Immunoistochimica e Biologia Molecolare
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Tecniche di Immunoistochimica e Biologia Molecolare applicate alla diagnostica istopatologica Immunoistochimica • Metodiche utilizzate per identificare costituenti cellulari e tissutali come antigeni in situ, utilizzando anticorpi • Le tecniche di IIC possono essere applicate su cellule isolate su preparati istologici e citologici Immunoistochimica Alcuni tumori possono essere diagnosticati con un semplice esame istologico, mentre altri per una corretta definizione richiedono l’ausilio di ulteriori indagini: • Istochimiche • Immunoistochimiche • Biologia molecolare L’immunoistochimica al microscopio Immunoistochimica Il principio dell’IIC prevede il riconoscimento di un antigene mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico. Antigene L’antigene è una molecola proteica, glicoproteica o lipoproteica capace di di evocare una risposta immune da parte del sistema immunitario. Ogni antigene è costituito da uno o più siti antigenici. Disponendo dell’ anticorpo specifico qualunque antigene può essere evidenziato mediante reazioni di IIC. DEFINIZIONE EPITOPO 1 DI ANTIGENE Ogni singolo Ag è costituito da una o più porzioni chiamate epitopi o determinanti antigenici differenti tra loro Ag EPITOPO 2 EPITOPO 3 ANTICORPO DEFINIZIONE DI ANTIGENE L’antigenicità di una molecola dipende dalla sua composizione e conformazione strutturale ed è modificata da tutti i trattamenti fisici e chimici attuati durante la processazione dei campioni Anticorpi Gli ac sono molecole proteiche (Ig) prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi ad un determinante antigenico. Possono essere: Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e diretti contro lo stesso determinante antigenico Policlonali: costituiti da anticorpi diversi fra loro e diretti contro differenti determinanti antigenici Ibridi: immunoglobuline modificate in modo tale che ciascun frammento abbia specificità per un differente determinante antigenico Struttura dell’anticorpo Frammento Fc porzione costante specie-specifica Frammento Fab porzione dell’ Ig in grado di legare l’Ag, è costituito da domini ipervariabili che consentono grande versatilità nel riconoscimento e nel legame con l’Ag (specificità e affinità) STRUTTURA DI UN ANTICORPO REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Il complesso tra l’antigene e l’anticorpo che si forma nella reazione immune non è di per sé visibile. E’ necessario quindi servirsi di marcatori che direttamente o indirettamente possano evidenziarne la formazione Markers della reazione immunoistochimica Attualmente sono impiegati due differenti tipi di tracciante: • Fluorescente • Enzimatico Tecniche Immunoistochimiche Tecniche di Immunofluorescenza utilizzano fluorocromi come marcatori della reazione antigeneanticorpo Tecniche Immunoenzimatiche utilizzano enzimi per evidenziare la reazione antigene-anticorpo Tecniche di immunofluorescenza • Le sostanze fluorescenti maggiormente utilizzate sono: • Isotiocianato di fluoresceina • Tetrametil rodamina • Ficoeritrina • Cianina • Rosso Texas Immunofluorescenza CK Rodamina Carcinoma lobulare della mammella CK Fitc Immunofluorescenza Metodi di indagine Metodi diretti Metodi indiretti Immunofluorescenza Metodo indiretto Immunofluorescenza Metodo diretto Immunofluorescenza Metodo diretto – Tessuto nervoso Doppia colorazione Immunofluorescenza Limiti dell’immunofluorescenza -Scarsa possibilità di diluizione degli Ac -Mancanza di informazioni topografiche -Naturale estinzione della fluorescenza -Necessità di osservazione in microscopia particolare Non conservabilità dei preparati Campi di applicazione dell’immunofluorescenza • Diagnostica nefropatologica • Diagnostica dermatologica • Indagini citoflussimetriche Immunofluorescenza Nella diagnosi delle patologie renali l’IF diretta permette di identificare Ag e altri fattori presenti nelle strutture glomerulari. La evidenziazione di depositi di immunocomplessi, di frazioni del complemento, di fibrinogeno e la loro distribuzione a livello glomerulare è un fondamentale supporto nella diagnosi differenziale tra le varie glomerulonefriti. Immunofluorescenza Patologia renale Glomerulonefrite granulare Pattern granulare IgG Immunofluorescenza Patologia cutanea Depositi lineari antianti-C3 Depositi lineari antianti-IgG Immunofluorescenza Analisi Citofluorimetria Sospensione cellulare Immunofluorescenza Tessuto fresco Campionamento Congelamento rapido in azoto liquido Sezioni di 44-5 µ al microtomo congelatore Asciugare le sezioni all’aria Conservazione a -80 Sezioni non utilizzate Fissare in acetone per 10’ Lavare con PBS Colorazione Congelamento Il congelamento permette di conferire al campione di tessuto una rigidità tale da consentire l’allestimento di sezioni sottili (25 µ) permette inoltre di: • Stabilizzare le strutture cellulari • Mantenere inalterate le caratteristiche di antigenicità del tessuto • Non interferire nella reazione Ag-Ac. Congelamento La biopsia chirurgica viene inglobata in una particolare resina chiamata OCT che ha la proprietà: - Solidificare a basse temperature - Preservare il tessuto - Formare un supporto rigido necessario per il taglio delle sezioni. Congelamento Il metodo maggiormente utilizzato è quello di immergere il tessuto per alcuni secondi in azoto liquido che essendo alla temperatura di –196°C consente un rapido congelamento senza provocare danni alla struttura antigenica e all’architettura morfologica Tecnica per If diretta Tessuto fresco Campionare Congelare Tagliare al criostato Sezioni di 4 µ su vetrini con adesivo o polarizzati Asciugare le sezioni all’aria Fissare con acetone a 4°C Lavare con tampone Incubare con Ac primario fluorescinato 1 ora Lavare con tampone Montare con un sistema acquoso e conservare al buio Osservare al microscopio a fluorescenza Immunoistochimica tecniche e metodi La tecnica Immunoenzimatica prevede l’uso di enzimi legati direttamente o indirettamente all’Ac I° per evidenziare la formazione del complesso immune. L’enzima catalizza la formazione di un precipitato colorato e insolubile visibile al microscopio, nel sito in cui è avvenuta la reazione Ag-Ac EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE A seconda del tracciante enzimatico: • IMMUNOPEROSSIDASI • IMMUNOFOSFATASI • IMMUNOGLUCOSIDASI • IMMUNOβ β−GALATTOSIDASI Perossidasi • E’ ottenuta dal rafano ma è presente anche nei tessuti umani • Può formare legami covalenti con le immunoglobuline • Suo substrato è il perossido di idrogeno 2 H2O2 2H2O+O2 elemento ossidante per il cromogeno Immunoperossidasi Il cromogeno più utilizzato è la DAB che da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno. L’insolubilità e la stabilita del prodotto di ossidazione della DAB consentono il montaggio e l’archiviazione dei preparati dei preparati secondo le tecniche di routine. Immunoperossidasi Altri substrati come ad es. l’ AEC fornisce un prodotto di osssidazione rosso, è liposolubile e fotosensibile rendendo necessaria la conservazione al buio nonché la documentazione fotografica Metodi immunoenzimatici I metodi immunoenzimatici possono essere: Diretti Indiretti Il metodo diretto scarsamente sensibile non viene utilizzato nei laboratori di Anatomia Patologica Metodi Immunoenzimatici Il metodo indiretto: •E’ estremamente sensibile e ha il vantaggio che un solo anticorpo II° marcato può essere utilizzato per riconoscere diversi anticorpi I° appartenenti alla stessa specie. Perossidasi La scelta del cromogeno si pone tra DAB - Cancerogena - Origina un precipitato marrone insolubile nei solventi organici AEC - Non cancerogeno - Origina un precipitato rossiccio solubile nei solventi organici Fosfatasi alcalina • Si ottiene dall’intestino di bue • Substrati sono gli esteri fosforici alfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR fosfato • Cromogeno è un sale di tetrazolio • Conferisce una colorazione rossa Immunoistochimica Tecniche e metodi Enzima + substrato cromogeno Prodotto colorato Metodi Immunoenzimatici Diretto Ac I° marcato Semplice e rapido Indiretto Ac I° non marcato Ac II° Storia dell’immunoistochimica dell’immunoistochimica • 1941 Coons Coons:: – Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di tessuto • 1966 Nakane Nakane:: – Anticorpi marcati con enzimi • 1970 Sternberger Sternberger:: – Perossidasi erossidasi--Anti Perossidasi (PAP) • 1981 Hsu Hsu:: – Avidin Biotin Complex (ABC) • 1984 Cordell Cordell:: – Alkaline Phosphatase Anti Alkaline Phosphatase (APAAP) • 1989 Bobrow Bobrow:: CSA-TSA) – Catalysed Reporter Deposition (CARD CSA• 1993 Bisgaard – Polimeri del destrano Perossidasi AntiAnti-Perossidasi Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario Enzima Complesso PAP Metodi Immunoenzimatici Il sistema Avidina Biotina (ABC) si basa sulla straordinaria affinità fra l’avidina, una glicoproteina con p.m. 68.000 D presente nell’albume d’uovo e la biotina piccola molecola vitaminica. In particolare la biotina si lega ai gruppi aminici -NH2 degli Ac e della Pr di modo che più molecole di biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig Metodo ABC LSAB Labelled Streptavidin Biotin (Peroxidase) Press left mousebutton Metodo ABC • Antigene • Anticorpo primario • Anticorpo secondario biotinilato • Complesso ABCABC-Pr Sistemi avidina avidina--biotina biotina:: vantaggi • Alta affinità dell’avidina dell’avidina per la biotina • E’ possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromo/enzima fluorocromo /enzima--proteina • Elevata amplificazione • L’ L’avidina avidina coniugata è molto stabile • Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici metodiche • Basso costo Sistemi avidina avidina--biotina biotina:: svantaggi • Biotina endogena • Reazione con multipli passaggi Polimeri del destrano Polymer Detection Polymer Detection Pre ss left mousebutton Press left mouse button Metodi Immunoenzimatici Polimeri del destrano Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario secondariopolimeropolimero -enzima Polimeri del destrano: destrano: vantaggi • Ottima sensibilità • Nessuna interferenza legata alla biotina • Tempi di reazione ridotti Catalyzed Signal Amplification Catalyzed Signal Amplification •Tiramide biotinilata •acqua ossigenata Catalyzed Signal Amplification Catalyzed Signal Amplification CARD: vantaggi • • • • Altissima sensibilità Aumenta la diluizione di anticorpi primari 05 Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi Possibilità di utilizzo in svariate metodiche (ibridazione in situ, FISH, etc) • Numerosi apteni utilizzabili Metodi Immunoenzimatici Doppie colorazioni Permettono di evidenziare contemporaneamente nella stessa cellula due o più antigeni diversi utilizzando differenti substrati cromogeni e differenti enzimi Colorazioni doppie TCRBCL: CD20/CD54R0 Doppia colorazione Inibizione di enzimi endogeni Applicando metodiche di immunoistochimica enzimatica è necessario ricordare che alcuni enzimi utilizzati come traccianti possono essere presenti nel tessuto da analizzare, è necessario perciò inibire l’enzima endogeno senza danneggiare le proprietà antigeniche. Trattamento del materiale istologico e citologico da sottoporre ad indagini di IIC Dall’effettuazione del prelievo bioptico o citologico al momento dell’esame microscopico dei preparati colorati con reazioni immunoistochimiche intervengono diversi fattori che possono influenzare i risultati e portare a false interpretazioni dei quadri patologici Trattamento del materiale I campioni bioptici da sottoporre ad indagini di IIC vengono trattati secondo le normali procedure per l’allestimento delle sezioni per la diagnostica istomorfologica e cioè • Fissazione • Disidratazione e chiarificazione • Inclusione in paraffina • Taglio al microtomo Fissazione Gli scopi principali della fissazione sono: • Preservare la morfologia cellulare e l’architettura tissutale • Permettere al campione di tollerare gli stress della processazione • Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni tradizionali • Preservare l’integrità antigenica • Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originale Fissazione Tra i fissativi quello maggiormente impiegato è la formalina neutra tamponata (10%), (10%), che permette il miglior compromesso tra stabilità, costo, preservazione di molti antigeni, buona morfologia. Azione della formalina La fissazione con formalina determina legami crociati tra il liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con mascheramento di molti siti antigenici. Trattamento del materiale istologico •Azione della formalina sulle proteine del tessuto Proteina naturale Proteina denaturata Reticolazione Trattamento del materiale istologico Azione della formalina sulle proteine del tessuto Prima della fissazione Dopo fissazione Tempi e modalità di fissazione variabili preanalitiche • Primo obiettivo di standardizzazione • Fissare immediatamente il campione • Un ritardo determina degradazione proteolitica con diffusione dell’antigene e ridotta o assente immunocolorazione • Evitare una fissazione prolungata • Tempi non superiori alle 24 ore • Condizionano l’immunoreattività tissutale Tempi e modalità di fissazione variabili preanalitiche Ritardo della fissazione Er Procedure di ripristino dell’antigenicità I processi a cui sono sottoposti i tessuti o le cellule dal momento del prelievo all’effettuazione della reazione di IIC possono danneggiare l’antigenicità rendendo: • Inaccessibile l’Ag all’Ac • Modificando parzialmente l’antigenicità • Modificandola in modo irreversibile Ripristino dell’antigenicità La reattività immunologica può essere ripristinata rompendo questi legami crociati o con un trattamento Enzimatico Alte temperature Trattamento enzimatico Gli enzimi proteolitici rompono i legami aldeidici rendendo i siti antigenici disponibili per il relativo Ac. Quelli maggiormente utilizzati sono: • Pepsina • Proteasi XXIV • Tripsina • Proteinasi K Trattamento enzimatico L’incubazione con uno di questi enzimi può avvenire a temperatura ambiente o a 37°C per un periodo di tempo variabile (5-30’) e dipende: • concentrazione • durata della fissazione • spessore della sezione • tipo di enzima Ripristino dell’antigenicità A partire dagli anni 90 l’uso del calore ha largamente sostituito i metodi enzimatici. Le alte temperature sono in grado di ristabilire l’originale struttura proteica dopo che questa è stata modificata dalla fissazione in formalina Metodi di recupero dell’antigenicità • Come effettuare lo smascheramento Recupero a caldo • • • • Forno a microonde Pentola a pressione Bagno termostatato Autoclave Efficienza dei metodi di recupero dell’ antigenicità Fattori che condizionano lo smascheramento antigenico in mezzo liquido Tempo di riscaldamento T (°C) x t (min.) pH -Ag indifferenti al pH della soluzione -Ag buoni risultati a pH acido -Ag buoni risultati a pH basico Smascheramento Intensità di colorazione aumenta aumentando i tempi Recettore per estrogeni 10’ Smascheramento Recettore estrogeni 20’ ’ Smascheramento Recettore per estrogeni 30’ Efficienza dei metodi di recupero dell’antigenicità • Tempo/Temperatura • A parità di trattamento il tempo e la temperatura alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un ruolo fondamentale per il raggiungimento di un risultato ottimale • Casi con reattività debole o incerta possono diventare chiaramente positivi se esposti al calore per un periodo più lungo • Viceversa casi sicuramente negativi restano tali anche dopo esposizione prolungata al calore Metodi di recupero dell’antigenicità • • • • • Soluzioni utilizzate Tampone citrato 0.01 M pH6 Tampone EDTA pH 8-9 Tampone glicina Acqua distillata FASI DELLA COLORAZIONE IIC SPARAFFINARE REIDRATARE PRETRATTAMENTO INIBIZIONE Ac I° Ac II° ABC-ENZIMA CROMOGENO CONTRASTO MONTAGGIO OSSERVAZIONE Interpretazione dei risultati Una delle maggiori difficoltà dell’immunoistochimica sta nell’interpretazione dei risultati. La presenza di deposizione di substrato cromogeno in corrispondenza di una cellula o di un tessuto, spesso, dovrebbe significare che in quella sede è avvenuta una reazione tra l’anticorpo e l’antigene tissutale. Questo è vero nella maggior parte dei casi, tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono essere responsabili della colorazione Interpretazione dei risultati Le cause più comuni di colorazioni dovute ad artefatti sono: •Presenza di perossidasi o fosfatasi (già presenti nel tessuto ) non adeguatamente inibite. •Cross Cross--reattività dell’anticorpo I° I° con un antigene diverso da quello in studio. •Legame aspecifico dell’anticorpo alla cellula o tessuto (attraverso il frammento Fc o per carica elettrica) •Inadeguata fissazione del tessuto. Scarsa fissazione provoca un eccesso di “fondo “; eccesso di fissazione provoca una ridotta sensibilità Pattern di colorazione Esistono alcune strategie che possono aiutare a distinguere una colorazione immunoistochimica specifica da una non specicifica o legata ad artefatti L’interpretazione dei risultati in IIC deve tenere conto del tipo di positività attesa per un determinato Ab che può essere di quattro tipi: • Nucleare • Citoplasmatica • Di membrana • Extracellulare Pattern di colorazione • NUCLEARE • CITOPLASMATICO • DI MEMBRANA Campi di applicazione L’approccio diagnostico immunoistochimico deve essere condotto con razionalità scegliendo, sia il tipo di materiale più idoneo, sia gli anticorpi da utilizzare, secondo un algoritmo appropriato Campi di applicazione Si definisce algoritmo immunoistochimico la successione logica nella selezione degli anticorpi da utilizzare al fine di giungere alla diagnosi. Esiste un algoritmo primario che consiste nell’utilizzo di un pannello di anticorpi che consente di identificare la neoplasia Campi di applicazione Le positività riscontrate con l’algoritmo primario consentono di applicare un algoritmo secondario al fine di classificare adeguatamente la neoplasia. Raramente si rende necessario l’utilizzo di un ulteriore algoritmo Campi di applicazione “IHC” • Marcatori di differenziazione • “Colorazione speciale” • Marcatori di neoplasia • Marcatori di agenti infettivi • Fattori prognostici Marcatori di differenziazione • Natura della popolazione cellulare • Linfomi B/T • Epiteliale vs. mesenchimale • DD melanoma amelanotico • Mesotelioma vs adenocarcinoma Marcatori di differenziazione • Sottoclassificazione linfomi • Sottoclassificazione neoplasie mesenchimali • Differenziazione endocrina Colorazione speciale • Individuazione tipi cellulari specifici: cellule sustentacolari, cellule follicolari dendritiche ecc. CD21 - cellule FD Marcatori prognostici • Ag regolatori del ciclo cellulare (Mib (Mib--1, cicline) • Recettori ormonali (Er, Pr) • Prodotti di oncogeni e geni oncosoppressori (Erb (Erb--B2, Myc) • Ag legati all’invasività (E (E--caderina) Marcatori immunoistochimici di riconosciuta validità clinica • ER, PR • Proliferazione – Ki67 • HER HER--2 • KIT • EGFR CARCINOMA DELLA MAMMELLA Fattori prognostici/predittivi Il carcinoma della mammella, viene caratterizzato con lo studio di: Parametri morfologici Grandezza del tumore,istotipo,infiltrazione, grado di differenziazione, presenza o meno di linfonodi metastatici Parametri biologici (non puramente morfologici) • Attività proliferativa (MIB1) • Assetto ormonale (ER,PR) • Prodotti di oncogeni (HER2) Carcinoma della mammella Fattori pronostici Per caratterizzare i parametri biologici si impiegano metodiche: Immunoistochimica che permettono di evidenziare sostanze di natura proteica presenti nei tessuti Ibridazione in situ (FISH e CISH) identificazione di una sequenza di acido nucleico in tessuti o cellule Marcatori prognostici/predittivi • Validità clinica Estrogeni-Progesterone Mib1 Cerb-2 Queste indagini sono svolte su tutte le neoplasie perché complementari non solo all’interpretazione istopatologica ma anche per le relative implicazioni terapeutiche Scelta degli anticorpi Estrogeni Scelta degli anticorpi Progesterone Scelta degli anticorpi KI67 (Mib1) Valutazione dell’attività proliferativa delle cellule neoplastiche e normali. Si utilizza un Ac monoclonale ki67 (clone MIB1) che riconosce un antigene nucleare presente in tutte le fasi attive del ciclo cellulare Scelta degli anticorpi Mib1 Scelta degli anticorpi C-erb-B2 L’anticorpo reagisce con l’oncoproteina C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. La colorazione è localizzata nelle membrane cellulari delle cellule neoplastiche Her-2 Kit standardizzati Devono essere eseguiti accuratamente Valutazione dello stato di HER2/neu Attualmente sono disponibili numerosi sistemi per valutare lo stato di HER2/neu (Southern Blot, Dot Blot, PCR quantitativa). I più frequentemente utilizzati sono la dimostrazione dell’iperespressione di HER2 mediante indagine immunoistochimica (IHC) e dell’amplificazione mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH). Carcinoma della mammella: valutazione dello stato di HER-2/Neu Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia dei recettori per i fattori di crescita. E’ un componente della via di trasduzione del segnale coinvolto nella crescita cellulare. La sua localizzazione extra-cellulare lo rende un possibile bersaglio farmacologico. Valutazione dello stato di HER2/neu I campioni con intensa positività per Her-2 (IHC 3+) sono elegibili per la terapia con Herceptin. I campioni IHC 2+ devono essere ritestati con altro metodo, preferibilmente con indagine FISH. I campioni sono inizialmente testati mediante IHC. HER2/NEU EXPRESSION IHC - HercepTest 2+ 3+ Vysis (PathVysion) - Dakocytomation HER-2/DNA probes Permettono di valutare l’ amplificazione del gene HER-2 mediante FISH. Entrambe le metodiche prevedono l’utilizzo di due sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti: HER-2 che identifica l’ intero gene HER-2 marcato con Spectrum Orange® CEP 17 è marcato con Spectrum Green® e si ibridizza con il DNA alfa-satellite localizzato in corrispondenza del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1) HER-2/NEU - FISH HER2/NEU AMPLIFICATION Low Level High Level Problemi metodologici • Tecniche di smascheramento antigenico • Cloni utilizzati • Sensibilità dei sistemi di rivelazione • Scoring methods • Controlli di qualità Marcatori di neoplasia • bcl bcl--2 - linfomi follicolari vs iperplasia follicolare • Ciclina D1 - linfoma mantellare • p53 • p80 - ALCL Marcatori di neoplasia Bcl2 Marcatori di differenziazione • Determinazione della sede primitiva di una neoplasia metastatica – Profilo cheratine – Marcatori melanocitari – TTF1 ecc... Applicazioni microbiologiche • Identificazione di virus • Identificazione di batteri HPV Helicobacter Pylori HPV e carcinoma della cervice . Tra gli agenti virali un posto di rilievo è assegnato allo Human Papilloma Virus (HPV) Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato un innegabile legame tra infezione da HPV e sviluppo del carcinoma della cervice uterina HPV e oncogenesi cervicale •Sono stati identificati 100 genotipi di cui 40 presentano tropismo per il tratto anogenitale •Vengono suddivisi in tre categorie che ne identificano il diverso potenziale oncogeno Alto rischio (16, 18 ) Rischio intermedio (31,33,35,51,58) Basso rischio (6, 11, 34,42,61,68) Colorazione IIC per HPV Ibridazione in situ • Ibridazione in situ ISH HPV 16-18 PCR 1) Estrazione del DNA • Le sezioni raccolte in un tubo sterile sono state sparaffinate, reidratate e incubate per tutta la notte con proteinasi K a 37°C • Inattivazione della proteinasi K a 95°C per 30’ 2) Reazione di PCR Preparare una miscela di amplificazione contenente: H2O, dNTP, MgCl2, Taq-polimerase templato PCR La PCR avviene attraverso una serie di cicli composti da tre fasi: Denaturazione Annealing Allungamento Termociclatore computerizzato opportunamente programmato PCR P.M. Contr- Contr+ - + + Elettroforesi su gel di agarosio + Ibridazione inversa Tipizzazione genotipica di HPV Campi di applicazione Possibilità di individuare i ceppi coinvolti Possibilità di individuare lesioni latenti o preneoplastiche Utilità nello screening preventivo Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE • Famiglia di proteine che costituiscono la maggior parte dei filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule epiteliali. • In base al peso molecolare che varia da 40 a 67 kD sono numerate da 1 a 20 • La loro evidenziazione in una cellula normale o neoplastica depone quindi per una origine epiteliale Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE • Sono espresse in modo caratteristico nei diversi tipi di epiteli normali e/o neoplastici Es: CK7 + ADK polmone -ADK colon CK20 - ADK polmone + ADK colon • In IIC vengono utilizzati Ac diretti contro le singole CK o cocktail di Ac variamente allestiti per identificare CK a basso/medio/alto peso molecolare Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100 • L’anticorpo reagisce con una proteina presente in numerose linee cellulari (cellule muscolari striate e cardiache, melanociti, elementi gliali) • E’ positiva nei mioepiteli ma non è un marcatore specifico Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Actina del muscolo liscio • E’ un componente del sistema contrattile cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali ma anche dai miofibroblasti stromali • L’Ac diretto contro l’actina identifica quindi tutti gli elementi normali o neoplastici che presentano una struttura contrattile di tipo muscolare Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie •Actina del muscolo liscio Sono stati identificati sei tipi di actina a seconda del tessuto muscolare di origine riconosciuti da Ac differenti -alfa actina muscolo liscio -alfa actina muscolo scheletrico e cardiaco -alfa actina muscolo liscio, mioepiteli, miofibroblasti Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie •Actina del muscolo liscio Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina • E’ una proteina che regola la contrazione delle cellule muscolari lisce • E’ un marcatore molto sensibile delle cellule mioepiteliali. Mostra moderata crossreattività con i miofibroblasti • Positività citoplasmatica Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie • E-Caderina • Le caderine sono una famiglia di proteine di adesione cellulare. Formano complessi con le proteine citoplasmatiche chiamate catenine.Questi complessi insieme con altri componenti del citoscheletro,tra cui l’actina, sono parte essenziale del sistema di adesione intercellulare e quindi coinvolti nella invasività delle cellule tumorali Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie • E-Caderina
