Lezione 6
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Meccanismi di contrasto: Microscopia ottica Imaging Technique Brightfield (contrasto di ampiezza) Darkfield (contrasto di diffrazione) Contrasto di fase Tecniche speciali solo in trasmissione Imaging (mapping) Technique Differential Interference Contrast (DIC) Hoffman Modulation Contrast Oblique Illumination Polarizzazione Rheinberg Illumination Dispersion Staining Fluorescenza Campo chiaro (Bright Field, BF) È la tecnica “normale”: l’obbiettivo raccoglie tutta la luce che è trasmessa o riflessa dal campione. È basata sull’assorbimento della luce (o di alcune lunghezze d’onda) maggiore o minore da parte di aree diverse del campione che quindi risultano più o meno chiare (o di colore diverso). Quindi è una tecnica che si basa direttamente sul contrasto di intensità (o di colore). Per questo si chiama contrasto di ampiezza (l’intensità è il quadrato dell’ampiezza dell’onda). Campo scuro (Dark Field, DF) È la tecnica per oggetti che assorbono poco ma diffondono: l’obbiettivo raccoglie solo la luce che diffusa dal campione. L’illuminazione è fatta in modo tale che la luce che illumina il campione non entra nell’obiettivo. Risultano quindi chiari solo gli oggetti che diffondono, mentre il fondo risulta scuro. Contrasto di polarizzazione È la tecnica per oggetti birifrangenti: il fascio ordinario e straordinario acquistano una differenza di fase diversa per tipi diversi di cristalli e dipendente dallo spessore. La loro interferenza produce colori che permettono di identificare i diversi cristalli. L’anisotropia che genera birifrangenza può essere intrinseca al materiale o indotta da stress Immagini ortoscopiche Contrasto di fase È la tecnica per oggetti trasparenti e che non diffondono. Nell’attraversamento del campione la luce subisce però un cambiamento di fase che può venir sfruttato per creare interferenza con il fascio diretto. Applicato p.es. per il conteggio delle fibre di amianto Differential Intereference Contrast (DIC) Microscopia ottica: rapporto campione meccanismo Specimen Type Imaging Technique Specimen Type Transmitted Light Imaging Technique Reflected Light Transparent Specimens Phase Objects Bacteria, Spermatozoa, Cells in Glass Containers, Protozoa, Mites, Fibers, etc. Phase Contrast Differential Interference Contrast (DIC) Hoffman Modulation Contrast Oblique Illumination Specular (Reflecting) Surface Thin Films, Mirrors Polished Metallurgical Samples Integrated Circuits Brightfield Illumination Phase Contrast, DIC Darkfield Illumination Light Scattering Objects Diatoms, Fibers, Hairs, Fresh Water Microorganisms, Radiolarians, etc. Rheinberg Illumination Darkfield Illumination Phase Contrast and DIC Diffuse (Non-Reflecting) Surface Thin and Thick Films Rocks and Minerals Hairs, Fibers, and Bone Insects Brightfield Illumination Phase Contrast, DIC Darkfield Illumination Light Refracting Specimens Colloidal Suspensions powders and minerals Liquids Phase Contrast Dispersion Staining DIC Brightfield Illumination Darkfield Illumination Amplitude Specimens Stained Tissue Naturally Colored Specimens Hair and Fibers Insects and Marine Algae Amplitude Surface Features Dyed Fibers Diffuse Metallic Specimens Composite Materials Polymers Brightfield Illumination Polarized Illumination Fluorescent Specimens Cells in Tissue Culture Fluorochrome-Stained Sections Smears and Spreads Fluorescence Illumination Birefringent Specimens Mineral Thin Sections Hairs and Fibers Bones and Feathers Single Crystals Oriented Films Fluorescent Specimens Mounted Cells Fluorochrome-Stained Sections Smears and Spreads Fluorescence Illumination Birefringent Specimens Mineral Thin Sections Liquid Crystals Melted and Recrystallized Chemicals Hairs and Fibers Bones and Feathers Polarized Illumination Trasmissione Riflessione Scansione A cosa è dovuto l’ingrandimento nel SEM? Esempio 300mm 300m Risoluzione max 300m/600pixel 0.5 m/pixel Nessuna informazione può essere ottenuta sulla struttura interna del pixel sul campione Ingrandimento 300mm/300m 1000 X Il numero di pixel nello schermo e la dimensione dell’area scansionata definiscono la dimensione dell’area del campione corrispondente ad un pixel, cioè la risoluzione. L’ingrandimento è il rapporto tra la lunghezza della linea sullo schermo e quella sul campione. La risoluzione ha un limite inferiore nella dimensione del fascio. fascio Area sul campione corrispondente a un pixel Ingrandimento a vuoto (oltre la massima risoluzione) Specimen Image Mag=1 Mag=3 Differenza importante tra TEM e SEM • Ricordando che: il coefficiente di aberrazione sferica aumenta con la lunghezza focale delle lenti e questi due numeri hanno lo stesso ordine di grandezza (Cs ~ f/2) • Il TEM analizza piccoli campioni posti tra i pezzi polari della lente obiettivo, che quindi può essere operata a lunghezza focale molto piccola con (relativamente) piccoli valori del coefficiente di aberrazione alta risoluzione possibile (conseguenza secondaria: più alta è la risoluzione, minore spazio c’è per orientare il campione o per accessori vari). • Nel SEM grandi campioni sono posti fuori dalla lente obiettivo che è operata a grandi lunghezze focali limitata risoluzione (per raggiungere alte risoluzioni esistono SEM speciali, in cui piccoli campioni sono inseriti nelle lenti; sono necessari anche rivelatori speciali)
