Legenda per la descrizione tassonomica

Legenda per la descrizione tassonomica
p__ = phylum, cioè divisione
c__ = classe
o__ = ordine
f__ = famiglia
g__ = genere
Per esempio, per descrivere Escherichia coli, scriveremo:
p__Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Enterobacteriales;
f__Enterobacteriaceae;g__Escherichia
…oppure, per descrivere Bacillus licheniformis:
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Bacillales;f__Bacillaceae;g__Bacillus
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I BATTERI LATTICI
Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco
Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico)
prodotto finale del loro metabolismo energetico
Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di
tollerare l’ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno)
Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell’incapacità di
sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell’impossibilità di
produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la
decomposizione dell’H2O2 in H2O e O2
Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale
consente loro di crescere fino a quando il pH raggiunge valori inferiori a 5. Questa
caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la
competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro
specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti
naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive
liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in
alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati,
vino e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa
vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus).
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Alcuni generi di batteri lattici
Streptococcus
Oenococcus
Lactococcus
Enterococcus
Carnobacterium
Pediococcus
Lactobacillus
Leuconostoc
Immagini al SEM
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Lactobacillus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Pediococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Lactococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Streptococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Oenococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Leuconostoc
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__ Enterococcaceae;g__Enterococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Carnobacteriaceae;g__Carnobacterium
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I BATTERI LATTICI
Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici
1 – OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di
utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della
loro fermentazione
2 – ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via
glicolisi in quanto non possiedono l’enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO
ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio
attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto
equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO2. Possono utilizzare anche i
pentosi, nel qual caso senza produzione di CO2. Possono produrre anche piccole
quantità di acido acetico
3 – ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano
attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò
come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l’ossidazione di tali
composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO2
L’acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela
racemica DL
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Omofermentanti
Zuccheri
Zuccheri pentosi
esosi
X
Eterofermentanti
facoltativi
esosi
Esosi
Eterofermentanti
obbligati
Pentosi
in quantità ridotte
(
)
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TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI
Terreno MRS a pH 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei
lattobacilli
Terreno SL: selettivo per l’isolamento dei lattobacilli (tripticase,
estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, pH
finale 5,4)
Terreno ATB: adatto per l’isolamento di Oenococcus oeni (peptone,
estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, pH finale 4,8)
Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i
migliori risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di
isolamento in giare di anaerobiosi (Gas-Pak)
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I BATTERI ACETICI
Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae
p__Proteobacteria;c__Alphaproteobacteria;o__Rhodobacterales;f__Acetobacteraceae
Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi,
termolabili e psicrotrofi
Sono marcatamente acidofili (crescono fino a pH 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M)
Il pH ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a pH 3 se
l’etanolo è inferiore all’8%
Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti
Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 °C; alcuni
ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 °C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 °C)
Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l’etanolo e molti ceppi
crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da
pH, temperatura e concertazione di O2
I tre generi più noti:
Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum
Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens
Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii
Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis,
Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp.
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Le specie più importanti nella produzione industriale dell’aceto sono:
- Acetobacter aceti subsp. orleanensis
- Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell’aceto)
- Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis
- Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens
- Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus
In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di
vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali:
1. sono usati per la produzione dell’aceto (usati per convertire intenzionalmente l’etanolo del
vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico)
2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato
(entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita
attraverso la completa eliminazione dell’ossigeno durante la conservazione del vino oppure
con l’aggiunta di moderate quantità di SO2
3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre
aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per
la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale)
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Peculiarità metaboliche
I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione
aerobica)
In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con
ossidazione incompleta dei substrati organici
Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono
etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio
Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH4+
Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato
L’acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un
vero processo di fermentazione
Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad
acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO2,
tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il
COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo)
FONDAMENTALE!!! DA RICORDARE!!!
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I BATTERI ACETICI
Glucosio
tutto il NADH generato in queste reazioni
di ossidazione è destinato alla catena di
trasporto degli elettroni, per creare il
gradiente di H+ che permette la sintesi
dell’ATP
NAD+
ACIDO LATTICO
pentosi-P
interconversione non ossidativa
triosi-P
ultime tappe della glicolisi
NADH+H+
lattato deidrogenasi
NAD+
ETANOLO
via del pentosio fosfato
NADH+H+
alcol deidrogenasi
Ac. piruvico
decarbossilazione non ossidativa
CO2
Acetaldeide
NAD+
aldeide deidrogenasi
NADH+H+
acetil-CoA ligasi
acetil-CoA sintetasi
Ac. acetico
Gluconobacter
non ha un ciclo di Krebs
funzionale e non può
dunque ossidare l’acetato
Acetil-CoA
Ciclo dei
TCA
CO2
In Acetobacter
il ciclo di Krebs è
inibito solo a
concentrazioni
elevate di etanolo
CO2
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I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell’etanolo
Sono capaci di crescere utilizzando etanolo come unica fonte di carbonio ed
energia producendo acido acetico
L’etanolo, infatti, viene ossidato ad acetato, ed il potere riducente ottenuto si trasforma
in energia per la cellula (cioè in ATP) a livello della catena di trasporto degli elettroni
CH 3CH 2OH
pirrolochinolin-chinone, associato
all’aldeide deidrogenasi
biosintesi
NAD +, PQQ
catena respiratoria
NADH, PQQH 2
ATP
CH 3COOH
CH 3COSCoA
KREBS
acetil-CoA sintetasi
rilasciato extracellularmente
detta anche
acetil-CoA ligasi
X
Il blocco del ciclo di Krebs è causato da:
→ presenza di etanolo in Acetobacter
→ carenze genetiche in Gluconobacter
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I BATTERI ACETICI:
la metabolizzazione dell’etanolo
La produzione di acido acetico a partire da
etanolo da parte dei batteri acetici NON è
una fermentazione, ma il risultato di una
semplice ossidazione parziale dell’etanolo,
al fine di recuperare potere riducente
Solo i membri del genere
Acetobacter possono ossidare
completamente l’acetato a CO2,
se le concentrazioni di etanolo
non sono troppo alte
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Come distinguere Acetobacter da Gluconobacter in laboratorio
Si devono preparare piastre contenenti il seguente terreno di coltura agarizzato:
Estratto di lievito
50 g/l
CaCO3
20 g/l
rende il terreno di coltura opaco
Etanolo
7%
è la fonte di carbonio ed energia per il batterio
Agar
20 g/l
Dopo semina e incubazione a 28/30 °C per 2-3 giorni, parte dell’etanolo sarà convertito dai batteri
acetici in acido acetico, che abbasserà il pH solubilizzando il carbonato di calcio: le colonie
appariranno quindi con un alone di chiarificazione intorno a loro. Prolungando l’incubazione la
concentrazione di etanolo diminuirà fino a permettere agli Acetobacter di ossidare completamente
l’acido acetico prodotto (poiché il ciclo di Krebs è sbloccato).
Dopo altri 2-3 di incubazione, quindi, il
pH sarà risalito, con conseguente riprecipitazione del carbonato di calcio.
Dopo un totale di 5-6 giorni di
incubazione, quindi, le colonie di
Gluconobacter avranno un alone di
chiarificazione, mentre quelle di
Acetobacter no, poiché il carbonato di
calcio riprecipitando avrà reso di
nuovo opaco il terreno (sì vedrà un
alone opaco di precipitazione).
Acetobacter
Gluconobacter
colonia batterica
2-3 giorni di
incubazione
alone di chiarificazione
5-6 giorni di
incubazione
alone di precipitazione
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La fermentazione malolattica
(o meglio, conversione malolattica)
NON è una fermentazione nel senso
metabolicamente corretto del termine
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CENNI DI ANABOLISMO
L'anabolismo comprende tutto
l'insieme dei processi di sintesi
o bioformazione delle molecole
organiche (biomolecole) più
complesse da quelle più
semplici o dalle sostanze
nutritive.
Questi
processi
richiedono energia, al contrario
del catabolismo
Sebbene l'anabolismo e il
catabolismo siano due processi
contrari, funzionano in maniera
coordinata ed interdipendente
Le vie cataboliche forniscono
gli intermedi biochimici utili
all’anabolismo per operare la
biosintesi delle macromolecole
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I PRECURSORI BIOSINTETICI DEGLI AMMINOACIDI
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SINTESI DELLE STRUTTURE CELLULARI A PARTIRE DA GLUCOSIO
I precursori metabolici formati
dalla glicolisi, dal ciclo dei TCA
e dalle vie correlate entrano
nelle vie biosintetiche che
producono…
…i monomeri o i
mattoni di tutte le
componenti cellulari.
PROTOTROFIA
e
AUXOTROFIA
INCAPACITA’ DI SINTETIZZARE UN ...
amminoacido ... una base azotata ... etc...
Ulteriori reazioni
polimerizzano i monomeri
per formare
macromolecole…
…che interagiscono per
produrre le strutture che
costituiscono la cellula
batterica
CAPACITÀ DI SINTETIZZARE... un
amminoacido... una base azotata... etc…
FABBISOGNO COLTURALE,
NUTRIZIONALE
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LA BIOSINTESI DELLE BASI AZOTATE
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