4 APPLICAZIONI PCR

BIOLOGIA
MOLECOLARE NELLA
DIAGNOSTICA
MOLECOLARE
DIAGNOSI
PRENATALE
PRELIEVO DI LIQUIDO AMNIOTICO
ANALISI
DEL DNA
PRELIEVO DI VILLI CORIALI
I
99 bp
43 bp
villi coriali e tutte le strutture placentari sono di
taglio
origine embrionale: di conseguenza la dotazione
cromosomica dei singoli elementi cellulari riflette
esattamente il corredo cromosomico, o cariotipo,
dell’embrione.
ASSENTE
PRESENTE
Applicazioni della PCR
Individuazione di cellule cancerose tramite rivelazione di un
riarrangiamento cromosomico (linfoma follicolare)
DIAGNOSI
ONCOLOGICA
Questa PCR e’ in grado di rilevare 1 cellula cancerosa su 106 cellule normali
1
ALTRI ESEMPI DI TRASLOCAZIONE
CML= Leucemia Mieloide Cronica (Cromosoma Philadelphia)
Traslocazione reciproca cromosomi 9 /22
LINFOMA DI BURKITT
Traslocazione reciproca cromosomi 8/14
MRD (Minimal Residual Disease):
Quota residua minima di cellule
neoplastiche (tumori ematologici tipo le
leucemie ed i linfomi) non eliminate dalla
terapia di induzione della remissione o dalle
successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici, presenti ad un
livello inferiore alla capacità di rilevazione
delle metodiche convenzionali, sono in grado
di espandersi e dare origine alla recidiva
PCR nella diagnosi dell’
dell’anemia falciforme
MstII site
CCTGAG
DETERMINAZIONE DEL SESSO
Gene amelogenina
6 bp
Y
DETERMINAZIONE DEL SESSO
Gene amelogenina
cromosoma Y frammento di 112 cb
cromosoma X frammento di 106 cb
(due frammenti distinti)
X
cromosoma X frammento di 106 cb
cromosoma X frammento di 106 cb
(due frammenti sovrapposti)
2
DETERMINAZIONE DEL SESSO
STABILIRE RELAZIONI DI
PARENTELA:
Gene amelogenina
1
2
- TEST DI PATERNITA’
- IDENTIFICAZIONE PERSONALE
- ORIGINE ETNICA
M
1. MICROSATELLITI
Y
200 bp
100 bp
X
50 bp
2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILI
DELL’ mtDNA
CARATTERISTICHE DELLE
SEQUENZE RIPETUTE
MICROSATELLITI:
(STR: Short Tandem Repeat)
Unità di ripetizione:
2-5 nucleotidi
Numero di unità:
≤ 40
Altamente polimorfiche
Ereditarietà Mendeliana
APPLICAZIONI
Medicina LEGALE (criminologia, test di paternità)
Identificazione personale (Fingerprint)
MICROSATELLITI UTILIZZATI
ETEROZIGOSITA’
70%
Locus
Ripetizioni
TH01
Tirosina Idrossilasi (int. 1)
(CATT)5-12
vWF
Fattore vonWillebrand (int.40)
(TCTA)9-15
DM1
Miotonina (3’ UTR)
(CTG)5-40
3
Indagini in medicina forense
AUTORADIOGRAFIA
GEL ACRILAMIDE DENATURANTE
vWF
Indagini in medicina forense
STABILIRE RELAZIONI
DI PARENTELA - ORIGINE ETNICA
1. MICROSATELLITI
2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILI
DELL’ mtDNA
EREDITA’ MATERNA
DELL’mtDNA
MITOCHONDRIAL DNA
CONTROL REGION
mtDNA ∼ 16600 bp
4
Gli aplogruppi H, J, U, T, K, X, V e I sono ampiamente diffusi
in Europa.
ALLELE E APLOTIPO
ALLELI:
forme alternative di un determinato gene
APLOTIPO: Il termine aplotipo si riferisce al DNA
mitocondriale essendo questo genoma non sottoposto a eventi
di ricombinazione. Tutti i geni e le regioni intergeniche di un
genoma mitocondriale vengono ereditati assieme, pertanto le
sequenze varianti sono definite aplotipi.
H caucasico specifico
I, J, e K presenti anche in Asia e Africa
Aplogruppi in Africa: L, L1, L2, U=L3, M
Aplogruppi in Asia: A, F, B, D, G, E, C, M
Aplogruppi in America: A, B, C, D
Tuttavia, non è possibile stabilire con certezza l’origine etnica di un
individuo, perché gli aplogruppi noti sono presenti praticamente in
tutto il mondo. Si può parlare solo di maggiore o minore probabilità, a
seconda della frequenza dell’aplogruppo nella popolazioone in esame.
OGM
Specie: Glycine max (SOIA)
Evento: (GTS40-3-2)
P- 35S
CTP
CP4 EPSPS
P- 35S : promot ore del ”Cauliflower mosaic virus”
C TP: sequenza di un “c hloroplast t ransit pept ide” da
NOS 3'
Pet unia hybrida c he funge da pept ide segnale per il t ransit o
del prodot t o t ransgenic o nel c loroplast o
C P4 EPSPS : gene della 5-enolpiruvilshikimat o-3-fosfat o sint asi da
Agrobac t erium sp. (st rain CP4) c he c onferisc e
la resist enza al glifosat o, ingredient e at t ivo dell'erbic ida Roundup
NOS 3’ : t erminat ore del gene della nopalina sint asi da
Agrobac t erium t umefac iens
AZIENDA NOTIFIC ANTE: Monsant o
5
BIOLOGIA
MOLECOLARE NELLA
DIAGNOSTICA DELLE
MALATTIE INFETTIVE
- Diagnostica molecolare nell’infezione da
virus dell’AIDS (HIV-1)
- Diagnostica molecolare nell’infezione da
virus dell’epatite C (HCV)
6
CLASSIFICAZIONE DI HIV
HIV-1= DIFFUSO PRINCIPALMENTE IN
EUROPA
HIV-2= DIFFUSO NELLE ZONE SUBEQUATORIALI E TROPICALI
CLASSIFICAZIONE DI HIV-1
M= MAJOR GROUP
O= OUTLIER
N= NON-M/NON-O
HIV-1
M= MAJOR GROUP
9 sottotipi: A, B, C, D, F, G, H, J and K.
Le metodologie di diagnosi dell’infezione da
HCV e HIV:
Per l'identificazione dell'infezione da HIV e HCV
sono disponibili varie metodiche, basate sulla
identificazione degli anticorpi prodotti dal
sistema immunitario contro il virus (metodiche
sierologiche) oppure sulla ricerca di antigeni e
molecole
del
virus
stesso
(metodiche
virologiche). Ai fini della diagnosi di infezione
attualmente vengono utilizzati il test ELISA ed il
test Western-Blot.
METODICHE SIEROLOGICHE
1.ELISA
2.WESTERN BLOTTING
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METODO ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
Test Immunoenzimatico (ELISA): è la metodica utilizzata per il test di
screening, in quanto di facile esecuzione e di costo limitato.
Questo test ricerca gli anticorpi prodotti contro alcuni antigeni
virali, (gp 41 e gp120-HIV), che dopo una prima infezione
restano nell'organismo per tutta la vita. Il test ha una
sensibilità di oltre il 95%, ma in alcuni casi si possono avere
delle risposte errate:
• falsi positivi: il test risulta positivo in assenza di
infezione. Può succedere in persone con malattie che
alterano la funzione del sistema immunitario portando
alla produzione di anticorpi anomali (es: leucemie,
linfomi, malattie autoimmuni, gravi epatopatie, ecc.);
• falsi negativi: il test risulta negativo anche se
l'infezione è presente. Può succedere in persone che si
sono infettate molto recentemente, ma nelle quali non
si sono ancora formati gli anticorpi che reagiscono con
il test; questo avviene solitamente nelle prime
settimane (o mesi) dopo il contagio (periodo finestra).
WESTERN BLOTTING
Western Blot (WB): è un test dotato di maggiore
specificità e sensibilità, utilizzato per confermare la
positività di un test ELISA. Questa metodica permette
di evidenziare la presenza di anticorpi diretti contro le
maggiori proteine virali: il test viene definito positivo
quando sono presenti almeno 2 degli anticorpi
principali; se il test risulta dubbio o indeterminato va
ripetuto dopo alcuni mesi.
METODICHE VIROLOGICHE
1.ANTIGENEMIA
2.RICERCA DELL’RNA VIRALE
ANTIGENEMIA PER HIV
Antigenemia p24: La proteina p24 è un antigene del
core virale, e la sua presenza nel sangue indica uno
stato di attiva replicazione del virus. La positività
dell'antigenemia p24 è più frequente nel periodo
successivo al contagio e nelle fasi più avanzate della
malattia. Questo test attualmente non viene più
eseguito, in quanto superato per sensibilità dalla
ricerca dell’ RNA virale.
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RICERCA DEL VIRUS NEL SANGUE
Viremia (HIV-RNA, HCV-RNA)
Consente di ricercare molecole di RNA virale, la cui quantità nel
sangue è direttamente proporzionale al grado di attività
replicativa del virus. La viremia viene espressa in numero di copie
di VIRUS per ml di sangue; ci sono vari tipi di test che possono
essere utilizzati per la determinazione della viremia ma quello
più accreditato è la Q-PCR.
REAL TIME
PCR : STANDAR
CURVE
Standard
curve
Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction): è la metodica
più diffusa, ed ha un range di sensibilità tra 150 e 1.000.000 di
copie;
I GENOTIPI DI HCV
CARATTERIZZAZIONE
DEI GENOTIPI DI HCV
Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possono
essere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV
Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per la
caratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipi
virali finora conosciuti
•L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA
COSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”
•DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
•IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE
CARATTERIZZAZIONE
DEI GENOTIPI DI HCV
Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possono
essere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV
Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per la
caratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipi
virali finora conosciuti
L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA
COSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”
AMPLIFICAZIONE CON PRIMERS GENOTIPO
SPECIFICI
DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE
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