Regolatori di crescita

Le tecniche di
coltura in vitro
Francesco Sunseri
La definizione
“… the aseptic culture of plant protoplasts,
cells, tissues or organs under conditions
which lead to cell multiplication or
regeneration of organs or whole plants “
(Murashige, 1963)
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Argomenti da trattare:
1. Concetti fondamentali / Storia
2. Tipi di cellule o tessuti
3. Processi di crescita
4. Regolatori di crescita
3
Che cosa sono
 La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo
fondamento nella totipotenza cellulare
 In tutte le piante vascolari l’embrione si evolve in
una struttura bipolare per la presenza di due
meristemi apicali
 Durante il ciclo della pianta tali meristemi
producono continuamente nuovi organi che si
aggiungono a quelli prodotti durante
l’embriogenesi
4
Che cosa sono
 Le piante vascolari sono state pertanto definite
organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale
fenomeno nelle piante non si assiste alla
separazione tra linea somatica e linea germinale
 Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono
modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le
strutture tipiche della riproduzione
 Per entrambe queste ragioni nelle piante
vascolari qualsiasi cellula somatica può
considerarsi un progenitore potenziale di un
nuovo individuo …
5
Coltura in vitro
 Il termine sottende a differenti metodologie che
consentono la crescita e lo sviluppo di cellule,
tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici
 La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si
può indurre anche da tessuti già differenziati che
subiscono un processo di sdifferenziamento
 Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli,
che possono essere mantenuti indefinitamente in
vitro o possono essere indotti a rigenerare organi
o piante intere
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Callo



Rappresenta la naturale risposta della pianta
ad una ferita
E’ una massa di cellule in attiva divisione per
la produzione di cellule indifferenziate
prodotte da espianti di tessuto vegetale
E’ formato da cellule totipotenti
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Coltura in vitro
 Tutti i vegetali possono essere considerati
sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro
 Alcune specie sembrano fare eccezione a tale
regola, ma è probabile una erronea scelta delle
condizioni colturali
 Infatti le condizioni colturali possono mostrare
differenze significative in relazione a sostanze
specifiche e condizioni microambientali utilizzati
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Principali caratteristiche
Si effettuano:
 su micro scala
 in condizioni ambientali
ottimizzate (nutrienti, luce,
temperatura)
 in assenza di microrganismi
(funghi, batteri, virus).
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1. Storia
 Teoria cellulare e totipotenza
 Formazione del callo e sostanze di crescita
 Prime colture cellulari
 Prime colture di tessuti vegetali
 Colture di organi vegetali
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Teoria cellulare ….
Le cellule furono osservate per
la prima volta nel 1664 da
Robert Hooke, che studiò con
un microscopio rudimentale
sottili fettine di sughero e vide
che esse erano formate da
elementi di forma regolare.
Egli chiamò cellule questi
elementi (dal latino cellula,
"piccola stanza"), perché esse
avevano l'aspetto di piccole
scatole.
Cork tissue as observed by Robert Hooke11
in 1664
Le prime colture cellulari….
…Haberlandt .. agli inizi del 1900
… propose il concetto di totipotenza
… cellule allevate in adatte conditizioni
Callo coltivato a partire dal cambio
(Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930)
… le cellule restavano vive ma non si
moltiplicavano
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Le prime colture di tessuti ….
- in funzione della scoperta dei
“Regolatori di crescita”
Distensione cellulare … ruolo delle auxine
Divisione cellulare ... ruolo delle citochinine
 Rigenerazione di tabacco ....
(Skoog and Miller) …. interazione tra auxine
e citochinine dava differenziazione.
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Successivi sviluppi …
 GA per la crescita dei germogli
 Aux + Cyt + zucchero
> sviluppo vascolare
 Colture di ‘strati sottili’
… interazione con altri fattori es. pH
14
 Il
primo uso commerciale di piante
propagate su mezzo artificiale è
stato fatto per la germinazione e lo
sviluppo di orchidee nel 1920
15
Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964
16
Pianta di tabacco da singola cellula
– Vasil & Hilderbrandt 1965
17
Coltura di organi vegetali ….
… ma la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno
sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura
artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962
 micropropagazione
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2. Tipi di cellule e tessuti
Molti tipi di cellule
Grado di specializzazione diversificato
- Meristematico
- Embrionale
- Riproduttivo
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Tessuti meristematici ...
Germoglio
... apicale,
… ascellare
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new leaf
tunica
apical
meristem
corpus
leaf trace
axillary
meristem
procambium
cortex
pith
21
Tessuti meristematici ...
Germogli ... apicali,
… ascellari
Foglie
Radici
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Tessuti embrionali ...
 Piante pre-formate
 Germinali / somatici
 Giovanile
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Tessuti riproduttivi ...
 Diploide / Aploide
 Femminile / Maschile
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3. Processi di crescita
 Moltiplicazione
 Dominanza apicale
 Differenziazione
 Crescita
 Divisione cellulare
 Distensione cellulare
 Fasi di sviluppo
 Giovanilità
 Dormienza
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3. Altri processi
 Fotosintesi
 Traspirazione e assorbimento dell’acqua
 Instabilità citologica
 Meccanismi fisiologici
 Manipolazioni fisiche
 Ambiente
 Genotipo
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4. Regolatori di crescita
 Le auxine
 Le citochinine
 Le gibberelline (GA)
 L’acido abscissico (ABA)
 L’etilene
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Regolatori di crescita
Auxine
 Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
 Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-
Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA,
IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e
più stabili
 Stimolazione della distensione cellulare in fusti e
coleoptili
 Promuovono la radicazione
 Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in
quelli apicali (inibizione della crescita delle
gemme laterali)
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Regolatori di crescita
Citochinine





Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
Un solo composto naturale la Zeatina;
analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e
Kinetin
Stimola la divisione cellulare
Promuove la formazione di gemme avventizie
Sono sintetizzate nel meristema radicale e
trasportate nel floema sotto forma di Zeatinriboside
29
Regolatori di crescita
Gibberelline




Questa classe comprende più di 70 composti,
varie forme dell’ acido gibberellico
In commercio sono disponibili diversi
formulati (GA3, GA4, GA9)
Stimola l’eziolatura dello stelo
Sintetizzate nelle giovani foglie
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Regolatori di crescita
Acido abscissico (ABA)




Esiste solo un componente naturale
Promuove l’abscissione delle foglie e la
dormienza dei semi
Gioca un ruolo dominante nella chiusura
degli stomi in condizioni di stress idrico
Ha un ruolo importante nell’embriogenesi
(aiuta la formazione di embrioni normali)
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Bilancio ormonale
Auxine
Alte
Citochinine
Basse
Formazione di radici dopo il taglio
Embriogenesi
Formazione di radici avventizie
Induzione a callo
Formazione di germogli avventizi
Crescita di germogli ascellari
Basse
Alte
32
Rapporto auxine : citochinine
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Azione dell’ormone per …..
 Applicazione + assorbimento
 Endogeno + applicato
 Accumulazione e assuefazione
 Interazione / Sequenza di applicazione
 Impulso o esposizione prolungata
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Mezzo di coltura in vitro








Elementi minerali (17 elementi essenziali)
Fonte d’energia e di carbonio (saccarosio)
Regolatori di crescita (fitormoni)
Vitamine
Composti organici
Acqua
pH (5.0-5.7)
Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum
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Composti inorganici




Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e
S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co,
Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si).
Disponibili formulazioni commerciali in
polvere
Murashige and Skoog Medium (1965) è il
mezzo di coltura più comune
Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente
utilizzato per colture cellulari in sospensione.
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Vitamine
Un ampio range di vitamine sono disponibili
e possono essere usate
 Generalmente, più è piccolo l’espianto, più
appropriata deve essere la scelta della/e
vitamine
 Un cocktail di vitamine è spesso usato
 L’inositolo di solito deve essere aggiunto a
maggiori concentrazioni (100mg/l)

37
Vitamine
Tiamina
 Piridossina
 Acido nicotinico
 Biotina
 Acido Citrico
 Acido Ascorbico
 Myo-inositolo

38
La rigenerazione può avvenire
 via
organogenesi
 via embriogenesi somatica
39
Organogenesi



L’organogenesi prevede la formazione
di germogli, foglie e radici e si verifica
quando si differenziano in vitro centri
meristematici unipolari quali le gemme
avventizie
Questi organi possono derivare da
meristemi preesistenti o da cellule
indifferenziate
Come per l’embriogenesi può aversi
una fase intermedia di callo, ma spesso
si osserva senza il passaggio da questo
stadio
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Organogenesi
La differenziazione di radici e germogli in colture di
tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxinecitochinine, e la differenziazione dell’organo potrebbe
essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni
relative delle due sostanze nel mezzo di coltura
1957 Skoog and Miller
41
Embriogenesi Somatica


L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni
da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione
comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che
caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico
Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di
connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un
embrione cotiledonare
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Acclimatamento

Le piante ottenute in vitro devono
essere preparate alla sopravvivenza in
vivo
Alta umidità
 Luce
 Temperature tra 20-25°C
 Elementi nutritivi
 Terreno adatto

43
44
Applicazioni delle colture in vitro
micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni
rigenerazione e trasformazione genetica
induzione di variazione somaclonale
ottenimento di aploidi da micro e macrospore
allevamento e mantenimento di piante virus esenti
manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica
conservazione del germoplasma
produzione di metaboliti di interesse industriale
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Plant Genetic
Transformation
Overview
Introduzione
 Plant genetic transformation
 Stato attuale delle PGM
 Trends futuri e problemi

47
Introduzione
Potenzialità delle biotecnologie vegetali
 Uso di nuovi geni introdotti
 Tratti che i plant breeders vorrebbero
trasferire

48
Tratti genetici di interesse per i plant
breeders





Alta produttività
Alta qualità
nutrizionale
Adattabilità all’intercropping
Fissazione
dell’azoto




Resistenza a stress
idrico
Resistenza a stress
biotici
Adattabilità alla
meccanizzazione
Insensibilità al
fotoperiodo
Eliminazione di
composti tossici
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Sviluppo dei cibi GM
1950
Prima rigenerazione di piante intere da in vitro culture
1973
La ricerca sviluppa capacità ad isolare geni
1983
1^ pianta transgenica : tabacco resistente ad antibiotico
1985
PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono saggiate in
campo per la prima volta – TRATTI UTILI
1990
Primo campo di cotone GM condotto con successo
1994
1995
Pomodoro Flavr-Savr – 1^ FDA approvazione per un cibo
Soia Roundup della Monsanto approvata per il
commercio negli Stati Uniti
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Metodi di trasformazione genetica




Trasformazione biologica
Biolistico - gene gun o particle gun
Elettroporazione
Microiniezione
51
Trasformazione biologica
 Agrobacterium tumefaciens & A. rhizogenes
 causano infezione nelle piante
 le formazioni tumorali sono la conseguenza del
trasferimento, da parte del batterio, di un segmento
di DNA, chiamato T-DNA
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Agrobacterium gene transfer
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Esempio di protocollo per la trasformazione con Agrobacterium
Espianto fogliare
Incubare con Agrobacterium
Sterilizzare
Blot disk dry
Leaf disk
Transferire su mezzo per indurre
germoglio + carbenicillina + selettivo
per il transgene (es. kanamicina),
coltivare/subcoltivare fino a che si
formano i germogli
Excidere i germogli dal callo, trasferire
su mezzo di radicazione
Trasferire su mezzo di induzione del
germoglio + carbenicillina; in
coltura ~ 2 giorni
Trasferire le plantule nel
terreno appena si formano
le radici
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Tratti transgenici inseriti
•74% resistenza ad erbicidi (soia, canola)
•19% resistenza ad insetti (mais, cotone)
•7% altri caratteri
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