Elettroforesi

Elettroforesi
Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,
Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico
Principio:
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo
elettrico.
Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.
Forza elettrica : Fel = q · E
Forza frizionale : Ffr = f ·v
(f = 6 r )
Quando le forze si bilanciano:
q ·E = f ·v

q
v= —·E
f
mobilità elettroforetica :
v
q
 = — = —
E
f
Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:
V=RI
W = R I2

Operare a I costante

Dissipare l’eccesso di calore
Acidi nucleici
ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta
su gel
Formazione di un gel di poliacrilammide
CH2
• Acrilamide, bisacrilamide  monomeri
• Ione perossodisolfato  iniziatore
• TEMED  catalizzatore
• L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”
Se q  L,  in
assenza di gel e’
pressoché
indipendente dalle
dimensioni
molecolari
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV
SDS-PAGE
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
Colorazione con Coomassie
Colorazione con nitrato di Ag
Si possono effettuare valutazioni
quantitative delle bande proteiche
col densitometro: misurazione della
luce trasmessa quando un raggio luminoso
è fatto passare attraverso il gel colorato.
Si hanno picchi di assorbimento di cui si può
calcolare l’area che è proporzionale
alla quantità di proteina
Applicazioni della SDS-PAGE
•
•
•
•
Purezza del campione
Determinazione del PM
Western blot
Purificazione della proteina
Applicazioni dell’SDS-PAGE
Determinazione del PM
Elettroforesi delle proteine plasmatiche