale del microscopio nell’ osservazione visiva.
IL CONDENSATORE
I campioni da esaminare al microscopio ottico devono essere illuminati perché si possa formare una loro immagine
visibile nell’oculare e, di solito, questo viene ottenuto con "luce trasmessa", ovvero la luce attraversa i campioni stessi.
Il condensatore è un sistema di lenti posto al di sotto del tavolino traslatore del microscopio ed è provvisto di un
"diaframma di apertura" che permette di modificare l’ampiezza del cono di luce che da esso esce, adattandolo alla
AN (apertura numerica) dell’obbiettivo in uso; oltre a ciò il diaframma è dotato di un sistema di centratura e di
regolazione della distanza dal tavolino traslatore.
La funzione del condensatore è quella di mettere a fuoco sul piano focale posteriore dell’obbiettivo
l’immagine della sorgente luminosa, cosicché ogni punto del campione diviene a sua volta una sorgente luminosa
e la sua immagine potrà essere vista nitidamente attraverso l’oculare.
Il microscopio elettronico
Il microscopio elettronico si basa essenzialmente sugli stessi principi di quello ottico, ma fornisce ingrandimenti maggiori,
anche se le tecniche di impiego, allestimento dei preparati e interpretazione sono più complessi e costosi.
La sorgente luminosa è sostituita da un fascio di elettroni accelerati nel vuoto;
le lenti sono sostituite da campi magnetici ed elettrici che hanno un effetto convergente sugli elettroni.
Gli elettroni si associano ad una lunghezza d'onda molto più piccola rispetto a quella dello spettro visibile;
ciò determina un aumento del potere risolvente fino a circa 10 Å.
L'ingrandimento utile, tuttavia, non è superiore a 200 volte quello del M.O.C. per carenze tecniche che impediscono
di sfruttare al massimo le possibilità teoriche.
Dal momento che il materiale da esaminare è posto sotto vuoto,
esso deve essere preventivamente disidratato e ciò impedisce l'uso del microscopio elettronico su preparati viventi;
inoltre le sezioni di tessuto devono essere sottilissime per consentire il passaggio degli elettroni il cui potere di penetrazione
è molto basso. L'immagine fornita è invisibile all'occhio umano, ma può essere fotografata e raccolta su uno schermo
fluorescente che emette luce visibile sotto l'urto degli elettroni provenienti dal preparato; essa risulta in bianco e nero
con varie tonalità di grigio in corrispondenza della maggiore o minore trasparenza agli elettroni delle strutture cellulari.
Il microscopio elettronico può essere a trasmissione o a scansione: nel primo gli elettroni attraversano il preparato,
nel secondo incidono sulla materia, determinando l'emissione di elettroni secondari che, raccolti,
forniscono immagini dettagliate della superficie degli oggetti dei quali risulta una visione tridimensionale.
Molecola FITC
Spettro di assorbimento e di emissione
Molecola Rodamina
Struttura molecolare del Texas Red
Spettro di assorbimento e di emissione
Spettro di assorbimento e di emissione di vari fluorofori
Immunofluorescenza indiretta