immunofenotipizzazione linfocitaria in citometria a flusso

STRUTTURA COMPLESSA DI ANATOMIA, ISTOLOGIA PATOLOGICA E
CITODIAGNOSTICA
Direttore: Dr.Ezio PEZZICA
AZIENDA OSPEDALIERA TREVIGLIO
“14° Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio operanti
nei servizi di Anatomia Patologica”
Capaccio 20 Settembre 2007
IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE DEL TESSUTO
LINFOIDE IN CITOMETRIA A FLUSSO:
ASPETTI METODOLOGICI
Laura Fasolini, Elena Conti
Nives Monaci, Daniela Corti, Ezio Pezzica
STRUTTURA COMPLESSA DI ANATOMIA, ISTOLOGIA PATOLOGICA E CITODIAGNOSTICA
AZIENDA OSPEDALIERA TREVIGLIO
IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE
LINFOCITARIA
BIOPSIA LINFONODALE
TONSILLA
MILZA
BIOPSIA CUTANEA
BIOPSIA DEL TRATTO GASTROENTERICO
IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE
LINFOCITARIA
IL TESSUTO DEVE PERVENIRE:
- nel più breve tempo possibile
- senza fissativi
- a temperatura ambiente
Linfocita
DAL PATOLOGO AL TECNICO
IL PATOLOGO VISTO:
- Il sospetto e/o quesito diagnostico,
esame macroscopico e citologico.
- Scelto il pannello anticorpale che riterrà più
opportuno per la tipizzazione del campione.
- Compilato il modulo per la richiesta
di esame citofluorimetrico
Consegna campione e modulo al tecnico.
1
Antigeni
Proteine di
membrana
2
anticorpo
IL TECNICO DEVE SAPERE
PREPARARE UN CAMPIONE PER
L’ANALISI CITOFLUORIMETRICA
3
Fluorescenza
verde FITC
1) PREPARARE SOSPENSIONE CELLULARE
(linfociti)
4
Fluorescenza
rossa RPE
5
linfocita
2) INCUBARE CON SONDE FLUORESCENTI
(anticorpi marcati con fluorocromi)
DIRETTE VERSO MOLECOLE DI MEMBRANA
(antigeni)
IL TECNICO DEVE
SAPERE DOVE E
COSA CERCARE:
Gli Ab rivolti verso antigeni
espressi sulla membrana o
all’interno di cellule sono
usati per identificare,
distinguere differenti
popolazioni di linfociti
LINFOCITA
PRIMO OBIETTIVO DEL TECNICO:
OTTENERE UNA SOSPENSIONE:
- MONODISPERSA
- DI CELLULE VITALI
- NUMERICAMENTE SUFFICIENTI
disgregazione
3
2
1
filtrazione
conta
cellulare
vitalità
cellulare
4
marcatura
5
DISGREGAZIONE MECCANICA
Grattare delicatamente con il
bisturi il tessuto immerso in
PBS
se il tessuto appare coeso
aiutarsi nella disgregazione
con la Medimachine
poco a poco le cellule di
disgregano
DISGREGAZIONE ENZIMATICA
PER BIOPSIE CUTANEE E DEL TRATTO
GASTROENTERICO
Dopo la disgregazione meccanica si procede al
trattamento enzimatico con
COLLAGENASI IV
a 37 °C
Biopsie tratto gastroenterico per 10-20 min.
Biopsie cutanee per un tempo variabile fino a 4 ore
FILTRAZIONE
FACOLTATIVA, CONSIGLIATA
SOPRATTUTTO PER LIQUIDI DI
LAVAGGIO BRONCOALVEOLARI
Aspirare la sospensione ottenuta, con una
pipetta e filtrare con filtro da 50-70µm di Ø
in una provetta
Durante la disgregazione meccanica e’
importante che il tessuto sia mantenuto
umido con la stessa soluzione con la quale
e’ pervenuto, oppure provvedere subito a
tenerlo in PBS, durante la manovra di
disgregazione
NON DEVE ASSOLUTAMENTE
SECCARE!
VITALITA’ E CONCENTRAZIONE CELLULARE
LA VITALITA’ CELLULARE
DEVE ESSERE MAGGIORE
DEL 90%
(colorazione vitale con
Trypan blu 1%)
LA CONCENTRAZIONE
OTTIMALE UGUALE A 5 * 106/ml
compresa tra 1*106 e 10*106/ml
(contaglobuli o camera di Burker)
ISOLAMENTO DELLE CELLULE DI INTERESSE
ATTENZIONE
Utile per eliminare una eccessiva quantità di detriti, che possono
“disturbare” l’identificazione della popolazione di interesse
MA
può determinare perdita selettiva di popolazioni:
cellule più fragili dei normali linfociti (linfomi a grandi cellule)
ISOLAMENTO DELLE CELLULE DI INTERESSE
CENTRIFUGAZIONE SU GRADIENTE DI DENSITA’
LAVAGGI
LISI DELLE EMAZIE
CENTRIFUGAZIONE SU GRADIENTE DI DENSITA’
(DENSITA’:1.078)
METODICA :

dispensare sul fondo di ogni provetta il Ficoll

stratificare con molta cautela sopra il Ficoll la sospensione cellulare

centrifugare per 20 minuti a 1000 rpm

Si osserva tra il Ficoll e la sospensione un anello biancastro, (linfociti)
viene prelevato con pipetta facendo attenzione a non aspirare il Ficoll

lavare con PBS

centrifugare 10 minuti a 1000 rpm

eliminare il surnatante, risospendere e titolare
CENTRIFUGAZIONE SU GRADIENTE DI DENSITA’
(DENSITA’:1.078)
CONSIGLI UTILI
SE POSSIBILE E’ MEGLIO EVITARE IL FICOLL
- Non andare oltre tale rapporto:
1ml…..Ficoll……….2ml campione
2ml…..Ficoll……….4ml campione
- Conservare il Ficoll al buio
- La sospensione cellulare non va diluita prima del Ficoll
(al contrario del sangue)
- La sedimentazione di cellule neoplastiche ematologiche può
essere diversa da quella dei normali linfociti
LAVAGGI
PBS (pH 7.2 –7.4)
Le condizioni del microambiente esercitano un notevole effetto sulla
emissione di fluorescenza.
Il pH diverso da 7,2 riduce in modo drammatico l’emissione della FITC
SOLUZIONE MADRE
•KCL
2gr.
•KH2PO4 2gr.
•Na2HPO4*12H2O 11.5 gr.
•NaCl 80gr.
Portare ad 1 l con H2O distillata, misurare il pH.
(conservare in frigorifero)
SOLUZIONE DI LAVORO

Soluzione madre PBS
diluita 1:10 con H2O dist.

NaN3 (sodio azide) 0.1%
evita il passaggio dei recettori
all’interno della cellula
protegge le membrane

ABS (albumina bovina) 0.1%
satura i recettori che potrebbero
creare legami aspecifici con gli
anticorpi
LISI DELLE EMAZIE

Meglio lisare dopo l’aggiunta dell’antisiero

Non usare lisanti che contengono fissativi
(paraformaldeide), alterano la vitalità cellulare e/o i
siti antigenici meglio NH4Cl
ISOLAMENTO DELLE CELLULE DI INTERESSE
LISI DELLE EMAZIE
SOLUZIONE LISANTE
NH4Cl……………………………..8.29 g
KHCO3……………………………...…1 g
EDTA (tetrasodico)…………..0.037g
1) Portare a 1 l con H2O distillata
2) pH 7.2 - 7.4
3) Scadenza della soluzione: 6 giorni
4) Conservare a 4°C
LISI DELLE EMAZIE
METODICA
TERMINATA LA TITOLAZIONE:
- aggiungere a ciascun campione 2.5 - 3 ml di soluzione lisante,
miscelando con cura
- tenere a 4°C e al buio per 10 - 12 minuti (rigorosamente)
- centrifugare a 1200 rpm per 10 minuti
- eliminare il surnatante
- lavare con PBS freddo
- centrifugare e risospendere
- acquisire entro 30 minuti
PRIMA DI PROCEDERE ALLA MARCATURA:
SIAMO SICURI DI AVERE OTTENUTO UNA SOSPENSIONE
- MONODISPERSA
- DI CELLULE VITALI
- NUMERICAMENTE SUFFICIENTI
NO
SI
SECONDO OBIETTIVO DEL TECNICO:
ESEGUIRE UNA BUONA MARCATURA





Rispettare i tempi di incubazione
Operare alle temperature corrette
Lavorare in eccesso di anticorpo
Proteggere il campione dalla luce
Controllare il pH, ed i mezzi usati
MARCATURA

Miscelare bene la sospensione e l’antisiero

Incubare a 4°C al buio per 30 minuti
(oppure 15 minuti sempre al buio a T ambiente)

Lavare con PBS (per eliminare la fluorescenza non legata)

Centrifugare 10 minuti a 1200 rpm.

Risospendere in PBS acquisire
MARCATURA
1° STEP: RICERCA DI ANTIGENI DI SUPERFICIE
Colorare prima gli antigeni superficiali con fluorocromi non alterabili
dai successivi reagenti
MARCATURA
2° STEP: RICERCA DI ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI



Necessità di fissare e permeabilizzare la membrana
Necessità di non alterare la struttura della membrana e dei suoi
antigeni
Usare fluorocromi di piccole dimensioni (es.FITC) che superano
facilmente la membrana citoplasmatica
ATTENZIONE ALLE CATENE LEGGERE :
METODICA:
dispensare campione in provette:
a) controllo negativo (senza marcatura)
b) KAPPA-CD19
c) LAMBDA-CD19
d) KAPPA-LAMBDA
 aggiungere blocking, (Rabbit immunoglobulin)
(per saturare i siti aspecifici) tappare bene le provette

NB: solo per le catene se necessario lisare prima della marcatura
1- incubare per 30 minuti a 37°C bagnomaria
2- aggiungere i rispettivi antisieri ai campioni
3- incubare per 30 minuti a 37°C bagnomaria tutti i campioni
4- aggiungere PBS per lavaggio
5- centrifugare 10 minuti a 1200 rpm
6- buttare il surnatante, risospendere e acquisire
IL TECNICO COMPLETA IL MODULO
Il tecnico deve rendere conto
del “destino” del campione che
gli
è
stato
consegnato,
specificando la qualità e il
trattamento del campione
SCOPO: poter rintracciare nel
tempo il percorso del
trattamento e della qualità del
campione, giustificando ogni
procedura
PROBLEMI









FLUOROCROMI
ANTICORPI
RAPPORTO ANTIGENE- ANTICORPO
VITALITA’ CELLULARE
CONCENTRAZIONE CELLULARE
PERDITA DI CELLULE
ALTA QUANTITA’ DI DETRITI
COLORAZIONE ASPECIFICA
ADDESTRAMENTO DELL’OPERATORE
FLUOROCROMI
457 488 514
350
300 nm
400 nm
500 nm
Common Laser Lines
610 632
600 nm
700 nm
PE-TR Conj.
Texas Red
PI
Ethidium
PE (550-595)
FITC (500-537)
cis-Parinaric acid
FLUOROCROMI
SCELTA:
Utilizzare anticorpi coniugati con fluorocromi eccitabili
con il laser in uso (esempio: laser ad argon emette
nel blu 488nm)
Scegliere i fluorocromi in base
alle caratteristiche di assorbimento
e di emissione
Vengono generalmente usati fluorocromi eccitabili nel
blu in grado di emettere nello spettro:
A) del verde (fluoresceina, FITC)
B) dell’arancio (ficoeritrina, PE)
FLUOROCROMI
SCELTA DEL FLUOROCROMO IN FUNZIONE:
A) della densità di espressione degli antigeni
es: CD19= bassa espressivita’, meglio usare
fluorocromi alta efficienza quantica (es.PE)
CD45= alta espressivita’, meglio usare un
fluorocromo piu’ debole (es.FITC)
B) ridurre fenomeni di impedimento sterico tra Ab
(IgM ingombrante) e fluorocromi (voluminosa molecola PE)
ANTICORPI
CONSERVAZIONE:
Controllare: scadenze e
cambiamento lotti
Evitare l’esposizione alla luce
Mantenere a temperature comprese
tra +2-+4 °C
ANTICORPI
SCELTA:
A) meglio Ab monoclonali che policlonali
I monoclonali sono caratterizzati da:
alta affinità forza del legame Ag e Ab
alta specificità capacità di un anticorpo di
riconoscere selettivamente il proprio Ag
B) il pannello di anticorpi utilizzato deve permettere la
identificazione sia di cellule normali che patologiche
C) preferibili quelli già marcati
RAPPORTI QUANTITATIVI OTTIMALI FRA ANTIGENE E
ANTICORPO
LA CONCENTRAZIONE OTTIMALE DELL’ANTICORPO DEVE:

Permettere la discriminazione dei negativi dai positivi (alto
indice di risoluzione), cioè l’anticorpo non deve legare in modo
aspecifico cellule negative.

Permettere la saturazione dei siti antigenici, cioè quando
l’aggiunta di più Ab non aumenta l’antigene legato

Non determinare alterazione dei parametri fisici
aggregazione (per ovviare a questo fenomeno
si raccomanda l’uso di mAb a saturazione)
COMPLESSI ANTIGENE-ANTICORPO
LE DIMENSIONI DEI COMPLESSI IMMUNI DIPENDONO DALLA
CONCENTRAZIONE RELATIVA DELL’ANTIGENE E DELL’ANTICORPO
I complessi
sono di
dimensioni minori in eccesso
di anticorpo o di antigene
Complessi di grosse dimensioni
si formano di più nella zona di
equivalenza
VITALITA’ CELLULARE

CONDIZIONE IDEALE:(sotto controllo:trasporto,conservazione,temperature)
30% VERE POSITIVE
VIVE 100%
70% VERE NEGATIVE

L’anticorpo si
lega solo ai veri
positivi
CONDIZIONE PERICOLOSA:
VIVE 60%
MORTE 40%
POSITIVE ?
NEGATIVE ?
Le cellule morte
legano in modo
aspecifico
qualsiasi anticorpo
CONCENTRAZIONE CELLULARE ERRATA
CONCENTRAZIONE CELLULARE ELEVATA,
LAVORO IN CARENZA DI ANTICORPO
Conseguenza: diminuzione della percentuale delle
cellule fluorescenti. (si legano poche molecole di
Ab su ogni cellula, e quindi queste risultano poco
fluorescenti). Positivi su un canale più basso
CONCENTRAZIONE CELLULARE BASSA
LAVORO IN ECCESSO DI ANTICORPO
Conseguenza: rischio di legami aspecifici
( potrei avere cellule positive che in realtà non lo sono)
PERDITA DI CELLULE

Eccessivi lavaggi

Lavaggi a T ambiente (meglio a 4°C)

Mancanza di proteine nel tampone di lavaggio

Utilizzo di provette o tubi in plastica

Eventuale trattamento di lisi delle emazie
PRESENZA DI DETRITI

Incompleta lisi

Necrosi

Pazienti trattati con chemioterapici
COLORAZIONE ASPECIFICA

presenza di cellule morte che legano in modo
aspecifico l’anticorpo

l’esposizione prolungata a sorgenti di luce di
eccitazione, la molecola di fluorocromo si altera
irreversibilmente e perde potere di emissione

uso di tamponi per i lavaggi a pH non controllato
ADDESTRAMENTO DELL’OPERATORE
IL PERSONALE CHE ESEGUE ATTIVITA’ CHE INFLUENZANO
LA QUALITA’ DEL PRODOTTO DEVE ESSERE COMPETENTE
SULLA BASE DI UN ADEGUATO:
• GRADO DI ISTRUZIONE
• ADDESTRAMENTO
• ABILITA’
• ESPERIENZA
ADDESTRAMENTO DELL’OPERATORE
Capacità di interpretazione grafica di base
ADDESTRAMENTO DELL’OPERATORE
Consapevolezza di
cosa stiamo cercando
Grazie all’impiego di anticorpi
monoclonali è possibile
identificare una ampia serie di
molecole di superficie delle
cellule linfatiche, che
permette di studiare le varie
popolazioni e
sottopopolazioni linfocitarie.
MOLECOLE DI SUPERFICIE
SOTTOPOPOLAZIONE DEI LINFOCITI
DISTRIBUZIONE DELLE POPOLAZIONI
LINFOCITARIE NEL LINFONODO NORMALE
Linf.T
%
Linf.
B
Linf.NK
CD2
65±12
CD19
28±10
CD3
65±12
CD20
29±10
CD5
64±10
CD10
0
CD4
48±10
CD22
17±9
CD8
16±5
CD24
%
CD56
%
2 ±1
Bryan:Ann.N.Y.Acad.Sci.1993
…ora il campione è pronto per l’analisi!
GRAZIE A TUTTI!!!