Classe 4: liasi

Classe 4: liasi
ƒ
ƒ
ƒ
1) AH2+B Æ A+BH2
ossidoreduttasi (trasf. Di H+e-)
2) A+BC Æ AB+C tranferasi (trasf. Di gruppi)
3) AB+H2O Æ A+B idrolasi (legami:scissione rev idrolitica)
ƒ
ƒ
ƒ
LIASI(enzimi di 4° classe)
4) ABÆA+B
La reazione liasica consiste nella formazione e scissione di un
legame in modo che la molecola del substrato si risolve in due
componenti.
Reaz. reversibili :l’eq è dato dall’attività dei componenti e quindi
dall’utilizzo dei componenti verso vie metaboliche particolari.
ƒ
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1
4. LIASI: coenzimi
ƒ
ƒ
Solo alcune liasi sono proteine coniugate con
coenzimi di derivazione vitaminica
Nel dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione
di liasi specifiche che contengono come coenzima:
ƒ TPP (derivato dalla VITAMINA B1): -C-C- liasi
specifiche che agiscono sugli α−chetoacidi
promuovendo la decarbossilazione
ƒ PALP (derivato dalla VITAMINA B6 ): liasi
specifiche che agiscono sugli aminoacidi
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2
Sottoclasse: tipo di legame interessato
(che viene scisso o formato).
ƒ -C-C- CARBONIO-CARBONIO LIASI
ƒ -C-N- CARBONIO-AZOTO LIASI
ƒ -C-S- CARBONIO-ZOLFO LIASI
ƒ -C-O- CARBONIO OSSIGENO LIASI
ƒ SOTTOSOTTOCLASSE: riguarda la categoria di
ƒ
substrati interessati dal meccanismo liasico.
Nelle liasi alcuni E hanno CoE e richiedono la presenza
di cofattori , altri sono solo Me proteine (Me di
transizione) , altri ancora non hanno gruppo prostetico
ma una concentrazione di R aa nel sito attivo che ne
fa un centro di catalisi.
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3
LIASI –C-C- vit B1 (TPP)
dipendenti
NH2
N
H3C
CH3
N
N
+
Cl
O
S
OH
P
O
OH
Transizioni del
coenzima
durante la catalisi
ƒ
ƒ
TPP
O
P
OH
OH
CH3
+
CH3
+
N
N
S
S
Le –C-C- liasi hanno la vit.B1 (tiaminopirofosfato trasf.) come gruppo
prostetico.
Anche qui la catalisi è centrata sull’equilibrio dell’anello tiazolico tra 1 forma
in cui 2’ è sede di struttura carbanionica o una in cui 2’ si impegna con
doppio legame verso il substrato.
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4
Effetto catalitico liasi TPP
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Hanno effetto decarbossilante
SUBSTRATI: α−chetoacidi
Decarbossilazioni
1) Riduttive
HO
C
ƒ
2) Ossidative
HO
C
O
H
C
O
C O
C O
CH3
CH3
O
C O
L’ α-chetoacido
Æ aldeide. Il C
carbanionico è
modificabile.
Il C carbonilico
passa da n° +2 a
+1.
+ CO2
C
+ CoASH
O
C O
CH3
CH3
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S
CoA
+ CO2
Il C carbonilico
passa da n° +2 a
+3 (ac.
PiruvicoÆac
acetico). L’acido
non è libero ma
veicolato dal suo
vettore CoA
(trasferasi).
AcetilCoA
5
Dettagli meccanismo catalitico
CH3
HO
C
HO
+
O
C
N
HO
S
δ+C O
HO
C
HO
O
C
+
N
C
S
CH3
CH3
CH3
O
CH3
+ COOH
+
N
CH3
+
N
S
HO
C
S
CH3
CH3
Il sito attivo delle liasi acetta la posizione C1-C2 degli α-chetoacidi. I legami C=O del carbossile sono
polarizzati e la δ+ sul C facilita L’ATTIVITà DEL CARBANIONEÆSI FORMA IL LAGAME COVALENTEÆIL
N°OSS +2Æ+1. PRIMO COMPOSTO CoE-SUBSTRATO STABILE.
- effetto catalitico: (lattimicaÆlattamica) ÆMe cofattori :trasportano e- tra parte piridinica e tiazolica.
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Meccanismo catalitico
ƒ
ƒ
Gli elettroni che partecipano al nuovo legame sono quelli del legame
Cα-C1 che si scinde. Il C1 è struttura carbocationica neutralizzata
dall’OH. -la CO2 si libera sempre sottoforma di bicarbonato.
Il riequilibrio del nucleo piridinico verso la forma aromatoide fa si
che si trasportano e- in senso inversoÆsi forma un’aldeide attiva in
forma carbanionica.
CH
OHHO
C
HO
O
C
CH3
CH3
+
N
HO
H+
HO
C
S
HO
Decarbossilazione
riduttiva
O
C
C
H
CH3
HO
+
N
C
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+
N
S
CH3
+
H
HO
Aldeide idrata
3
CH3
S
CH3
O
C
CH3
OH
N
-
S
7
Decarbossilazioni riduttive
ƒ Queste α-chetoacidodecarbossilasi sono
ƒ
presenti in tutte la cellule ma maggiormente
nelle cellule procariote anaerobie; l’ αchetoacido più abbondante è l’acido piruvico.
Queste –C-C- liasi che danno decarbossilazioni
riduttive sono distribuite generalmente nelle
frazioni che nei peptidi sono definite
ialoplasmatiche o del citoplasma solubile cioè la
parte che non sedimenta anche a 100000x g.
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Decarbossilazioni ossidative
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Le decarbossilazioni ossidative interessano le membrane cellulari:
nelle procariotiche sulla membrana plasmatica
nelle eucariotiche sono nelle membrane interne del mitocondrio.
Troviamo tre tipi di unità enzimatica che si organizzanoÆstrutt 4° e
poi sopramolecolari.
1
Est.
1.
2.
3.
2
3
LIASI
TRANSFERASI
OSSIDOREDUTTASI
Int.
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9
Descrizione unità 1,2,3
ƒ
ƒ
ƒ
1° tipo, unità decarbossilanti: LIASI stessa organizzazione delle
proteine della decarbossilazione riduttiva (TPP DIPENDENTI) ma hanno
ampi domini idrofobici Æ agiscono solo associati a materiale fosfolipidico
(solo se inserite su membrana). Non sono transmembrana ma sporgono suilla
faccia esterna della membrana interna mitocondriale.
2° tipo: TRANSFERASI: sono transmembrana, sono soggetti a
cambiamenti di conformazione e delimitano una sorta di ampio canale che li
attraversa (carrier ma si compongono come enzimi di classe 2 Æ
transferasi). Hanno due coenzimi : uno legato in modo covalente (acido
lipoico) e uno attraverso legami salini reversibili : Coenzima A
3° tipo: OSSIDORIDUTTASI: enzimi di classe uno ossidoriduttasi con
coenzima FAD (flavoproteina) minore distrubuzione di amino acidi
idrofobici. Sporgono nella faccia interna della membrana interna
mitocondriale.
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Organizzazione sistemi
decarbossilanti
ƒ
ƒ
ƒ
I sistemi decarbossilanti non esistono solo in forma protomerica ma
danno una struttura quaternaria che arriva a circa 50 protomeri con
organizzazione cristallina.
Dentro questa sono organizzate le subunità transferasiche che sono
in numero minore, attraverso la membrana ed hanno contatti tra
loro (effetti di cooperazione), il loro numero va da 3\4 a 1\2 di
quelle liasiche.
Nella grossa distribuzione superficiali dell’unità liasiche vediamo
sporgere le unità transferasiche che dentro il plasmalemma
interagiscono con contatti idrofobici. Sull’altra faccia della
membrana vicino alle subunità di tipo 2 che protrudono all’interno si
hanno le subunità ossidoriduttasiche che sono 1\2 o 1\4 di quelle
liasiche (in distribuzione geometrica definita).
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Struttura sovramolecolare
ƒ Æ Liasi : catturano e scindono gli alfa
chetoacidi
ƒ Æ Transferasi : trasportano l’acile
ƒ Æ Ossidoriduttasi : sistema che riporta la
seconda subunità alle condizioini
originarie.
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1° passaggio
HO
C
δ +C
O
N
+
HO
C
S
O
HO
O
HO
+
N
C
C
S
CH3
CH3
piruvato
+ COOH
HO
C
CH 3
N
S
C
+
N
S
CH3
ƒ
+
HO
O
ƒ
ƒ
attacco nucleofilo delle
subunità
liasiche/decarbossilazione
Piruvato deidrogenasi
(organizzazione
sovramolecolare)
Alfa cheto glutarato
deidrogenasi (ciclo di Krebbs)
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2° passaggio (i)
HO
C
HO
HO
O
C
C
+
N
HO
S
O
C
CH3
CH3
O
S
C
NH
+
N
Lys- Enzi
S
S
O
C
NH
Lys- Enz
HS
S
ƒ
ƒ
Formazione di aldeide carbanionica per riequilibrio delle forme di risonanza:
si realizza una prima reazione transferasica per attacco nucleofilo dal
carbanione sul ponte disolfuro del CoE: ACIDO LIPOICO, acido carbossilico
a 8 C con una ciclizzazione per formazione di un ponte disolfuro.
Il ponte disolfuro viene scisso e si realizza un legame covalente tra lo zolfo
e quella che era la struttura aldeidica con numero ossidazione “+1”, questa
reazione redox fa transire il C che ha dato il legame da +1 a +2 : ritorno
alle condizioni che esistono nel chetone
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2° passaggio (ii)
HO
Mn
HO
C
O
C
N
C
CH3
HO
+
S
S
HO
O
C
O
+
C
CH3
NH
Lys- Enz
ƒ
S
S
O
C
NH
Lys- Enz
HS
HS
ƒ
+
N
Il cambiamento di conformazione che segue orienta un R amino acidico del
sito attivo dalla transferasi (nucleo imidazolico di istidina) verso il primo
tipo di subunità. Il Mn prostetico della subunità 1 (decarbossilante)
riconosce l’OH e destabilizza il legame –C-C- adiacente (scissione
eterolitica)
Si ottiene il doppio legame O=C con la dissociazione di un protone. Il
numero di ox. è passato da +2 a +3 (carbossile mascherato nella struttura
tioesterea).
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2° passaggio (iii)
O
C
H3C
O
S
C
NH
Lys- Enz
HS
CoASH
ƒ
ƒ
ƒ
Abbiamo avuto la decarbossilazione ossidativa e l’unità a 2 C abbandona
l’unità di primo tipo per trasferirsi sulla subunità transferasica. La subunità
transferasica ora contiene acil-lipoato.
Æ Acil lipoato : nella subunità secondaria si realizza un cambiamento di
conformazione
La struttura con l’acil lipoato cambia nel canale l’orientamento spaziale
(passa ad uno orientamento verso l’interno) la Kd dell’enzima per il CoA
diviene molto bassa : l’enzima è in grado di catturare il CoA libero
nell’ambiente interno.
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2° passaggio (iv)
O
Mn
ƒ
C+
H3C
O
S
C
Lys- Enz
NH
HS
ƒ
CoASH
O
HS
C
NH
Lys- Enz
HS
CoA S
C
O
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CH3
Nella porzione più
interna la subunità 2
porta l’atomo di
manganese che fa da
destabilizzante per il
legame C-S.
L’effetto è lo
scatenarsi del
meccanismo
transferasico, in
pratica sotto
l’effetto del metallo
di transizione l’acile
si sposta dal
solfidrile che occupa
nell’acido lipoico al
solfidrile del CoA che
in questo momento si
trova molto vicino
nello spazio Æ si
forma acil CoA.
17
2° passaggio (v)
O
HS
C
NH
Lys- Enz
HS
CoA S
C
CH3
O
ƒ
ƒ
La partecipazione del metallo a questo meccanismo di trasferimento fa si
che l’enzima subisca una modifica : aumenta di un fattore 104 a 106 la Kd
della dissociazione apoproteina-CoA.
L’acetil CoA dissocia sul lato interno della membrana (per cui nella
membrana interna del mitocondrio) arriva sulla faccia esterna il piruvato ed
esce sulla faccia interna del mitocondrio il CoA. La seconda proteina non si è
comportata solo come transferasi ma anche come carrier portando un’unità
bicarboniosa dall’esterno verso l’interno.
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3° passaggio
O
FMN
FMNH2
ƒ
ƒ
S
C
NH
Lys- Enz
S
Acido lipoico Æ sempre orientato verso la faccia interna, a questo punto intervengono
gli enzimi del terzo gruppoÆ ossidoriduttasi FAD dipendenti.
FMN Æ FMNH2 i coenzimi flavinici si trovano vicini all’acido lipoico Æ lo riossidano
rigenerando il ponte disolfuro. La riossidazione scatena l’ultima trasformazione : fa
orientare ancora il braccio con coenzima verso la subunità liasica (verso la faccia
esterna della membrana interna). Nella membrana interna dei mitocondri ci sono
ossidoriduttasi NAD dipendenti ( non associate a particolari strutture) che
riossidano le tre subunità e le unità riducenti vengono trasferite sul coenzima
piridinico Æ questo tipo di decarbossilazione ossidativa si conclude con Æ acil CoA e
unità riducenti con coenzima piridinici ridotti. Anche NAD proteine rimettono nella
condizione di partenza i coenzimi flavinici della terza struttura che possono quindi
ripetere il ciclo
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LIASI PALP
ƒ
Le liasi con coenzima PALP intervengono nel metabolismo degli
aminoacidi.
1a reazione: aggancio del substrato al coenzima e formazione del
legame di base di Schiff
ƒ
Eliminazione virtuale di acqua
HOOC
H2C
OH
O P
O
CH2
CH
H2N
O
R
O Me
O P
OH
CH2-enzima
Base di Schiff
O P
OH
O
CH2
O Me
N
CH2-enzima
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CH2
O
HOOC
O Me
N
CH
R
CH2-enzima
CH
N
HC
OH
NH
HC
OH
OH
N
HOOC
OH
R
+
H
20
Liasi PALP
ƒ
ƒ
2) transizione alla forma chinoide
La catalisi è guidata dal metallo: la simmetria dei legami con i R del sito
attivo promuove interazioni con il Cα (nelle transferasi PALP era il C
sostituente in 4)
HOOC
O P
O
OH
N
HC
OH
CH2
O Me
N
H
C
R
HOOC
O P O
OH
CH2-enzima
CH2
O Me
N
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N
HC
OH
CHR
CH2-enzima
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Scissione C1-Cα: aminoacido
decarbossilasi (-C-C- liasi)
ƒ
ƒ
La simmetria dei legami del Me può dare inoltre legami con altre parti del
substrato.
Se la terza interazione del metallo si stabilisce con l’O legato al C1 si ha
scissione C1-Cα con decarbossilazione dell’aminoacido.
HOOC
HC
OH
O P O
OH
N
CH2
O Me
O
+
CH-
HO
HO
NH2
NH2
serinaÆ colamina + CO2
R
O
H2N
N
OH
CH2-enzima
OH
NH2
H2N
NH2
ornitinaÆ putrescina + CO2
O
H2N
OH
H2N
NH2
NH2
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lisinaÆcadaverina + CO2
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Interazione con il
sostituente in β
ƒ
HOOC
Si verifica per quegli aa che
hanno in β un sostituente
importante: es. cisteina e serina
O P O
OH
CH2
O Me
O
HO
N
HC
OH
N
CHRβ
C
CH2-enzima
OH
NH2
O
serina
H2 C
O
HS
O
OH
NH2
OH
Acido aminoacrilico
H3C
O
OH
NH
α-imminoacido
H3C
OH
O
Acido piruvico
NH2
cisteina
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Trasformazione serina a
glicina + -CH2OH
HOOC
O P
N
HC
OH
O
CH2
O Me
CHRβ
C
OH
O
HO
O
OH
H2N
N
OH
CH2-enzima
+ -CH2OH
NH2
Ser
ƒ
ƒ
Gly
Le interazioni con il Me sono dirette una verso l’N e due
verso il Cα.
Il risultato è la scissione tra Cα e Cβ e la produzione di
unità monocarboniosa che viene accettata da FH4 sotto
forma di metilene –CH2Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry
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Liasi metallo-dipendenti
H
.
H
C
CH2 .
.
Cu-Enzima
H
.
C
H
+
CH2 .
.
C
HO-Fe-Enzima
C
+
CH2 .
H2N-Cu-Enzima
H
.
CH2 .
NH2
Fe-Enzima
H
CH
H+
.
.
-C-O-C-S-C-N-
ƒIl metallo (es. il Fe) riconosce
C
OH
ƒ
ƒ
ƒ
C
CH
.
l’O dell’OH sostituente. Il Cu
riconosce l’N del gruppo NH2.
ƒIl passaggio da legame dativo a
covalente provoca una sottrazione
del sostituente mentre nel
substrato precedente resta una
carica +, ossia una struttura
carbocationica. Gli OH o NH2 sono
rilasciati dall’enzima come
prodotto di reazione. La struttura
si riassesta creando un doppio
legame e dissociando un protone.
Si forma una insaturazione. La
reazione è reversibile e quindi può
essere addizionato OH, SH, NH2
su posizioni insature che li
accettano come sostituenti.
H+
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