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Capitolo 7
Conclusioni e sviluppi futuri
Capitolo 7:
Conclusioni e sviluppi futuri
Questo lavoro di tesi ha portato a due differenti evidenze sperimentali.
Per quanto riguarda il progetto condotto sulle NSC murine, in merito al VEGF, possiamo
concludere che quest’ultimo, aumenta la proliferazione in vitro delle staminali, sia in adesione
che in sospensione rispetto alla sola cultura con FGF2.
Inoltre, L’esperimento di immunostaining ci ha permesso di constatare come il VEGF
mantenga inalterate le tre forme differenziate, neuroni, astrociti e oligodendrociti, in colture di
NSC indipendentemente dal fatto queste siano esposte al VEGF endogeno durante la fase di
proliferazione in sospensione o durante la fase di differenziamento in adesione. Inoltre i dati
relativi al differenziamento in astrociti ci permette di constatare un notevole aumento in
numero di quest’ultimi nella condizione FGF2+VEGF rispetto alla condizione di controllo
negativo (solo FGF2), confermando così i dati presenti in letteratura relativi alle NSC di ratto.
Un lavoro presentato nell’aprile del 2005, infatti ha mostrato come in vitro il VEGF
promuova la proliferazione e la crescita di astrociti a partire da NSC di ratto. [Mani05]
Infine, possiamo concludere dicendo che il confronto strutturale tra il VEGF e l’FGF2 e in
particolare tra i recettori dei due fattori di crescita, formula delle ipotesi che non vengono
smentite dai lavori presenti in letteratura, ma che anzi vanno nella direzione dei dati empirici
dimostranti una relazione funzionale tra il VEGF e l’FGF2. Inoltre la relazione mostrata nei
nostri esperimenti pare essere di tipo sinergico/additivo ma non conflittuale, con la
cosiderazione che angiogenesi e neurogenesi siano in qualche modo legate tra di loro,
seguendo però pathway differenti.
L’altro aspetto del lavoro, ha riguardato lo studio della capacità di apprendimento dei
neuroni derivati da NSC e lo studio della possibilità di decodificare tali segnali.
Diversi esperimenti, come mostrato nei capitoli precedenti, hanno dimostrato che le cellule
nervose sono in grado di rispondere in maniera simile quando sono sollecitate da stimolazioni
similari. Anche in questo esperimento, come in quelli effettuati precedentemente nel nostro
gruppo e descritti nella tesi triennale (Reti neurali ibride biologiche-elettroniche:
sperimentazione ed analisi, http://www.redazionionline.it/pizzi/default.asp), i neuroni hanno
dimostrato tale capacità: apprendere degli stimoli sensoriali simulati da pattern di bit
rappresentanti quattro direzioni: “su”, “giù”, “destra”, “sinistra”.
Con l’analisi effettuata si è cercato di capire in quale parte delle risposte delle cellule è
contenuta abbastanza informazione da poter classificare tale risposte sulla base di quanto
registrato in una fase precedente. Dai diversi test effettuati sulle diverse porzioni del segnale
risulta evidente che nei primi 400ms, delle risposte delle cellule, è contenuta abbastanza
informazione per cui ha senso registrare tale risposte e classificare dei successivi segnali
considerando solo la parte iniziale del segnale. Considerando l’intero segnale e quindi anche
la parte finale quella più attenuata possono ridurre le informazioni contenute nei primi 400
ms.
I risultati migliori avvengono con uno strato di Kohonen costituito da 12 neuroni. Il che
significa che bastano 12 unità per poter distinguere i quattro stati e classificarli in maniera
efficiente. Tarando la rete artificiale offline è stato possibile migliorare le prestazioni fino ad
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ottenere una classificazione praticamente di tutti i segnali e un riconoscimento, sempre, di
due delle quattro direzioni, sbagliando sulle altre due direzioni in un numero limitato di casi,
utilizzando la tecnica z-score. Ma se l’analisi effettuata sui neuroni vincenti porta a poter
affermare la presenza di una differenza funzionale nei segnali, deve esistere una procedura in
grado di individuare queste specificità: o uno z – score ben tarato oppure un qualsiasi altro
algoritmo. Un possibile algoritmo appare essere quello che ricerca la maggioranza dei neuroni
vincenti in una serie di epoche.
Infatti, spesso nelle configurazioni dei neuroni vincenti è sempre un medesimo neurone a
vincere. Ad esempio nella configurazione di rete che analizza l’intero segnale con i seguenti
parametri: 12 neuroni sullo strato competitivo, un tasso di apprendimento dello 0,04 ed un
numero di epoche pari a 10, compaiono le seguenti serie di neuroni vincenti:
Per lo stato di Giù:
10 5 5 5 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
55577777777777777777
22777777777777777777
10 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
66666666666666666666
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
66666555555555555555
56555555555555555555
77777777777777777777
66666666666666666666
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
22222222222222222222
55555555555555555555
77777777777777777777
66666666666666666666…
Per lo stato di Su:
…5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
77777773733333333333
7 7 7 7 7 7 7 11 7 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
77777777777777777777
00707770700000000000
11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
11 11 11 11 11 11 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
6 7 7 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 5 5
6 7 7 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
6 7 7 3 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
7 7 7 3 3 3 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
7 7 7 3 3 3 3 3 3 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
7 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 11 11 11
77733333333333333333
8 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3…
Per lo stato di Destra:
56667677777777777777
88888888888877777777
22222222222222222222
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
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55555555555555555555
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
22222222222222222222
55577777777777777777
66677777777777777777
99999999999999999999
55557777777777777777
99999997777777777777
88888888887777777777
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Per lo stato di Sinistra:
11111111111111111111
78755556556556666666
77755556555556556666
77555555555555556555
55555555555556556556
77777777777777776776
00000000000000006000
88888888888888886888
66666666666767777777
55555555555555555557
88888888888888888887
00000000000000000007
11111111117777777777
00000000000000000000
00000000000000000000
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
22222222222222222222
Si vede chiaramente come sia spesso lo stesso neurone a vincere nonostante la rete “punisca”
il vincitore con un valore pari a quello del tasso di dimenticanza. In questo caso un algoritmo
di conteggio proporzionale dei neuroni vincenti potrebbe riconoscere facilmente tutte e
quattro le direzioni.
È necessario, inoltre, un ulteriore lavoro per arrivare a capire se non tutti i segnali vengono
classificati perché il problema deriva dalla ricerca di una ulteriore configurazione di rete
ottimale, oppure il segnale di stimolazione può essere reso più efficace, o se ci sono stati dei
problemi a livello hardware o dei problemi con i neuroni e la loro adesione alla piastra.
Esperimenti di questo tipo che utilizzano neuroni umani sono ancora all’inizio e l’utilizzo di
queste cellule comporta una serie di problemi derivanti dalla loro complessità, anche se come
già detto è da apprezzarne l’adattabilità (per esempio non ci è stato possibile effettuare gli
stessi esperimenti, con gli stessi MEA utilizzando cellule neurli isolate da cerveletti i ratto
perché queste cellule, morivano entro 36 ore dalla piastratura).
Va notato che nell’esperimento con le cellule indifferenziate la loro reazione alle
stimolazioni ha dato risultati completamente random (su 15 test sono stati indovinati solo una
configurazione indicante lo spostamento di su, una per lo spostamento sinistro, ed uno per lo
spostamento inferiore), mentre, nell’esperimento on line, le cellule differenziate su 23 test
hanno risposto correttamente a quattro spostamenti inferiori su quattro impartiti ed a quattro
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spostamenti superiori su cinque impartiti. Le risposte su destra e su sinistra sono state invece
riconosciute, in 11 casi su 13, da classificazioni dello stato di su e giù.
È importante notare che lo stato di su e giù sono stati gli ultimi pattern somministrati in
training: questo potrebbe far pensare che le cellule li abbiano memorizzati meglio
prediligendo poi la loro scelta.
Possiamo comunque concludere che i neuroni generati da cellule staminali neurali adulte
reagiscono in modo organizzato a stimoli simulati differenziati. Questa “organizzazione” della
rete biologica suggerisce l’esistenza di una qualche forma di sinapsi (chimica?, elettrica?) che
permetta ai neuroni adesi al MEA di comunicare per rispondere agli stimoli in “input”. Questa
osservazione va nella direzione dei dati empirici dimostranti l’esistenza di sinapsi funzionali
in colture di cellule neurali derivate da cellule staminali neurali [Hiroki04].
I risultati ottenuti hanno permesso di portare avanti in tempi brevi un nuovo esperimento con
una rete neurale artificiale pretarata ad un attuatore robotico reale al posto del simulatore a
video.
Il robot telecomandato (figura 1) risponde a diversi segnali e può spostarsi in tutte le
direzioni. L’esperimento che verrà effettuato sarà il primo in cui viene creata una creatura
ibrida umana – robotica in grado di manifestare un comportamento intelligente. Ma lo scopo
di questa ricerca non è quello di creare ibridi, bensì di verificare la possibilità di connessione
diretta fra cellule cerebrali e attuatori al fine di sostituire porzioni danneggiate del cervello o
degli arti.
Figura 1 L'attuatore robotico che sostituirà, nel prossimo esperimento il segnale video
In quest’ottica gli esperimenti proseguiranno in tre direzioni:
-- Miglioramento del sistema di apprendimento e decodifica dei segnali neurali attraverso test
di risposta a stimolazioni con diverse caratteristiche elettriche (forma d’onda frequenza e
durata), e ottimizzazione del sistema neurale artificiale
-- Miglioramento del sistema di connessione microelettrodi – neuroni
-- Aumento del numero di connessioni e ottimizzazione della connessione fra neuroni ed
elettrodi abbassando la resistenza di contatto e migliorando la corrispondenza uno a uno fra
MEAs e neuroni
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-- Progettazione di sistemi robotici più complessi, con aumento del numero e della
complessità delle stimolazioni . le stimolazioni potranno essere direttamente prodotte
dall’ambiente e recepite dai neuroni umani attraverso un sistema di sensori montati sul robot.
Come si può osservare analizzando i grafici di output, i nostri risultati sembrano suggerire
l’esistenza di una forma di apprendimento neurale diverso da quello “classico” (vedi capitolo
4), in base alle sole frequenze di spike o meglio ancora in base alla assunzione che tutte le
risposte naurali siano nella sola forma di potenziale d’azione, quindi con stessa ampiezza,
forma e durata, sempre, a prescindere dal tipo di stimolo fornito in input .
La rete neurale artificiale ci ha permesso di decodificare l'andamento degli spikes in senso
complessivo, senza scegliere una particolare tecnica come quelle descritte nel capitolo 4, ma
(come è tipico delle ANN) guardando alla loro organizzazione complessiva. Questo ci
permette di ipotizzare una forma di risposta neurale codificabile anche in base alle ampiezze
degli spike. Questo ovviamente non ci permette di escludere la forma di risposta “classica”,
ma non preclude l’esistenza di altre forme di “codice neurale” ad oggi sconosciute. Tutti i
colleghi, nel mondo che effettuano esperimenti di apprendimento neurale su MEA, partono
dal presupposto che debba essere analizzata la sola forma di “spike” conosciuta e la sola
frequenza di output, o il solo timing di singolo spike, e ponendo limiti di voltaggio e di tempo
(in input) diversi dai nostri, probabilmente non hanno avuto la possibilità di osservare i
fenomeni da noi mostrati.
.
Rimanendo dell’idea che il cervello umano, o comunque mammifero, sia l’organo più
complesso e affascinante, risulta alquanto limitante credere che l’informazione che viaggia tra
i neuroni e tra i neuroni e le altre cellule dei diversi tessuti costituenti il nostro organismo, sia
ricoducibile alla sola forma di spike e sia codificata con il solo utilizzo delle frequenze.
Ad avvalorare la nostra tesi è anche l’evidenza sperimentale del fatto che durante le fasi di
apprendimento e di memoria, accadano a livello neuronale, diversi e complessi fenomeni,
ancora chiaramente del tutto sconosciuti, che permettono un enorme scambio di informazione
tra cellula e cellula, informazione che ha la capacità di passare dalla forma elettrica alla
chimica (e viceversa), in periodi di tempo estremamente brevi per la complessità del
messaggio.
Esperimenti successivi e sempre migliorati potranno dare un contributo alla soluzione di
questo enigma scientifico.
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