Diapositiva 1

BIOTECNOLOGIE ANIMALI
APPLICAZIONI
Mutazioni
Gene dell’ipertrofia muscolare (doppia
coscia) nei bovini da carne
Mutazione puntiforme  gene che determina l’ipertrofia muscolare nei
bovini, carattere noto come doppia coscia.
Si manifesta in diverse razze bovine: la razza nella quale è stato studiato in
maniera più approfondita e da più lungo tempo è la Blu Belga; tra le
razze italiane esso è presente nella razza Piemontese e anche in quella
Marchigiana.
A livello fenotipico, gli animali con il carattere doppia coscia, presentano:
a) una ipertrofia muscolare generalizzata di circa il 20%, ma localizzata in
prevalenza nel treno posteriore, mentre tutti gli altri organi sono di
dimensioni ridotte;
b) tessuto muscolare con contenuto adiposo ridotto sino al 40% ed anche
minore contenuto di tessuto connettivo, caratteri entrambi apprezzati
dal consumatore;
c) indice di conversione alimentare inferiore del 9% rispetto alla norma;
d) aumento delle distocie (+15%) a causa del maggiore peso alla nascita
ed alla conformazione dei vitelli.
Locus responsabile del carattere della doppia coscia:
identificato a livello genomico nel gene della miostatina (GDF8)
enzima che esercita una funzione di regolazione negativa sullo
sviluppo delle masse muscolari e che nel bovino è localizzato sul
cromosoma 2.
Negli animali portatori, la miostatina non svolge bene la sua azione di
“contenimento” dello sviluppo delle masse muscolari
Un aspetto interessante di questo gene è che le variazioni genetiche
che hanno causato la formazione dell’allele responsabile dell’ipertrofia
muscolare non sono le stesse nelle differenti razze.
Razza Piemontese: l’allele che determina il carattere doppia coscia è
dato dalla mutazione alla posizione 938 del terzo esone, con una
sostituzione di una Guanina con una Adenina: tale sostituzione causa
nella proteina una sostituzione alla posizione 313 di un AA tirosina con
un AA cisteina, con susseguente inattivazione della funzionalità della
proteina e quindi comparsa dell’ipertrofia muscolare.
Razza Blu Belga: esiste una delezione di una sequenza di 11 basi (819829) nel terzo esone del gene della miostatina che determina una
prematura interruzione nella fase di traduzione.
Razza Marchigiana: individui ipertrofici mostrano una transversione
Guanina – Timina in posizione 874, con conseguente cambiamento di un
codone che codificava l’acido glutammico in un codone di stop della
traduzione. Mutazione fa si che parte della proteina ricca in cisteina (6
aa), non venga tradotta con conseguente perdita dell’attività della
proteina stessa.
Marchigiana
Blu Belga
Piemontese
Un’applicazione importante in campo zootecnico degli RFLPs
riguarda l’individuazione del polimorfismo al locus della k-caseina
(k-cn) nella specie bovina.
• Le varianti genetiche più diffuse di questa caseina sono due: A e B.
• La variante B conferisce al latte una superiore attitudine alla
caseificazione.
• Dal latte prodotto da vacche omozigoti BB si ottiene, rispetto a quello
prodotto da vacche AA, una resa in Parmigiano Reggiano superiore
del 10%.
• Pertanto, ai fini del miglioramento genetico delle caratteristiche
qualitative del latte destinato alla caseificazione si dovrebbe mirare
all’aumento della frequenza dell’allele B della k-cn.
Elettroforesi del latte  genotipo al locus k-cn  femmine
Inconveniente superato  tecnica degli RFLPs.
La sequenza di DNA che codifica per l’allele A della k-cn presenta un
sito di taglio per l’endonucleasi PstI, mentre quella che codifica per
l’allele B ne è priva.
Bovino omozigote BB con l’enzima PstI e poi evidenziamo la regione
del genoma che contiene il gene della k-caseina, otterremo un
tracciato con un frammento di DNA lungo 4600 coppie di basi (4.6 kb).
Se invece digeriamo il DNA di un bovino omozigote AA, poiché in
questo è presente il sito di taglio per PstI, otterremo due frammenti,
uno di 4.3 kb ed uno di 0.3 kb, originatisi dal taglio del frammento di
4.6 ad opera dell’enzima PstI.
L’eterozigote AB li avrà tutti e tre.
K-caseina
BIOTECNOLOGIE ANIMALI
APPLICAZIONI
Aberrazioni
Polimorfismo della caseina alfa s1 nei caprini
Inserzione e/o delezione:
polimorfismo al locus della caseina alfa
s1 (as1-cn) nella specie caprina
Latte caprino  elettroforesi  7
diversi alleli (caseina alfa s1)
associate differenze
contenuto proteina
quantitative
Abbiamo infatti:
degli alleli forti (A, B e C) che sono associati ad un contenuto elevato
di caseina alfa-s1 nel latte (3,6 grammi litro);
una capra omozigote (AA o BB o CC) contenuto in caseina alfa s1 nel latte di circa 7,2
grammi litro
un allele intermedio (E), associato ad un contenuto intermedio di as1cn (1,6 g/l)
capra omozigote EE avrà 3,2 grammi/litro di as1-cn, mentre una eterozigote AE, ad
esempio, avrà 5,2 (3,6+1,6) grammi litro di as1-cn
due alleli deboli (F e D) associati ad un contenuto basso (0,6 g/l) di
as1-cn nel latte
un allele nullo (0) che non produce as1-cn nel latte
capre omozigoti 00 producono un latte privo di as1-cn
Varianti associate ad elevati contenuti di as1-cn abbiano una
frequenza elevata nelle razze rustiche
Presenza è abbastanza ridotta nelle razze specializzata ad elevato
livello produttivo, come la Saanen o l’Alpine, dove invece prevalgono
gli alleli associati a contenuti ridotto o intermedio
Le varianti A, B, C e D sono costituite da 199 aminoacidi
Si differenziano fra loro per delle sostituzioni aminoacidiche,
Alleli E ed F presentano una delezione di 11 e 37 aminoacidi
Mutazioni responsabili della riduzione di 37 aminoacidi nell’allele F è
dovuta ad una serie di mutazioni a livello dei siti che controllano il
congiungimento delle sequenze esoniche durante il meccanismo di
maturazione del mRNA.
Cellule del tessuto secernente della ghiandola mammaria di capre
omozigoti FF presentano diversi tipi di mRNA della as1-cn (almeno 9), la
maggior parte dei quali deriva da un meccanismo anomalo di maturazione
e sono prive di tre esoni (9, 10 e 11).
Delezione 11 aa (E)
Delezione 37 aa (F)
199 aminoacidi
Quantità di mRNA trascritto dall’allele F risulta circa 6 volte inferiore
a quella trascritta dall’allele A.
Anomalo processo di maturazione del mRNA  due inserzioni (di 11 e 3
coppie di basi) all’interno del nono introne e delezione di un singolo
nucleotide nell’esone 9.
Allele E  inserzione di un segmento di circa 500 coppie di basi
nell’esone 19, segmento che viene trascritto in mRNA e che determina
una riduzione del tasso di sintesi proteica.
Allele nullo  delezione di un segmento di 8000 coppie di basi
(probabilmente contiene gli ultimi 8 esoni) compromette totalmente la
funzionalità del gene
L’attuale utilizzo degli strumenti
molecolari in Italia per i bovini da latte
Cosa si fa attualmente con i marcatori molecolari?
1. Diagnosi di parentela
2. Varianti proteiche del latte
3. Caratteri recessivi
4. Fattore rosso
Diagnosi di parentela

Animali attualmente sottoposti alla diagnosi di parentela:

Tutti i tori avviati alla FA (test sul padre e sulla madre)

Tutti gli animali provenienti da ET

Vacche partecipanti a mostre nazionali

Stalle di nuova iscrizione (controllo a campione)
Diagnosi di parentela - metodica
1. Gruppi sanguigni: vengono analizzati, con questa
metodica, su richiesta, quegli animali i cui genitori non
hanno genotipo DNA depositato
2. MICROSATELLITI
Microsatelliti analizzati: BM1824, BM2113, ETH3,
ETH10, ETH225, INRA023, SPS115, TGLA227,
TGLA53, TGLA122, TGLA126, AGLA293, BM1818,
CYP21, INRA005, MGTG4B, SPS113, TGLA53, TGLA57
International Panel of Microsatellites for Cattle
Parentage Testing (ISAG Panel)
Varianti proteiche del latte
1. Esistono diversi tipi di proteine del latte:
K-caseine
β-lattoglobulina
2. Vantaggi nella caseificazione
3. K-caseine: esistono due varianti alleliche principali A e B
4. Le ricerche hanno dimostrato che la variante B è la +
favorevole
Varianti proteiche del latte
1. Considerato il fatto che l’80% del latte prodotto in
Italia è destinato alla produzione di formaggio, può
essere importante x l’allevatore conoscere il genotipo
degli animali che sta usando
2. La frequenza allelica dipende dalla razza
•
Frisona
•
Bruna
Varianti proteiche del latte
1. L’ANAFI esegue il test su tutti i tori avviati alla FA e
su tutte le vacche rank 98 (miglior 2 %)
Frequenza allelica ?
Varianti proteiche del latte
•
vacche rank 98 (miglior 2 %)
Varianti proteiche del latte
•
tori avviati alla FA
Varianti proteiche del latte
•
Rapporto tra EBV medi tori FA e genotipo per le Kcaseine
Varianti proteiche del latte

Razza BRUNA
3x > razza Frisona
Caratteri recessivi
1985 - Blup – Animal model
Italian Holstein Inbreeding trend
1990 - 2000
inbreeding (% )
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1990 1991
1992 1993
1994 1995 1996
1997 1998
1999 2000
birth year
BLAD
Mulefoot
CVM
Caratteri recessivi:
Complex Vertebral Malformation
Caratteri recessivi:
Razza Frisona:
BLAD ( Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency )
DUMPS (Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase )
CVM ( Complex Vertebral Malformation )
MULE FOOT
CITRULLINEMIA
Razza Bruna:
WEAVER o PDME (Progressive Degenerative Myeloencephalopathy )
SMA( Spinal Muscular Atrophy )
Caratteri recessivi: BLAD
•
compromette la sintesi di alcune proteine di membrana dei
leucociti, che risultano cosi incapaci di assolvere il proprio ruolo
nel contrasto delle infezioni
•
Candidate gene approach (Uomo):
•
gene CD18
• 2 mutazioni puntiformi
1.
Sostituzione dell’acido aspartico
nell’aminoacido 128 (allele D128G)
2. Mutazione silente
con
la
glicina
Caratteri recessivi: BLAD
I leucociti non
sono quindi in
grado di
aderire alle
pareti venose
prossime
all’aerea colpita
Caratteri recessivi: BLAD
L’enzima di restrizione TaqI
riconosce la sequenza tcga e
“taglia” la sequenza tra i
nucleotidi T e C
Caratteri recessivi: BLAD
Gel di Agarosio (BLAD PCR con TaqI)
Caratteri recessivi: BLAD
Frequenza portatori :
•
US Holstein: 15 % dei tori di FA, 8 % delle vacche
•
Italia: 8 % dei tori di FA
La comparsa di questa anomalia può essere ricondotta ad
un toro nato nel 1952 : Osborndale Ivanhoe.
Uno dei suoi discendenti portatori (Carlin-M Ivanhoe
Bell) è stato uno dei tori + utilizzati nel mondo !
Bovine Leucocytes Adhesion Deficiency
BLAD
Caratteri recessivi: CVM
• Identificata in Danimarca nel 2000 (Agerholm, J.S.,
Bendixen, C., Andersen, O., Arnbjerg, J., 2001. Complex
vertebral malformation in Holstein calves. J. Vet. Diagn. Invest.
13, 283–289.)
• Il feto omozigote recessivo viene abortito o
soccombe precocemente a causa di gravissime
anomalie nello sviluppo della colonna vertebrale ed un
ridotto sviluppo corporeo (nanismo).
• Carlin-M Ivanhoe Bell !
Caratteri recessivi: CVM
•
Doppio danno economico:
1. Perdita del vitello
2. Problemi riproduttivi nella madre con eventuale
eliminazione per riduzione della produzione –
[Nilesen et al. Livestock Production Science 79
(2003) 233–238 ]
Caratteri recessivi: CVM
•
Linee di azione:
1. Identificare ed eliminare i portatori?
2. Identificare e segnalare i portatori?
•
Kuhn et al. (J. Anim Sci. Vol. 88, Suppl. 1: T39)
1. Non si evidenziano differenze produttive tra vacche
portatrici e non
2. Eliminare l’allele non dovrebbe avere conseguenze
negativi sui livelli produttivi
Caratteri recessivi: CVM
•
ANAFI Linea “morbida”:
1.
Tori già in FA: Testati ed identificati tutti i soggetti che
presentano un ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell
2. Tori avviati alla FA: Testati tutti i soggetti che presentano
un ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell. Se portatori
non possono essere adibiti alla F.A.
3. Possibilità di utilizzare un filtro nel Software Programma di
Accoppiamento
Caratteri recessivi: CVM
PAC e CVM
Caratteri recessivi: identificazione
l’approccio utilizzato per il CVM viene utilizzato anche nel
caso degli altri caratteri:
Si testano tutti i tori con un portatore tra gli ascendenti.
Se portatore e avviato alle prove di progenie, non
autorizzato alla FA
portatore
non portatore
– CVM
CV
TV
– SINDATTILISMO EREDITARIO
o PIEDE DI MULO o MULE-FOOT
MF
TM
– BLAD
BL
TL
– ACONDROPLASIA (BULL-DOG)
BD
BT
Fattore rosso
OLMO PREL.TUGOLO
MF TL G.M.**
melanociti
Eumelanina (nera)
Feomelanina (rossa)
AL.PAR. F. SAFETY RED
ET TV TL
Fattore rosso
OLMO PREL.TUGOLO
MF TL G.M.**
AL.PAR. F. SAFETY RED
ET TV TL
2 locus coinvolti:
• Extension: codifica per recettore
melanocortico 1 (MSHR o MC1R)
• Agouti
Fattore rosso
Nero
OLMO PREL.TUGOLO
MF TL G.M.**
AL.PAR. F. SAFETY RED
ET TV TL
2 locus coinvolti:
• Una mutazione (delezione)
puntiforme altera la
funzione del MC1R
Rosso
Fattore rosso
OLMO PREL.TUGOLO
MF TL G.M.**
POSAL CORKY ROYALIST
TV TL RF
AL.PAR. F. SAFETY RED
ET TV TL
Anomalie:
BC = animali rossi ma eterozigoti
Black-red (Telstar Red)
Cosa spinge un allevatore ad utilizzare un “Rosso” ?
Fattore rosso
Fattore rosso marcatore associato alla produzione?
Differenze non significative