Caratterizzazione del ruolo dell`enzima ADAR1 nella

Caratterizzazione del ruolo dell’enzima ADAR1 nella patogenesi della SINDROME DI
AICARDI-GOUTIÈRES
Elisa Orecchini1, Loredana Frassinelli1, Ernesto Picardi2, Simona Orcesi3,4, Cristina Cereda3, Daisy Sproviero3, and Alessandro Michienzi1
1. Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”
2. Department of Biosciences, Biotechnologies and Biopharmaceutics. University of Bari "Aldo Moro"
3. Genomic and post-Genomic Center and Child Neurology and Psychiatry Unit, Fondazione "Istituto Neurologico Casimiro Mondino
4.International Aicardi-Goutières Syndrome Association (IAGSA)
INTRODUZIONE
Il nostro gruppo di ricerca da diversi anni è interessato allo studio del ruolo funzionale dell’enzima cellulare ADAR1.
ADAR1 è un enzima che catalizza reazioni di modificazione (“editing”) della sequenza delle molecole di RNA a doppio filamento (Figure 1A e 1B) modulando in questo modo
l'espressione genica (Figura 1C).
Negli ultimi anni il nostro contributo scientifico ha permesso di determinare il ruolo dell’enzima ADAR1 nel normale funzionamento sia dei parassiti esogeni (virus) che di quelli
endogeni (retroelementi). In particolare, abbiamo dimostrato come ADAR1 funzioni da fattore provirale per il virus dell’immunodeficienza acquisita (HIV-1), capace cioè di stimolare la
replicazione del virus (Figura 2). Più recentemente abbiamo dimostrato come questo enzima funzioni da inibitore del processo di retrotrasposizione degli elementi mobili del nostro
genoma (LINE-1 e Alu) (Figura 3).Questi elementi mobili sono sequenze di DNA capaci di copiarsi e spostarsi in altre sedi del nostro genoma inducendo cambiamenti (mutazioni) che
possono essere deleteri per la nostra salute.
Il nostro scopo è quello di creare un gruppo di lavoro interdisciplinare costituito dal nostro gruppo di ricerca, da ricercatori dell’Istituto Neurologico “Casimiro Mondino” e dell’Università
di Bari e supportato dall’associazione IAGSA, con lo SCOPO di determinare le disfunzioni molecolari dell’enzima ADAR1 nelle cellule dei pazienti AGS (AGS6).
Il gene ADAR1 è mutato nel 7% dei pazienti AGS, ma i meccanismi molecolari che legano le mutazioni di ADAR1 alla patogenesi della AGS sono ad oggi sconosciuti.
La nostra ipotesi è che le mutazioni in ADAR1 identificate nei pazienti AGS6 hanno un effetto marcato sulla biochimica e funzionalità dell’enzima e sui suoi bersagli molecolari
alterando in maniera drammatica l’espressione genica delle cellule dei pazienti.
.
B)
A)
Z-DNA-binding
Z-DNA-binding
dsRBD
dsRBD
Deaminase
Deaminase
ADAR1 p150
ADAR1 p150
ABBIAMO DIMOSTRATO CHE ADAR1 E ADAR2
STIMOLANO LA REPLICAZIONE DI HIV-1
“IL MECCANISMO COPIA ED INCOLLA”
DEI RETROTRASPOSONI LINE-1
ADAR1 p110
ADAR1 p110
ADAR2
ADAR2
ADAR3
R
R
C)
Figura 1. A) ADAR1 è un enzima che lega le molecole di RNA a doppio
filamento. B) La famiglia degli enzimi ADAR nell’uomo. C) Effetto dell’attitività
catalitica dell’enzima ADAR1
Figura 2
Figura 3. ADAR1 inibisce il meccanismo di copia ed incolla dei
retrotrasposoni LINE-1
RISULTATI PRELIMINARI e CONCLUSIONI
In Figura 4A sono mostrati i siti dei cambiamenti della proteina ADAR1 nei pazienti che hanno mutazioni in questo gene (AGS6). Molti dei cambiamenti avvengono in regioni
fondamentali per la funzione dell’enzima. Abbiamo condotto esperimenti preliminari utilizzando cellule immortalizzate di pazienti AGS6 e dimostrato che l’espressione della proteina
ADAR1 e la sua attività catalitica sono alterate (Figure 4B e 5). Inoltre l’espressione di una classe di RNA cellulari (microRNA) identificati come bersagli della proteina ADAR1 sono
anch’essi modulati rispetto al loro livello misurato nelle cellule immortalizzate di donatori sani. Questi risultati sono molto promettenti perché indicano che effettivamente l’attività
dell’enzima è in parte compromessa.
Il nostro scopo è di continuare questi esperimenti su un numero maggiore di pazienti AGS6 e di utilizzare le più recenti tecniche della biologia molecolare e cellulare per studiare in
maggior dettaglio le alterazioni dell’attività dell’enzima ADAR1. Quindi la nostra Ricerca dovrebbe permetterci di determinare sia le disfunzioni molecolari indotte dalle mutazioni nel
gene ADAR1 nei pazienti AGS6 che fornire bersagli per futuri approcci terapeutici.
A)
B
C
A
A/G T
G
G
G
C
T A/G G
G
C
A C
A
T
A/G
G
C
C
C
T
A/G
G
39%
19%
8%
AGS6.2
ADAR1
-p150 isoform
50%
45%
14%
3
2,5
2
1,5
1
0,5
-p110 isoform
0
0%
ADAR2
AGS6.1
miR125a-5p
miR221
T
69%
63%
control
VTI1A (site1)
PUS (site1)
Relative expression
G
ATM (site2)
Relative expression
ATM (site1)
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
58%
53%
16%
Actin
miR181b
control
AGS6.2
Figura 4. A) Mutazioni nel gene ADAR1identificate nei pazienti AGS6 B) In
cellule di pazienti AGS6 immortalizzate l’espressione di di ADAR1 è ridotta
A
A
A/G G
45%
G
T
G
A/G
59%
T
T
C
C A A/G G
G
30%
4%
8%
39%
Figura 5. In cellule di pazienti AGS6 immortalizzate l’attività
catalitica dell’enzima ADAR1 è alterata
1,5
1
0,5
0
Relative expression
T
2
Relative expression
APOOL (site1) APOOL (site2) APOOL (site3)
mir19b
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Figura 6. In cellule di pazienti AGS6 immortalizzate l’espressione di
alcuni RNA è alterata