Le malattie dermatologiche trasmesse geneticamente sono un

CENTRO INTERUNIVERSITARIO DI DERMATOLOGIA
BIOLOGICA E PSICOSOMATICA
(Dir. Prof. Torello Lotti)
PROGETTO DI RICERCA PER STUDI DI GENETICA DELLE MALATTIE
DERMATOLOGICHE E FARMACOGENETICA PER LA VALUTAZIONE
DELL’APPROPRIATEZZA DEI FARMACI BIOLOGICI NELLA CURA DELLE
MALATTIE DERMATOLOGICHE
Premesse
Le malattie dermatologiche trasmesse geneticamente sono un gruppo di più di duecento
disordini, clinicamente ed eziologicamente differenti, che si presentano con vari gradi di
coinvolgimento di aree cutanee e degli annessi. Lo spettro di gravità delle manifestazioni si estende
da sintomi cutanei localizzati con impatto esclusivamente estetico a forme severe, generalizzate,
multisistemiche e con diverso grado di morbilità e mortalità. Molte forme di dermatosi
geneticamente predeterminate sono diagnosticabili con difficoltà dal dermatologo clinico che si
trova di fronte a forme rare seppur gravi. Una diagnosi iniziale errata comporta il cambiamento
della strategia terapeutica in corso di trattamento, con ovvie conseguenze negative per il paziente.
Gli entusiasmanti recenti progressi della genetica molecolare accompagnati dai progressi in
campo informatico hanno cambiato il modo di fare diagnosi. Il chiarimento infatti dei meccanismi
molecolari di più del 60% delle dermatosi su base genetica ottenuto con studi di linkage, mirati ad
individuare geni difettosi localizzati in specifici loci cromosomici, o con studi di clonaggi
posizionali e di analisi di sequenze di geni o di regioni di DNA opportunamente individuate, ha reso
molto più semplice ed affidabile la diagnosi. La ricerca dermatogenetica ha scoperto più di 170
diversi geni che possono presentare mutazioni legate a malattie dermatologiche. Queste importanti
informazioni hanno permesso di sviluppare test diagnostici biochimici o molecolari che permettono
di porre una diagnosi sicura per un ampio numero di dermatosi su basi molecolari note. La
possibilità di identificare specifiche mutazioni portatrici di malattia nei singoli pazienti e
successivamente nelle famiglie portatrici permette inoltre, di stabilire il meccanismo di trasmissione
della malattia e di fare dunque previsioni di ricorrenza di malattia nella progenie, e permette inoltre,
di effettuare diagnosi prenatale. Questa traslazione delle conoscenze di base nella pratica clinica ha
un enorme impatto nella cura del paziente ed in modo particolare in quelle forme morbose in cui un
trattamento adeguato e tempestivo può modificare la speranza di vita del paziente. La FDA nel
corso del 2006 ha fornito varie linee guida per la messa a punto e la successiva validazione di
biomarkers.
Nuove frontiere della genetica moderna in campo dermatologico sono rappresentate dalla
farmacogenetica e dalla farmacogenomica soprattutto in considerazione dell’uso dei nuovi farmaci
biologici, che in campo dermatologico trovano raccomandazioni d’uso. L’EMEA raccomanda l’uso
dei biologici nelle forme di psoriasi grave e nella artrite psoriasica.
PSORIASI
La psoriasi è la malattia dermatologica più comune ed ormai è chiaramente indicata come
una malattia immunologica su base genetica e con fattori scatenanti ancora parzialmente ignoti e
rappresentati soprattutto da infezioni microbiche, disordini endocrini, ipocalcemia, farmaci, stress
psicologici e traumi locali. La psoriasi affligge 25 di milioni di persone in Europa e nel Nord
America ed in alcune popolazioni la prevalenza della malattia raggiunge il 5% degli individui. E’
legata a fattori genetici ed ambientali come dimostrato dalla diversa incidenza tra le varie
popolazioni, colpisce in egual misura entrambe i sessi e compare prevalentemente in età giovanile.
Alcuni autori descrivono due picchi di incidenza in relazione all’età, che potrebbero contribuire a
distinguere la malattia in due tipi differenti come succede nel caso del diabete: uno con esordio tra i
20 e i 30 anni (tipo I) associata a modificazioni HLA e caratterizzata da una storia familiare di casi
con quadri severi, e un secondo picco (tipo II) con insorgenza tra i 50 ai 60 anni HLA negativa e
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con manifestazioni più leggere. La psoriasi rientra nella definizione generale di malattia
autoimmune organo specifica ossia “sindrome clinica causata da attivazione dei linfociti T e B in
assenza di una causa infettiva o di altro tipo in atto”. Rientrano in questa definizione altre sindromi
che possono manifestarsi in forme altrettanto severe e gravi e che coinvolgono in maniera specifica
organi e tessuti target specifici come il morbo di Chron, l’artrite reumatoide, la sclerosi multipla ed
il diabete giovanile (4).
Istologicamente la psoriasi è caratterizzata da un ispessimento marcato dell’epidermide
dovuto ad una accelerazione del ritmo proliferativo dei cheratinociti interfollicolari, da
un’alterazione della differenziazione degli stessi che si manifesta con uno strato granuloso di
spessore molto ridotto, con alterazione della funzione barriera e formazione di uno strato corneo
paracheratosico. L’epitelio oltre ad essere ispessito presenta rapporti molto più estesi, come
dimostrato dall’aumento dell’estensione delle interdigitazioni, con lo strato connettivo dermico da
cui trae i fattori necessari per mantenere l’iperattività. Sono evidenti a livello epiteliale infiltrati
leucocitari, mentre a livello dermico oltre ad infiltrati leucocitari molto evidenti, si notano un
aumento della vascolarizzazione ed un’iperplasia dei vasi che contribuiscono a conferire il tipico
arrossamento alle lesioni. Numerosi linfociti, monociti e neutrofili aderiscono alle pareti endoteliali,
che come dimostrato dall’immunostainig presentano aumentata espressione di molecole di adesione
come I-CAM, E-CAM ed E-Selectina necessarie per la trasmigrazione cellulare (5). Tuttavia a
livello dermico sono presenti linfociti e leucociti residenti in grado essi stessi di proliferare e di
creare la popolazione capace di mantenere lo stato infiammatorio. E’ stato dimostrato infatti in
modelli di topi immunodeficicienti, che il trapianto di pelle sana proveniente da soggetti psoriasici
era capace di sviluppare malattia con segni istologici di aumento della popolazione di cellule
dendritiche e di linfociti T (6).
Le lesioni psoriasiche sono determinate dall’interazione e dalla reciproca attivazione tra
leucociti mononucleati e cheratinociti, che rappresentano tutt’altro che una popolazione cellulare
spettatrice passiva dell’attacco immunitario, ma essi stessi secernono fattori autocrini e paracrini
capaci di mantenere ed amplificare la reazione infiammatoria e proliferativa. Le cellule
dell’immunità innata presenti nelle lesioni psoriasiche sono principalmente neutrofili, cellule
dendritiche plasmacitoidi (CD) e cellule dendritiche mieloidi CD11c+(CD11c+ DC). I neutrofili
avendo ciclo vitale breve devono essere continuamente reclutati dal torrente circolatorio, attraverso
fattori chemiotattici prodotti dai cheratinociti e rappresentati principalmente da IL8, Growth
regulated oncogene-α GRO-α e probabilmente le proteine S100A7/A8/A9 (5). Le CD plasmacitoidi
che in seguito all’attivazione producono elavati livelli di Interferon–α sono state indicate come
principali responsabile delle lesioni (7). Le cellule dendritiche mieloidi (CD11c+ DC) sono presenti
in abbondanza nelle lesioni psoriasiche ed esprimono elevati livelli di Tumor Necrosis Factor-α
(TNF-α), dell’enzima ossido nitrico sintetasi inducibile (iNOS) e sono inoltre responsabili della
secrezione di citochine come IL-23 ed IL-20 che hanno la capacità di attivare rispettivamente i
linfociti T ed i cheratinociti (8, 9). Inoltre una frazione di CD11c+ DC esprime molecole coattivatrici
del tipo CD83 e può funzionare con il suo ruolo convenzionale di Antigen Presentino Cells (APC)
determinando attivazione linfocitaria e dunque innescando la risposta immunitaria acquisita come
dimostrato dalla presenza di aggregati tra cellule T e DC a livello dermico e dalla compresenza di
chemochine come CCL19, CCL21, CXCL12, CCL18 che possono favorire l’attivazione
linfocitaria. I linfociti T nelle lesioni psoriasiche sono principalmente polarizzati in senso T Helper1
(TH1) e T citotossici (Tc1;CD8+), ma evidenze recenti indicano la presenza di una popolazione
TH17 indotta probabilmente dalla IL23. Alcune popolazioni linfocitarie sono specializzate per
l’homing epidermico attraverso l’espressione di molecole integriniche che legano specificamente le
E.caderine cheratinocitarie.
I cheratinociti possono secernere molecole capaci di attivare gli immunociti, mentre questi
ultimi possono paracrinamente rispondere determinando la produzione di molecole di adesione
cheratinocitarie capaci di reclutare un maggior numerosi immunociti. Alcuni autori pensano, infatti,
che un ruolo patogenetico nella psoriasi sia rappresentato da un difetto delle cellule T regolatorie.
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La natura infiammatoria della psoriasi è stata confermata dal successo terapeutico dei
farmaci biologici capaci di bloccare selettivamente e specificamente molecole attivatrici di attori
cellulari responsabili di attivazione del sistema immunitario, confutando in pieno la vecchia ipotesi
che la patogenesi fosse determinata da un semplice disordine iperproliferativo dei cheratinociti. La
ulteriore definizione dei meccanismi fisiopatologici contribuiranno sicuramente in futuro ad
ottenere farmaci sempre più potenti, efficaci e selettivi.
I FARMACI BIOLOGICI
I farmaci denominati biologici o meglio biotecnologici derivano dallo sforzo compiuto dalla
comunità scientifica internazionale nella definizione dei meccanismi patogenetici delle malattie e
dai recenti progressi delle biotecnologie sia a livello di ricerca che di produzione industriale.
La scelta del trattamento farmacologico per la cura della psoriasi dipende da molti fattori come
l’estenzione delle lesioni, l’effetto che esse hanno sulla qualità di vita del paziente e la percezione
che esso ha della sua malattia. Negli ultimi tre anni è stato approvato da parte delle autorità
competenti della FDA e dell’EMEA l’uso di farmaci biologici per la cura dei quadri severi.
I farmaci biologici approvati sono Alefacept (Amevive, approvato solo dalla FDA)
Efalizumab (Rapiva, approvato da FDA ed EMEA), Infliximab (Remicade, approvato da FDA ed
EMEA), Eternecept (Enbrel, approvato da FDA ed EMEA). Gli agenti biologici sono proteine o
anticorpi destinati a bloccare specifiche molecole essenziali nel processo patogenetico della
malattia. In particolare si possono distinguere in due gruppi: i bloccanti del TNF-α e i bloccanti di
molecole responsabili dell’attivazione dei linfociti T.
Alefacept è una proteina di fusione che contiene il dominio extracellulare della proteina
CD58 (Leucocyte Antigen Function-3, LFA-3) capace di legare la molecola co-stimolatoria CD-2 e
la frazione costante degli anticorpi umani IgG1. Le principale cellule che esprimono CD-2 sono i
linfociti T e le cellule natural killer (NK) e una piccola porzione di cellule dendritiche circolanti
CD14+. Alefacept legando CD2 e la frazione costante (fc) delle IgG forma un ponte tra i linfociti T
e le cellule NK inducendo apoptosi dei linfociti T (10). Questo meccanismo potrebbe spiegare la
riduzione dei linfociti T associata al trattamento con Alefacept e la successiva riduzione della
trascrizione di geni coinvolti nell’attivazione di meccanismi infiammatori come INF-γ, STAT-1,
MIG(CXCL9), iNOS, IL-8, IL-23, IL-20 (9,11).
Efalizumab, è un esempio di un agente disegnato per interferire con il meccanismo di
interazione tra molecole co-stimolatorie e proteine di adesione che partecipano all’attivazione dei
linfociti T. Si tratta di un anticorpo monoclonale murino umanizzato capace di legare CD11a,
subunità proteica che forma un eterodimero con la ß2-integrina CD18, per formare LFA-1
(Leucocytes Activating Factor-1). La molecola CD11a/CD18 espressa selettivamente dai linfociti T
si lega ad ICAM-1 e 2. Dalla formazione del complesso LFA-1/I-CAM deriva l’interazione tra i
linfociti T e le cellule dendritiche ICAM+ con attivazione della presentazione antigenica nei
linfonodi, a livello locale nel derma e trasmigrazione dei linfociti T dal derma all’epidermide.
Efalizumab determina inoltre leucocitosi periferica dovuta prevalentemente ad apoptosi delle cellule
T CD8+ memoria determinata probabilmente dalla mancanza dell’interazione LFA-1/ICAM-1 tra
linfociti e cellule endoteliali. (12).
Gli inibitori del TNF-α hanno ampliato enormemente le opportunità terapeutiche per i
pazienti con psoriasi grave. I farmaci attualmente approvati dalla FDA e dall’EMEA sono
infliximab ed etanercept, mentre adalimumab è attualmente in fase III avanzata di sperimentazione
e in fase di revisione. Etarnecept è una proteina di fusione costituita dalla porzione extracellulare
dei due recettori umani per il TNFα e la Fc delle immunoglobuline IgG1. E’ dunque capace di
inattivare mediante legame selettivo il TNFα e la linfotossina inibendo la loro attività biologica.
Infliximab è un anticorpo monoclonale chimerico umano-murino capace di legare TNFα libero o
legato al suo recettore e media inoltre la lisi delle cellule che producono TNFα. Adalizumab è il
primo anticorpo anti-TNFα completamente umano e teoricamente dovrebbe funzionare come
infliximab.
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I farmaci biologici rappresentano al momento un’opportunità terapeutica nuova e potente,
ma sicuramente non priva di rischi ed effetti collaterali. Come tutti i farmaci che vanno a bloccare
meccanismi coinvolti in processi biologici complessi e ubiquitari possono interferire con
meccanismi fisiologici primari. Lo studio degli effetti su ampie popolazioni ed il monitoraggio degli
effetti post-marketing risultano fondamentali, per un uso razionale e sicuro dei farmaci. L’uso
improprio di farmaci biologici può sottendere infatti effetti collaterali importanti. E’ stato
recentemente descritto il riacutizzarsi di foci tubercolari in soggetti con tubercolosi pregressa o
latente, il riacutizzarsi di infezioni da citomegalovirus e di agenti infettivi che determinano infezioni
varie come meningiti, polmoniti etc.. L’esito di infezioni in soggetti immunodepressi può a volte
risultare fatale. L’uso dei biologici è riportato in letteratura determinare la riacutizzazione di
malattie come Linfomi, Leucemie, Lupus Eritematoso Sistemico, Sclerosi Multipla, Epatite
autoimmune, Morbo di Crohn, etc., e causare forme di trombocitopenia, neutropenia, pancitopenia,
linfopenia, agranulocitosi. Un prevedibile futuro diffondersi di terapie biologiche, che trovano
indicazione oltre che nella psoriasi, anche in numerose forme morbose aggressive e debilitanti e di
enorme impatto sanitario e socio-economico, come malattie autoimmuni, forme tumorali di tipo
solido o delle cellule circolanti, malattie infiammatorie del tratto digerente etc. richiede un
monitoraggio stretto del loro impiego, degli effetti collaterali, dei rapporti rischi-benefici e costibenefici.
FARMACI BIOLOGICI E SPESA SANITARIA
I farmaci biologici sono classificati come terapie ad alto costo, che possono rappresentare
una spesa importante per il Sistema Sanitario Nazionale (SSN). La valutazione del rapporto costibenefici và tuttavia impostata considerando la gravità e la cronicità delle patologie in cui tali
farmaci sono impiegati. Una patologia cronica comporta infatti costi tangibibili per il sistema
sanitario rappresentati da risorse umane, quali personale medico, infermieristico, personale per il
supporto riabilitativo fisico e psicologico, risorse materiali, quali farmaci e materiali di medicazione
e costi intangibili rappresentati dal peggioramento della qualità della vita del soggetto malato e delle
famiglie e dal minor contributo dei soggetti alla vita sociale e lavorativa.
Il rapporto costi-benefici và valutato dunque in termini di risposta positiva al farmaco, tempi
di trattamento ed effetti collaterali.
Un impiego mirato e su una popolazione opportunamente selezionata rappresenta il “goal”
delle terapie con farmaci biologici. L’arruolamento di pazienti psoriasici geneticamente predisposti
a rispondere a terapie con farmaci biologici determinerebbe sicuramente un abbassamento ed una
giustificazione di costi sostenuti dal SSN ed un aumento dei successi terapeutici, che avrebbero un
risvolto positivo sul soggetto e sulla società. Inoltre trattamenti mirati permetterebbero di abbassare
gli effetti collaterali dei farmaci biologici, che viceversa un uso improprio contribuirebbe a
diffondere.
FARMACOGENOMICA E FARMACOGENETICA
Al momento non esistono parametri predittivi di attività ottimale dei Farmaci Biologici nei
singoli soggetti con malattie dermatologiche. Un uso appropriato prevede sicuramente la
valutazione della situazione clinica del soggetto, un’attenta anamnesi del soggetto riferendosi in
particolare ad infezioni recenti o pregresse e a malattie su base immunologia e la misurazione di
markers biochimici con caratteristiche predittive. Ricerche di base atte ad individuare tali markers
indicativi del trattamento migliore in termini di velocità di azione, di efficacia e di minimizzazione
degli effetti collaterali sarebbero sicuramente auspicabili. I progressi recenti della ricerca genetica e
biochimica stanno portando infatti allo sviluppo di numerosi test genetici sia per patologie
monogeniche o mendeliane che multifattoriali. La farmacogenetica intende fornire la metodologia
per effettuare test sul DNA dei singoli pazienti in maniera da individuare le basi genetiche della
diverse risposte ai farmaci. L’individuazione di test genetici che indirizzino il medico alla scelta del
Farmaco Biologico più adeguato per il singolo paziente fornirebbe sicuramente un guadagno sia in
risultati terapeutici che economici.
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Il comitato nazionale per la Bioetica nella seduta del 21 aprile 2006 ha approvato
all’unanimità un documento dal titolo “Dalla Farmacogenetica alla Farmacogenomica” in cui
vengono fatte valutazioni preliminari, vengono date le definizioni di farmacogenetica e
farmacogenomica e vengono auspicati nuovi studi in materia di proteomica al fine di porre in
relazioni sequenze geniche di singoli o più geni con i prodotti genici ad essi associati ossia le
proteine. Vengono valutate tutte le questioni bioetiche relative agli studi genetici della risposta
individuale ai farmaci, ma vengono auspicate, scendendo anche nei dettagli tecnici, ricerche che
pongano in relazione aspetti genetici e previsione di efficacia dei trattamenti. In particolare
affrontando il tema del trattamento con farmaci biotecnologici di specifici tumori viene messa in
evidenza l’alto grado di specializzazione dei ricercatori che dovranno lavorare in tal senso e
l’opportunità di sviluppo di nuovi farmaci mirati in tempi molto più rapidi rispetto allo sviluppo di
molecole attive di tipo tradizionale.
Inoltre viene indicato che attualmente la FDA ha emesso una Draft Guidance per i
ricercatori che intendano comunicare dati farmacogenetici ottenuti nel corso di sperimentazioni.
Questo regime volontaristico potrebbe cambiare rapidamente man mano che la ricerca prosegue e
secondo le previsioni di alcuni autori entro il 2014 tutte le nuove medicine saranno ottenute in base
a procedimenti che coinvolgono analisi farmacogenetiche. Queste stime vengono fornite basandosi
sulla rapidità dell’innovazione in campo biotecnologico, grazie alla bioinformatica, al prevedibile
abbassamento dei costi di realizzazione dei test molecolari, e alla spinta che potrebbe ricevere
questo settore dalla massa sempre maggiori di dati che dimostrandosi sempre più attendibili si
mostrano in grado di prevedere efficacia terapeutica e sicurezza di utilizzo dei farmaci riducendo o
evitando effetti collaterali.
PSO-CARE
La psoriasi è una malattia cronica con un ampio spettro di forme, che l’EMEA ha definito:
1. Psoriasi di grado lieve (PASI <10): lieve Psoriasi che interessa meno del 10% della superficie
corporea, ben controllata con la terapia locale che e che non influenza lo stato emozionale e le
relazioni sociali del paziente.
2. Psoriasi moderatamente grave (PASI 10-20) che coinvolge una superficie variabile dal 10 al
25% della superficie corporea o che interessa meno del 10% ma con effetti importanti sul
benessere psicologico e sociale del paziente (come per il coinvolgimento di viso e mani). Il
ricorso alla terapia locale è tuttavia possibile e non problematico.
3. Psoriasi di grado moderato-grave: Psoriasi che interessa più del 10% della superficie corporea
(PASI 10-20) con mancata risposta alla terapia locale. Oppure, psoriasi che interessa <10%
della superficie corporea ma con lesioni in aree “problematiche” (per esempio cuoio capelluto,
superfici palmo-plantari).
4. Psoriasi grave che coinvolge più del 25% della superficie corporea (con PASI superiore a 20 o
con BSA meno del 25% o PASI meno di 20) o meno del 25% ma con importanti effetti
psicologici e sociali e che non risponde alla terapia topica o, ancora, psoriasi che coinvolge
meno del 25% ma instabile e rapidamente progressiva. Psoriasi artropatica, psoriasi pustolosa
di Hallopeau. Psoriasi che coinvolge più del 20% della superficie corporea (PASI >20) o meno
del 20% ma con importanti manifestazioni locali.
5. Psoriasi grave a prognosi riservata. Psoriasi associata a sintomi sistemici. E’possibile “skin
failure”: psoriasi pustolosa generalizzata (von Zumbusch), psoriasi eritrodermica.
La gravità oggettiva della malattia misurata dal clinico, molte volte viene percepita in
maniera molto più grave dal paziente. La psoriasi è infatti una malattia con impatto psicologico
molto importante. I tassi di suicidi tra i pazienti psoriasici sono infatti significativamente più alti
rispetto a quelli nella popolazione normale. La necessità di terapie farmacologiche mirate, di
trattamenti protratti nel tempo, ma anche di continuità di prestazioni da parte di personale medico
ed infiermeristico esperto, dedicato e capace di instaurare un rapporto di fiducia rassicurando i
pazienti in maniera da rendere più sopportabile il carico psicologico determinato dalla malattia ha
fatto sorgere la necessità di centri denominati PSOCARE. Si tratta di centri altamente specializzati e
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in grado di fornire terapie mirate e di supportare la terapia farmacologica con indicazioni
comportamentali e psicologiche. Il paziente deve infatti essere educato ad uno stile di vita, che
minimizzi i fattori scatenanti della malattia che si presenta con ereditarietà multifattoriale e deve
essere supportato in maniera tale da consentirgli lo svolgimento delle normali attività lavorative e
sociali. La variabilità di risposta a placebo nell’ambito di vari studi clinici condotti sui trattamenti
farmacologici in corso di psoriasi anche di forma grave dimostra il possibile ruolo delle strategie
assistenziali nell’esito delle terapie stesse.
Le Aziende Sanitarie applicando le linee guida regionali circa l’obiettivo di miglioramento
della qualità di vita dei soggetti, in termini di prevenzione e di ottimizzazione delle cure al fine di
ottenere i risultati attesi con il minor dispendio economico, auspicano la nascita di centri di
eccellenza capaci di offrire cure innovative, mirate e dunque più efficaci. Nell’ottica di questa
visione nuova del Sistema Sanitario proiettato a creare Salute e a prendersi cura in maniera
sistematica dei malati cronici sono sorti in varie città Italiane numerosi centri per la cura della
psoriasi denominati PSOCARE in cui il personale medico ed infermieristico viene continuamente
aggiornato ed educato alla gestione dei servizi clinici dedicati. Solo nell’ambito di questi centri
possono essere somministrate cure altamente specifiche di derivazione biotecnologia, in quanto la
somministrazione di questi necessita di personale altamente specializzato e di un monitoraggio
stretto della terapia. Di norma si tratta di farmaci ben tollerati, ma le precauzioni d’uso sono
d’obbligo, la strategia terapeutica in termini di dosaggi e durata delle terapia và considerata in
maniera attenta e quando gli effetti collaterali si verificano possono essere anche molto importanti,
per cui il centro deve essere predisposto alla gestione dell’emergenza.
PROGETTO DI RICERCA
Utilizzando l’opportunità del grande bacino di utenza di malati psoriasici provenienti dalla
toscana, ma anche da altre regioni italiane, essendo il centro Fiorentino uno dei più grandi d’Italia, e
sfruttando la collaborazione tra clinici e ricercatori intendiamo contribuire alla ricerca in senso
clinico e molecolare. Intendiamo dunque definire ulteriormente i meccanismi patogenetici della
malattia, che sono argomento di dibattito internazionale, e classificare nella nostra casistica
l’efficacia e la sicurezza delle terapie in uso, associando a studi di popolazioni analisi convenzionali
e molecolari specifiche, seguendo procedure, che intendiamo ideare e validare con strumenti di
analisi statistica. Rimangono infatti interrogativi importanti a cui trovare le risposte adeguate circa
la patogenesi di una malattia che è peculiare della specie umana.
Le osservazioni da compiere e la possibilità di ricerca, anche solo utilizzando molecole attualmente
in uso, sono ancora tantissime e nel prossimo futuro saranno introdotti, perché già in fase di studio
numerosissimi tool farmacologici, da studiare su un organo, la pelle, che fortunatamente per i
ricercatori è facilmente accessibile, anche se estremamente complesso e per questo affascinante.
I modelli animali possono essere utili per definire alcuni meccanismi responsabili
dell’infiammazione e nello studio di geni coinvolti nella patogenesi, ma il modello animale rimane
troppo lontano rispetto ai meccanismi che si realizzano nell’uomo. Lo studio genetico e delle lesioni
dei pazienti sono sicuramente i modelli migliori da utilizzare. Inoltre non è completamente noto, ma
sembra che i subset leucocitari e di cellule dendritiche infiltrati nella cute di topo siano molto
diversi da quelli che si ritrovano nell’uomo (13).
Il progetto di ricerca prevede la formazione di una banca di dati relativi ai pazienti e alla loro
patologia e di campioni biologici di tessuti, cellule e plasma provenienti da questi.
Sarà infatti approvata e messa in uso una procedura che medici, ricercatori e pazienti
seguiranno al momento di iniziare la ricerca:
1. Ai pazienti verrà effettuata un’accurata anamnesi negli ambulatori al fine di ottenere dati
importanti per la definizione dei gruppi di studio.
2. I pazienti saranno sottoposti alle analisi cliniche convenzionali con valutazione dei parametri
infiammatori e della suscettibilità ad infezioni ed in particolare ai test per la tubercolosi latente.
3. Tutti i dati verranno opportunamente registrati su un sistema informatico.
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4. Sarà chiesto il consenso a far parte di gruppi di studio.
5. Ai pazienti verrà fatto un prelievo di sangue, che sarà inviato al laboratorio di farmacogenetica.
6. Se i pazienti daranno il consenso e saranno disposti a collaborare saranno sottoposti ad esame
bioptico della lesione ed eventualmente della zona sana limitrofa.
Creazione di una banca di campioni biologici
Uno degli steps del progetto sarà la creazione di una banca di colture cellulari (fibroblasti e
cheratinociti messe in coltura a partire dai prelievi tissutali effettuati), tessuti provenienti dai
prelievi bioptici, leucociti polimorfonucleati e plasma di soggetti psoriasici già inquadrati
clinicamente.
Il primo dato che cercheremo di mettere in evidenza sarà la ricerca di correlazioni tra i parametri
biologici e gravità dei quadri clinici.
Successivamente saranno messe in evidenza modificazioni indotte dai trattamenti farmacologici sui
parametri molecolari e clinici.
Effettuando il follow-up dei pazienti con la raccolta dei campioni biologici ci permetterà di indagare
le basi molecolari della risposta ai farmaci.
Separazione dei globuli bianchi dal sangue
La separazione dei globuli bianchi dal sangue sarà effettuata utilizzando un gradiente di ficoll. Il
sangue sarà diluito in PBS e sarà deposto delicatamente su un volume corrispondente di ficoll. La
sospensione sarà sottoposta a centrifugazione per 20 min a 2000 rpm. I globuli bianchi, che
rimarranno sull’anello all’interfaccia plasma-ficoll saranno raccolti dopo aver separato e raccolto il
plasma. Le cellule saranno dunque diluite in PBS e lavate con questo buffer. La pellet sarà risospesa
in medium per colture cellulari addizionato del 10% dimetilsolfossido e saranno poi congelate. Le
frazioni congelate saranno sottoposte ad ulteriori separazioni mediante il sistema di anticorpi
specifici legati a biglie magnetiche, separazione dei magneti in un campo magnetico esercitato da
una calamita ed eluizione delle cellule dal supporto. Le popolazioni ricavate saranno utilizzate negli
esperimenti di co-coltura o di attivazione da parte dei cheratinociti, provenienti dallo stesso
paziente.
Questo consentirà di indagare sui meccanismi molecolari di interazione tra linfociti, neutrofili e
cheratinociti.
Una porzione dei globuli bianchi sarà utilizzata per l’estrazione del DNA.
Estrazione del DNA e del RNA
L’estrazione degli acidi nucleici sarà effettuata con i metodi RNAeasy kit (Quiagen, Valencia, CA)
e DNAeasy kit seguendo le istruzioni. Il DNA così ottenuto sarà utilizzato per andare a cercare
mutazioni geniche correlate con la malattia.
La sintesi del cDNA necessaria per studiare i profili di espressione genica delle varie popolazioni
cellulari sarà effettuata con i metodi di retrotrascrizione seguendo i protocolli standard.
REAL-TIME QUANTITATIVE RT-PCR: L’analisi quantitativa del mRNA sarà effettuata
secondo le metodologie già ampiamente pubblicate. Per analizzare l’espressione di numerosi geni
sarà utilizzata la nuova e flessibile tecnologia dei “TaqMan® Low Density Array” fornita da
Applied Biosystems. Tale tecnologia permette di selezionare set di probe e primers per ciascun gene
dal catalogo online dei “TaqMan® Gene Expression Assays” che verranno precaricati nella piastra
dei Low Density Array. La PCR real time sarà effettuata combinando 25ng di cDNA per ciascun
campione con i reagenti “TaqMan® Universal PCR Master Mix” nella piastra del “TaqMan® Low
Density Array”. L’amplificazione e acquisizione dei dati verrà effettuata con lo strumento ABI
PRISM® 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Il gene della microglobulina
beta-2 sarà usato come gene di riferimento. L’analisi quantitativa dei risultati sarà basata sul metodo
del “Ct comparativo” .
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Immunoistochimica
Porzioni di tessuti sottoposti a congelamento in Azoto liquido e conservati a –80°C saranno
utilizzati per analisi immunoistochimiche e di attività enzimatiche e recettoriali.
Studi immunoistochimici saranno eseguiti come precedentemente gia ampiamente descritto in
letteratura. L’immunopositività sarà calcolata mediante un programma computerizzato di analisi di
immagine, Adobe Photoshop 6.0®, Adobe System Incorporated, USA. In sezioni di biopsie di cute
umana proveniente dai soggetti psoriasici nelle lesioni e nelle zone sane sarà valutata mediante
analisi quantitativa delle aree marcate tramite anticorpi specifici per i vari marker. Il numero di
cellule positive per i diversi anticorpi sarà contato su una griglia e normalizzato sul numero totale di
cellule.
Colture cellulari di cheratinociti
Biopsie tissutali ottenute dai pazienti saranno utilizzate per la separazione delle cellule. I
tessuti saranno incubati per circa 18 ore a 4°C in una soluzione di PBS contenente 0.3% dispasi e 50
μg/ml gentamicina. Dopo l’incubazione sarà separato il derma dall’epidermide e quest’ultima sarà
sottoposta a digestione triptica con tripsina allo 0,25% per 5 min a 37°C. La reazione verrà bloccata
aggiungendo un egual volume di siero fetale bovino (FCS). Le cellule saranno filtrate con un
apposito filtro, saranno lavate con un mezzo di coltura per cheratinociti (keratinocytes serum free
medium-KGM; In vitrogen Life technology) e saranno coltivate nello stesso medium addizionato di
gentamicina 50 μg/ml.
Le colture cellulari così ottenute verranno caratterizzate con metodiche di immunoistochimica o
RT-PCR per i marker tipici dei cheratinociti ed in particolare delle citocheratine, mentre sarà
verificata l’assenza di altri marker caratteristici di altri tipi cellulari come HLA-DR (macrofagi,
cellule dendritiche, linfociti B), CD3 (linfociti T), tirosinasi (melanociti). Saranno poi amplificate e
congelate al fine di far parte della banca che si andrà a costituire. Le colture preparate saranno
utilizzate per individuare la differenza nell’espressione citochimica in base al paziente da cui
provengono, la loro capacità di interagire con i linfociti isolati dal sangue periferico dello stesso
paziente e i meccanismi che regolano i processi infiammatori.
Dosaggio di citochine e fattori di crescita
Le citochine circolanti rappresentano lo stato di attivazione del processo infiammatorio in
atto per cui il dosaggio di queste rappresenta un utile marker sierico da correlare con la severità del
quadro clinico. Il dosaggio delle citochine ematiche a vari tempi del follow-up della terapia
farmacologica può essere utile per correlare la terapia, alle modificazioni cliniche e alla variazione
dell’assetto citochinico.
Per poter comprendere tutto il pannello di linfochine, monochine, chemochine, fattori di crescita si
utilizzerà un assay in multiplex fornito dalla upstate, che prevede l’uso di uno strumento
denominato LUMINEX 100 capace di rivelare contemporaneamente tutte le fluorescenze di tutte le
citochine comprese nel set.
Doseremo dunque per ogni campione IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCl8 (IL-8), IL-10, IL12(p40), IL-13, IL-15, IL-17, interferon (IFN)-α, INF-γ, TNF-α, Epidermal Growth factor (EGF),
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), (GM-CSF), CCL2, CCL3, CCL4, CCL11(Eotaxin).
Le citochine sieriche giocano un importante ruolo nella patogenesi della psoriasi e dell’artrite
psoriasica iniziando e perpetuando processi infiammatori di tipo umorale e cellulare, per cui sarà
molto interessante correlare questi dati ai dati clinici a lungo termine.
Il progetto si avvarrà di:
1. Ambulatorio per la raccolta iniziale delle informazioni cliniche.
2. Laboratorio di ricerca molecolare.
3. Unità di ricerca del Centro Interuniversitario di Dermatologia Biologica e Psicosomatica.
4. Centro PSO-CARE, che fornirà la numerosità dei pazienti e possibilità, in quanto munito di
autorizzazione, di utilizzare tutte le terapie farmacologiche in uso comprese quelle con farmaci
biologici.
5. Disponibilità alla collaborazione di una grande casa farmaceutica.
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Il ricercatore reclutato dovrà coordinare le attività e effettuare i test di laboratorio e i test di
correlazione statistica al fine di permettere la realizzazione del progetto esposto.
– studiare i test/markers
– sviluppare degli esami diagnostici predittivi
– fare gli esami già previsti dalla letteratura
– monitorare gli effetti collaterali
– integrare la ricerca con l’assistenza
– follow-up permanente e programmato dei pazienti
– il campo di applicazione è in così rapida evoluzione che impone le osservazioni in un arco
temporale di riferimento lungo.
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