tossicologia

Tossicologia Sperimentale Animale:
Studi in Acuto, a Medio e a Lungo
Termine
Milano, 24 Ottobre 2008
Definizione
• La tossicologia è la branca della medicina, il
cui interesse si estende anche alla chimica,
che studia sintomi, meccanismi e trattamenti
degli avvelenamenti di persone e animali ad
opera di droghe, veleni o farmaci. Il principale
parametro per determinare la tossicità di una
sostanza è la dose: infatti, quasi tutte le
sostanze, in certe dosi o in determinate
circostanze possono essere tossiche.
Egyptians
The Ebers Papyrus
 Dated to 1500 BCE,
compiles material back to
3000 BCE
 Named for Egyptologist
Georg Moritz Ebers (18371898)
 20 m scroll with 700
drugs in 900 formulas
 Indications, dosages and
appropriate spells.
• Theophrastus Phillippus
Aureolus Bombastus von
Hohenheim, Paracelsus
(1493-1541)
• The Father of Toxicology
“The dose makes the poison”
Storia della Tossicologia
(alcune date fondamentali)
•
•
•
•
•
•
1535 - Paracelsus: dose
1578 - Harvey: moderna scienza sperimentale
1775 - Potts: primo caso di “occupational cancer”
1900 - Ehrlich: recettore
1927 - Trevan: LD50
1961 - Truhaut: NOAEL
Tossicologia
(discipline di competenza)
•
•
•
•
Farmaci
Alimenti
Ambiente
Occupazionale
Iter per lo sviluppo di un farmaco
Autorità regolatorie:
– Nazionali
• FDA (USA)
• MHLW (Giappone)
– Regionali
• EMEA (Europa)
FDA's Mission Statement
The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety,
efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products,
medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit
radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping
to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and
more affordable; and helping the public get the accurate, science-based
information they need to use medicines and foods to improve their health.
European Medicines Agency
European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European
Union with headquarters in London.
Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal
health, through the evaluation and supervision of medicines for human and
veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of
medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together
the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42
national competent authorities. It cooperates closely with international
partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.
(MHLW)
Organization of the Ministry of Health, Labour and Welfare
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（「緊」緊急情報、「組」組織・制度概要、「所」所管の法人、「法」所管の法令
、告示・通達等、「国」国会提出法案、「審」審議会、研究会等、「統」統計調査
結果、「白」白書、年次報告書等、「パ」パブリックコメント、「適」法令適用事
前確認手続、「申」申請・届出等の手続案内、「調」調達情報、「予」予算及び決
算の概要、「評」評価結果等、「記」大臣等記者会見、「報」報道発表資料、「情
」情報公開、「お」お知らせなど、「行」行政分野ごとの情報、「Ｑ」よくあるご
質問）
Schema generale dello sviluppo di una NCE (New Chemical
Entity)
100 000 NCE
esaminate
2-3 farmaci fanno profitto
0.002%-0.003%
discovery
sviluppo
Selezione
Inizio sperimentazione
clinica di Fase I
First human dose
(FHD)
Screening
tossicologico
Sperimentazio
ne esplorativa
sul paziente
Fase II
Safety,
pharmacokinetics
Tossicologia
acuta e
subacuta per
FHD
Mutagenesi in
vitro
Tossicologia
sulla funzione
riproduttiva
Safety
pharmacology
Mutagenesi
in vivo
Studi
definitivi
sul
paziente
Fase III
Tossicologia cronica
Cancerogenesi
Registrazione
Tossicologia
(tipo di studi)
• IN VIVO: esposizione acuta e cronica,
potenziale cancerogeno, effetto sulla
riproduzione, teratologia
• IN VITRO: culture cellulari (animali e
umane), microsomi
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Regolamentata in Italia dal decreto 116 del 27
gennaio 1992 (applicazione di normative CEE del
1986)
• provenienza degli animali da impiegare per le
sperimentazioni, condizioni di stabulazione,
modalità di sperimentazione, autorizzazioni per
personale e strutture
Sperimentazione animale in
Tossicologia
• Topi 60%
• Ratti 20%
• Conigli 5%
• Altre specie ( Cavie, Cani, Rettili, Scimmie)
Specie maggiormente utilizzate
Topo
• durata vita
• peso adulto
• maturità sessuale a
• ciclo estrale
• gestazione
• numerosità prole
• età allo svezzamento
• frequenza cardiaca
• pressione arteriosa
• frequenza respiratoria
1-3 anni
20-40 g
50 giorni
4-5 giorni
20 giorni
10-12
20 giorni
600 batt/min
100-160 mmHg
160 atti/min
Specie maggiormente utilizzate
Ratto
• durata vita
• peso adulto
• maturità sessuale a
• ciclo estrale
• gestazione
• numerosità prole
• età allo svezzamento
• frequenza cardiaca
• pressione arteriosa
• frequenza respiratoria
2,5-3 anni
300-600 g
60 giorni
4-5 giorni
20-23 giorni
8-14
20 giorni
300-400 batt/min
60-180 mmHg
80 atti/min
Specie maggiormente utilizzate
Coniglio
• durata vita
• peso adulto
• maturità sessuale a
• gestazione
• numerosità prole
• età allo svezzamento
• frequenza cardiaca
• pressione arteriosa
• frequenza respiratoria
5-13 anni
4-6 kg
6-10 mesi
30-35 giorni
4-10
30-45 giorni
100-300 batt/min
60-130 mmHg
30-60 atti/min
Estrapolazione da animale a uomo
 Variabilità individuale
 Variabilità tra specie
 Variabilità tra razze
Ulteriori informazioni dirette di effetti tossici sull’uomo:
 controlli medici di lavoratori esposti a specifici
composti
 studi epidemiologici
 rilievi su pazienti dopo assunzione di dosi eccessive di
farmaci o esposti a quantità elevate di sostanze
chimiche
Estrapolazione da animale a uomo
Un maggior grado di attendibilità di
possibili effetti tossici sull’uomo da studi
su animali può derivare da:
• impiego di diverse specie animali
• accurate indagini sui meccanismi e velocità di
biotrasformazione nelle varie specie
• impiego di condizioni simili alle situazioni
di esposizione dell’uomo
Estrapolazione da animale a uomo
Valutazione della “safety” o ragionevole
indicazione che non verifichino danni a
uomo o ambiente se il composto in oggetto
viene impiegato alle dosi e condizioni
proposte
ADI (acceptable daily intake) o dose giornaliera
accettabile
stabilita in base al dato di
NOAEL: no observable adverse effect level
Estrapolazione da animale a uomo
ADI quantità giornaliera di un composto che,
assunta per tutto il periodo della vita, appare
essere priva di apprezzabili rischi per la salute,
sulla base delle conoscenze al momento
disponibili
NOAEL massima dose che non ha determinato,
sulla base del più sensibile indicatore biologico,
alcun segno di tossicità nella più reattiva specie
animale trattata
GLP – “Good Laboratory Practice”
Proposte dalla FDA nel 1978 raccolgono requisiti
richiesti per effettuare studi sperimentali,
stesura di protocolli, raccolta e archiviazione
della documentazione relativa
Anche l’EPA (Environmental Protective Agency)
ha proposto GLP per lo studio di effetti
sull’ambiente
BPL – “Buone pratiche di laboratorio”
Regolamentate in Italia dal Decreto Legislativo
no. 50 del 2 Marzo 2007
Attuazione delle direttive CEE in materia di
Ispezione e verifica della buona prassi di
laboratorio
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Studi di tossicità:



ACUTA
A MEDIO TERMINE (subacuta o subcronica)
A LUNGO TERMINE
Linee guida definite da OECD
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Singola dose
TOX. ACUTA
TOX. A MEDIO
TERMINE
TOX. A LUNGO
TERMINE
Tox. subacuta
Tox. 14- 28
giorni
Tox. 90-180
Tox. subcronica giorni
Tox. > 180
giorni (fino a 2
anni)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità Acuta (I) singola dose
Linee guida OECD no. 420 – 423- 425
Permette di identificare la categoria di un
composto tossico
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità Acuta (II) singola dose
Singola dose orale (via di somm. nell’uomo)
Roditori (età 8-12 settimane)
Solitamente femmine (più sensibili)
Osservazioni fino a 14 giorni
Registrazione del peso corporeo e necroscopia
Classificazione di Tossicità Acuta
• In accordo con il GHS (Globally Harmonized
System for Chemical Substances and
Mixtures)
• Categoria
• 1
< 5 mg/kg
• 2
5-50 mg/kg
• 3
50-300 mg/kg
• 4
300-2000 mg/kg
• 5
2000-5000 mg/kg
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità Acuta (III) singola dose
Limit test: usato quando si ritiene che la sostanza
in esame non sia tossica. Dose testata 2000
mg/kg (o in casi particolari 5000 mg/kg)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità Acuta (IV) singola dose
• Sighting study (studio bersaglio):
• fase esplorativa partendo da una dose
selezionata tra 5, 50, 300 e 2000 mg/kg. Se non
si hanno riferimenti sulla possibile tossicità, la
dose di partenza sarà di 300 mg/kg.
Sighting study (studio bersaglio):
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità Acuta (V) singola dose
• Main test:
• Si parte dalla dose indicata dal sighting study. Si
utilizzano 5 animali per ogni dose, di un solo sesso.
• Se si rende necessario effettuare il main test su più
dosi, si attendono 3-4 giorni tra una dose e l’altra
• Valutati: mortalità, variazioni in peso, analisi istologica
Main test
START
5 female
5 mg/kg
A
B
5 female
50 mg/kg
A
C
B
5 female
2000 mg/kg
5 female
300 mg/kg
C
A
B
C
A
B
Study concluded
GHS category
1
2
2
3
3
4
4
5
5
C
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità a medio termine (I) – 14-28 giorni
 Linee guida OECD no. 407
 permette di identificare NOAEL, LOAEL (lowest
observed adverse effect level)
 14-28 giorni di trattamento giornaliero
 Roditore e non roditore
 Sia maschi che femmine (5+5)
 Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti
tossici, una non tossica, una o più intermedie)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità a medio termine (II) – 14-28 giorni
valutazione degli effetti: variazioni di peso, di
consumo del mangime, esami ematologici,
ematochimici, esami delle urine, esami postmortem (peso degli organi, istologia)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità a medio termine (III) - 90-180 giorni
 Linee guida OECD no. 408 (roditori), 409
 permette di identificare “maggiori effetti tossici, organi
bersaglio e possibilità di accumulo”
 90 -180 giorni di trattamento giornaliero
 Roditore e non roditore
 Sia maschi che femmine (10+10)
 Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti
tossici, una non tossica, una o più intermedie)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità a medio termine (IV) - 90-180 giorni
valutazione degli effetti: variazioni di peso,
consumo di mangime, esami ematologici,
ematochimici, esami delle urine, esami postmortem (peso degli organi, istologia)
Sperimentazione animale in
Tossicologia
Tossicità a lungo termine (I) - >180 giorni
 permette di identificare se il farmaco è potenzialmente
cancerogeno
 6-24 mesi di trattamento giornaliero
 Roditore e non roditore
 Sia maschi che femmine (10+10)
 Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti
tossici, una non tossica, una o più intermedie)
Test Report
Test Substance
Vehicle
Test animals
Test conditions
Results (with Statistic)
Discussion of Results
Conclusions