Il controllo della fertilizzazione e la qualita
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LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Il controllo della fertilizzazione e la qualità embrionaria AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE FECONDAZIONE processo che porta alla fusione del patrimonio genetico materno e di quello paterno con la formazione di un nuovo individuo AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE La normale fecondazione avviene secondo una serie di eventi che si svolgono in tempi differenti per ogni ovocita. Payne et al., 1997 AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Eventi nel processo di fecondazione:: fecondazione aumento intracellulare del calcio esocitosi dei granuli corticali modificazione della ZP e blocco alla polispermia AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Fattori coinvolgenti l’esito delle tecniche di fecondazione assistita Stimolazione ovarica Manipolazione Infertilità Condizioni di coltura Transfer Classificazione AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE L’osservazione viene eseguita all’invertoscopio dopo 16-18 ore dall’inseminazione CRITERI PRATICI Si valuta sia la presenza dei 2PN ravvicinati al centro dell’ovocita con la configurazione dei nucleoli in num. ridotto e la presenza dei 2 PB; Per la FIVET si esegue prima la rimozione meccanica del cumulo ooforo e della corona radiata; Per l’ICSI: osservazione diretta AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Valutazione nella coltura in vitro AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Valutazione della qualità dello zigote Tesarik & Greco,1999 Scott & al, 2000 Timing: 16 - 18 ore postpostinseminazione Parametri: - disposizione PN e nucleoli - aspetto citoplasma “Halo - timing breakdown membrana dei PN (24(24-26 h) NUCLEOLI Timing:: 12 - 20 ore postTiming postinseminazione Parametri:: Parametri - numero di nucleoli - disposizione dei nucleoli L’ asincronia nella formazione e nella polarizzazione può severamente compromettere lo sviluppo dell’ embrione e il suo impianto impianto.. Van Blerkom , 1990; Tesarik and Greco, 1999; Scottet al., 2000 AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Tesarik e Greco, 1999 AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE P r o S 2 PN n 0 PN t u a c d l i 3 PN e > PN o a r e AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE FERTILIZZAZIONE ANOMALA Presenza di un pronucleo (1pn): Rappresenta circa l’1% degli ovociti fertilizzati in vitro; Può risultare da un’attivazione partenogenetica dell’ovocita Può risultare da un’asincronia nella formazione dei pronuclei; Può risultare da una singamia precoce AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE FERTILIZZAZIONE ANOMALA Presenza di tre pronuclei: Rappresenta circa il 5% degli ovociti fertilizzati in vitro; Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita con uno spermatozoo diploide; Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita con due spermatozoi. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE FERTILIZZAZIONE ANOMALA Arresto del clivaggio allo stato di zigote dovuto ad un fallimento nell’attivazione ovocitaria; dovuto a difetti nella struttura ovocitaria; dovuto a incorretta localizzazione del centrosoma spermatico. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Pattern 1 Pattern 2 AM 2004 Pattern 3 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE SVILUPPO EMBRIONALE L’embrione si sviluppa per una continua successione di: Divisione citoplasmatica Divisione cellulare Il primo clivaggio è l’unica divisione sincrona che porta alla formazione di due blastomeri uguali che contengono la stessa allocazione dei due poli animale e vegetale dell’ovocita. Nel caso in cui essa si verifichi a 24 – 27h dall’inseminazione, si parla di Early Cleavage AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE SVILUPPO EMBRIONALE Il secondo clivaggio è invece asincrono e associato ad una rotazione che porta alla formazione di un embrione a 4 cellule. Tutti i successivi clivaggi sono asincroni e avvengono sempre nello spazio delimitato dalla zona pellucida AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Il criterio di valutazione della qualità embrionale è principalmente morfologico: N° e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE L’embrione viene sempre osservato all’invertoscopio e si esegue una classificazione Un ineguale clivaggio cellulare è un indicatore della qualità embrionaria e della sua capacità di sviluppo sviluppo.. Conseguenze: Ineguale distribuzione di mRNA, mitocondri e organelli citoplasmatici tra le due cellule gemelle.. gemelle Un embrione è considerato di buona qualità quando presenta 4 cellule in II II°° giornata (3636-50 h dall’insemin..) e 6-8 cellule in III dall’insemin III°° giornata (72 h dall’insem dall’insem..) AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE GRADO I Cellule di uguale grandezza Assenza di frammenti AM 2004 Ben espanse nello spazio perivitellino LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE GRADO I 10…20% frammenti AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE GRADO II • Cellule di grandezza simile ma con una differenza non superiore al 20% tra l’una e l’altra • 20 – 50% di frammentazione AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE GRADO III • Cellule con una differenza nelle dimensioni dei blastomeri superiore al 20% tra l’uno e l’altro • > 50% di frammentazione • Basso numero di cellule rispetto a quelle attese AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Il criterio principale di selezione embrionale si basa su valutazioni morfologiche: N° e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Classificazione Descrizione Tipo I Frammentazione minima Tipo II Frammenti localizzati perifericamente allo PVS Tipo III Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o in tutto il PVS Tipo IV Grandi frammenti,blastomeri di differente misura Molti preembrioni contengono frammenti cellulari nello pvs per le continue modificazioni di forma e rottura dei blastomeri durante la loro divisione. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Il criterio principale di selezione embrionale si basa su valutazioni morfologiche: N° e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Presenza di due o più nuclei nei blastomeri Presenti in circa il 30% di embrioni Multinucleazioni Assenza di citochine Cause Parziale frammentazione di nuclei Difetti nella migrazione dei cromosomi “… Since mulinucleation in early embryos may reflect gross chromosomal abnormalities or development of mosaic embryos, it is advisable not to replace embryos with MNB. MNB. Occasional transfers, however can be considered because defective embryos may sometimes develop normally. normally.” Balakier et al., Hum. Rep., 1997 AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE P I T T I N G Desai et al, 2000 AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE ASPETTO DEL CITOPLASMA La presenza di granulosità nel citoplasma pare non sia correlato con la morfologia dell’embrione e quindi che non abbia impatto sulla percentuale di impianto (Rienzi et al. 2003). AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Dal giorno +3... FASI DELLO SVILUPPO AM 2004 ..Alla blastocisti LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Giorno +4 : COMPATTAZIONE I singoli blastomeri non sono distinguibili Le cellule della morula compattata iniziano a polarizzarsi. Si vede l’inizio della cavitazione AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Giorno +5 : CAVITAZIONE ED ESPANSIONE Inizia la formazione del blastocele. L’embrione aumenta di volume e la ZP si assottiglia. TE e ICM divengono identificabili. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Giorno +6 : ESPANSIONE Il volume del blastocele aumenta. La ZP si assottiglia. L’embrione accresce il suo volume. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Giorno +6 / +7 : HATCHING L’embrione continua ad aumentare di volume. Si crea una breccia nella ZP e inizia a fuoriuscire una porzione di TE. L’embrione “sguscia” completamente dalla ZP e si rigonfia. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE Prolungare la coltura in vitro fino al giorno +5 e trasferire gli embrioni a blastocisti non è una strategia che può migliorare i risultati di un programma di PMA. AM 2004 LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE AM 2004
