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21/04/17 ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA Ognistepcos,tuisceun possibilepuntoper controllare l abbondanzadi unacerta proteina. Lamaggiorpartedel controlloavvienea livellodella TRASCRIZIONE. ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA -PROCARIOTICA Regolazione Genica nei procarioti • E. coli ha 4288 geni codificanti. • Geni costitutivi: costantemente trascritti (es. quelli della glicolisi). • Geni inducibili: espressi solo in determinate condizioni (es. quelli del metabolismo del lattosio vengono espressi solo in presenza di questo zucchero nell’ambiente). • Regolazione dell’attività di un enzima e/o regolazione del numero di molecole di enzima per cellula. Regolazione Genica nei procarioti • Jacob e Monod (1961): identificano l Operon Lac, complesso genico comprendente Ø geni strutturali con funzioni correlate (lacZ, lacY, lacA codificanti per galattosidasi, galattosio permeasi, galattoside transacetilasi) sotto il controllo di un unico promotore Ø geni di controllo (operatore e repressore) Regolazione Genica nei procarioti • L’operatore è una sequenza di basi, in parte sovrapposta al promotore, che si trova a monte del primo gene strutturale • In assenza di Lac, una proteina repressore lattosio (codificata da un gene regolatore costitutivamente espresso) si lega all’operatore lattosio, l’RNA polimerasi non può legarsi al promotore e la trascrizione dell’operone Lac è inibita 1 21/04/17 Regolazione Genica nei procarioti • Il repressore lattosio ha anche un sito di legame allosterico per l allolattosio (prodotto in piccole quantità in presenza di lattosio). Quando l allolattosio lega il repressore, questo si modifica e si stacca dall operatore, il promotore si libera e l RNA pol trascrive l operone • In assenza di allolattosio, il repressore si lega nuovamente all operatore, bloccando la trascrizione dell operone Regolazionedell espressionegenicaneiprocario, Principalmente regolazionetrascrizionale Unesempioè l OPERONELAC:geni,trascriF insieme,checodificanoper3proteine necessarieperl u,lizzodellaJosio (galaJosio-glucosio).Questooperone vienetrascriJosec èillaJosioenonc è ilglucosio. ILREGULONE • Regulone:gruppodioperonicontrolla,daunsolo generegolatore • LaproteinaCAPcontrollalatrascrizionediuna seriedioperonicoinvol,indiverseviecataboliche • UnamutazionediCAPpuòimpedireallacelluladi metabolizzareunaseriedizuccheridaessa regola, OPERONE LAC 2 21/04/17 QuestaESPRESSIONEpuò avvenireconunaefficienza diversa. Trascrizione 20/04/17 Regolazionedell espressione genicaneglieucario, Eucarioti pluricellulari: -un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati; -le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature, non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come differenziamento cellulare I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi di quelli utilizzati dagli altri organismi. 14 Cellula umana contiene circa 30000 geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale (˜ 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici CELLULARE DIFFERENZIAMENTO A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA Regolazionedell espressionegenica neglieucario, Controllodell espressionegenica: 1.Controllotrascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b)FATTORITRASCRIZIONALI:legamedifaJoriproteiciasequenze nucleo,dichediregolazione(AFvatorierepressori) 3 21/04/17 a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina 20/04/17 Trascrizione 19 EPIGENETICA: Acetilazione e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA. Si tratta di modifiche della cromatina che non comportano cambiamenti nella sequenza di basi del DNA. Acetilazione degli istoni e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA modificano la struttura della cromatina e possono REGOLARE L ESPRESSIONE DEI GENI MEDIANTE: MECCANISMI EPIGENETICI GENE: Ogni regione del DNA capace di sintetizzare una molecola funzionale di RNA. 20/04/17 Regolazionedell espressionegenica neglieucario, Controllodell espressionegenica: 1.Controllotrascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b)FATTORITRASCRIZIONALI:legamedifaJori proteiciasequenzenucleo,dichediregolazione (AFvatorierepressori) • b. FATTORI TRASCRIZIONALI • PROTEINE CHE RICONOSCONO E LEGANO SPECIFICHE SEQUENZE ALL INTERNO DI UN PROMOTORE: 20 • Una serie di fattori di trascrizione deve legarsi al promotore prima che la RNA polimerasi vi si possa legare e trascrivere quindi, a livello basale, il gene. L’efficienza della trascrizione dipende anche dal legame di proteine di regolazione, attivatrici e, in alcuni casi di repressione, al promotore. Altre sequenze di DNA, spesso molto distanti dal promotore, sono ulteriormente implicate nella regolazione, aumentandola (enhancer) o reprimendola (silencer). - FATTORI TRASCRIZIONALI BASALI sono indispensabili per l inizio della trascrizione, aiutano la RNA polimerasi a riconoscere il promotore - ATTIVATORI TRASCRIZIONALI aumentano l efficienza di trascrizione -100 GC box - REPRESSONI TRASCRIZIONALI diminuiscono l efficienza di trascrizione 20/04/17 Fa5oritrascrizionali Elementi distali 23 20/04/17 -80 CAAT box -25 TATA box Elementi prossimali Fa5oritrascrizionali Promotore basale 24 4 21/04/17 REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE: FATTORI TRSCRIZIONALI ENHANCER - SILENCER LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI (FATTORI DI TRASCRIZIONE) A SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE. Una sequenza enhancer classica contiene al suo interno parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione regolativo (attivatore). Spesso i siti di legame possono essere gli stessi presenti nelle sequenze prossimali. I FATTORI PROTEICI IMPEGNATI A REGOLARE L ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA DEL GENE (IN CIS) I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado di ridurre l efficienza di trascrizione (repressori). 20/04/17 Fa5oritrascrizionali 25 20/04/17 Fa5oritrascrizionali 26 FATTORI TRASCRIZIONALI Regolazione trascrizionale in risposta ad ormoni lipofili# In assenza di stimolo il recettore è inattivato mediante il legame con una proteina di inibizione (HSP90) 20/04/17 Fa5oritrascrizionali 29 5 21/04/17 I DUE PRINCIPALI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE (MECCANISMI EPIGENETICI E FATTORI TRASCRIZIONALI) SPESSO AGISCONO INSIEME. 20/04/17 Fa5oritrascrizionali Repressori e attivatori, grazie a co-attivatori/corepressori, dirigono quindi la deacetilazione/ acetilazione degli istoni a livello di specifici geni 31 20/04/17 Fa5oritrascrizionali 32 Regolazionedell espressionegenicaneglieucario, Regolazionedell’espressionegenicanegli eucario, Splicing alternativo Controllodell espressionegenica: 2.Controllopost-trascrizionale: • SPLICING ALTERNATIVO • STABILITÀ DELL mRNA (miRNA, siRNA) La stabilità dell’mRNA citoplasmatico è variabile! 6 21/04/17 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006was awardedjointlytoAndrewZ.FireandCraigC.Mello "fortheirdiscoveryofRNAinterference-genesilencing bydouble-strandedRNA" h5p://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006wasawardedjointlytoAndrewZ.Fire andCraigC.Mello"fortheirdiscoveryofRNAinterference-genesilencingbydoublestrandedRNA" h5p://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ 7 21/04/17 pri-miRNA pre-miRNA miRNA 1.Complementarità imperfetta • I miRNA bloccano l espressione dei loro geni target a livello traduzionale • Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR),per le quali presentano omologia 2.Complementarità perfetta • I miRNA che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto: STABILITA DELL mRNA Target, attivano la degradazione dell mRNA • In questo caso i miRNA trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante 8 21/04/17 siRNA • I siRNA agiscono principalmente determinando la degradazione dello specifico mRNA bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(RNAi) • Molecole di siRNA si producono a partire da RNA normalmente estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni. • RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma Modello per la biogenesi e l’attività di miRNA e siRNA • siRNA agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni siRNA può avere un unico mRNA bersaglio e modulare la stabilità dell mRNA • Diversamente, i miRNA costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione • Ogni miRNA,per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mRNA bersaglio MiRNAsfilogene,camenteconserva, 9 21/04/17 MiRNA CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI miRNA CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI: marcatori diagnostici • • • • OMEOSTASIDELFERRONELLACELLULA:regolazione post-trascrizionale Il ferro e’ un nutriente essenziale La cellula lo usa per: citocromi, emoglobina e molti enzimi. Il ferro in eccesso e’ causa di formazione di radicali liberi. Quindi la concentrazione di ferro deve essere controllata accuratamente. Ferri,na:LegailFerroeloconserva ReceJoredellaTransferrina(TFR): trasportailferronellacellula AML:acutemyeloidleukemia DLBCL:diffuselargeB-celllymphoma 10 21/04/17 Regolazione di proteine trasportatrici/ immagazzinamento del ferro Transferrin receptor (ingresso) Sangue! Fe 2+! Ferritin (Stoccaggio)! OMEOSTASIDELFERRONELLACELLULA:regolazione post-trascrizionale Sono state evidenziate numerose sequenze di regolazione all interno delle sequenze non tradotte (5 e 3 UTR). Esistono proteine che legandosi a specifiche sequenze di RNA controllano l espressione genica a livello traduzionale 5’UTR Fe 3+! Transferrin (trasporto)! Elemento IRE • Quando il ferro e’ in eccesso la cellula deve ridurre il numero di molecole di recettore e aumentare quello della ferritina.! • La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione, cosi la risposta e’ piu’ rapida 3’UTR La velocità di degradazione di alcuni mRNA eucariotici è regolata Regolazione Ferro-dipendente della stabilità dell’mRNA del recettore della transferrina +Fe -Fe Una proteina in grado di legarsi alle sequenze IRE (IRE-BP) regola la produzione del recettore della transferrina. Essa in presenza di basse concentrazioni di ferro si lega agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nella regione non tradotta al 3 (3 UTR), impedendo la degradazione dell mRNA. La traduzione di mRNAs è regolata da specifiche RNA-binding proteins! Regolazione Fe-dipendente della traduzione dell’mRNA della ferritina! ! Controllodell espressionegenica: 3.Controllotraduzionale +Fe -Fe La proteina che si lega alle sequenze IRE (IRE-BP) inibisce la produzione della catena pesante della ferritina legandosi agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nelle regioni non tradotte al 5 (5 UTR). 11 21/04/17 Controllodell espressionegenica: 4.Controllopost-traduzionale: • Concentrazionedellaproteina • ProteinaaFvaoinaFva Modificazionideisingoliaa • Fosforilazione gruppiossidrilicidiSer,ThreTyr • Carbossilazione gruppicarbossilicipossonoessereaggiun,a AspeGlu(es.protrombina) • Me,lazione • gruppime,licipossonoessereaggiun,aLys eGlu(es.istoni) • Ace,lazione(es.istoni) • ProteinaaFvaoinaFva Esistono molteplici livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti NUCLEO Genoma controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi responsivi di geni inducibili Meccanismi epigenetici: controllo a lungo e corto raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina Trascritto primario (precursore) controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, mRNA CITOPLASMA controllo traduzionale traduzione controllo del trasporto mRNA controllo della stabilità degradazione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva 12
