Lezione Dott.ssa Mainini

DNA BARCODING E BIODIVERSITÀ MOLECOLARE
DELLE ACCIUGHE DEL MEDITERRANEO
In collaborazione con il
Laboratorio di Neurobiologia dello Sviluppo
DISTAV
Prof.ssa Simona Candiani
Prof. Mario Pestarino
Dott.ssa Stefania Mainini
Prof.ssa Beatrice Zanini
E` un pesce osseo pelagico di piccole
dimensioni con testa allungata e ampie
aperture branchiali. Il dorso del corpo è
azzurro-verdastro quando è ancora viva
mentre ventralmente e lateralmente è
argentea.
E’ un pesce gregario che vive in mare formando
branchi. Durante le ore diurne le acciughe si
riuniscono in banchi che scendono verso gli strati
d'acqua più profondi, sia per trovare nutrimento
sia per sfuggire ai predatori.
Il genere Engraulis è ampiamente diffuso in tutti i mari.
Le specie che sono oggetto di pesca industriale sono le seguenti:
Engraulis anchoita – acciuga argentina (Atlantico Sud-Ovest)
Engraulis australis– acciuga australiana (Australia Sud-Ovest)
Engraulis capensis – acciuga sudafricana (Atlantico Sud-Est e Sud Africa ora chiamata E. encrasicolus)
Engraulis encrasicolus – acciuga europea (Atlantico Nord-Est,
Mediterraneo)
Engraulis japonicus – acciuga giapponese (Pacifico Nord-Ovest)
Engraulis mordax – acciuga californiana (Pacifico Nord-Est)
Engraulis ringens – acciuga peruviana (Pacifico Sud-Est)
Sono state ipotizzate numerosissime sottospecie o razze.
Esistono differenze fenotipiche tra le acciughe:
 
Atlantiche e del Mediterraneo
 
Mediterraneo occidentale e Adriatico
 
tra le popolazioni delle diverse coste italiane (3-6-2-5-4)
 
tra quelle dell'area del Golfo di Biscaglia e della Galizia (1-7)
Le differenze morfologiche sarebbero da attribuire allo sfasamento della stagione riproduttiva, più
breve (marzo giugno) in Biscaglia, più estesa (marzo-ottobre) con picco in agosto in Galizia.
All’interno dell’Adriatico il genere Engraulis comprenderebbe almeno due popolazioni
geneticamente distinte e strettamente corrispondenti agli aspetti idrografici come la
profondità e l'idrologia, che comportando differenze di temperatura, possono portare a
variazioni nel tasso di crescita e nel raggiungimento della maturità sessuale.
l’acciuga europea è stata suddivisa in due
specie parapratiche (Borsa et al., 2004)
- Engraulis albidus presumibilmente vive nelle
acque salmastre costiere e risente dell’influenza
delle correnti dei fiumi nel Mediterraneo N-W e
nel Mar Adriatico
- Engraulis encrasicolus abita le acque
oceaniche della piattaforma continentale.
All’interno dell’Adriatico il genere Engraulis comprenderebbe almeno due popolazioni
geneticamente distinte e strettamente corrispondenti agli aspetti idrografici come la
profondità e l'idrologia, che comportando differenze di temperatura, possono portare a
variazioni nel tasso di crescita e nel raggiungimento della maturità sessuale.
l’acciuga europea è stata suddivisa in due
specie parapratiche (Borsa et al., 2004)
- Engraulis albidus presumibilmente vive nelle
acque salmastre costiere e risente dell’influenza
delle correnti dei fiumi nel Mediterraneo N-W e
nel Mar Adriatico
- Engraulis encrasicolus abita le acque
oceaniche della piattaforma continentale.
OBIETTIVO DEL LAVORO
 
 
 
 
Valutare la variabilità genetica del DNA nucleare dell’acciuga europea
caratterizzare le popolazioni europee di acciughe del Mediterraneo
analizzare la variabilità geografica delle popolazioni di Engraulis tra
l’Atlantico e il Mediterraneo e nell’ambito del bacino mediterraneo
Identificare nuovi marcatori genetici
Il genoma è l’insieme dei geni di un organismo vivente. I geni composti dal DNA,
sono localizzati nel nucleo di ogni cellula e costituiscono il codice grazie al
quale la cellula costruisce le proteine che assolvono alle varie funzioni
necessarie al nostro organismo.
  Il 99.9% del genoma è identico per tutti gli individui di una stessa specie,
mentre lo 0.1% è il solo responsabile delle variazioni e delle specificità, che
rendono unici i singoli individui.
  In particolare, ogni circa 1000 basi fisse del genoma esiste una possibile
variazione del materiale genico a carico di un unico nucleotide. L'elemento
mutato è detto “SNP” (single nucleotide polymorphism).
  Gli SNPs costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane.
Possono esistere variazioni notevoli tra popolazioni umane. Uno SNP molto comune
in un determinato gruppo etnico può dunque essere molto raro in un'altra popolazione.
Gli SNPs possono presentarsi:
  all'interno di una sequenza codificante di un gene
  all'interno di una regione intronica o
  in una regione intergenica.
Dal momento che gli SNPs sono perlopiù ereditati di generazione in generazione, vengono
utilizzati in studi genetici. Gli “SNPs” sono sempre ereditati in coppie, chiamate
“alleli” (una da parte della madre ed uno da parte del padre).
Enzimi di restrizione
Sono endonucleasi capaci di riconoscere e tagliare specifiche sequenze di DNA.
L'enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità (dette coesive o sticky
ends) a singolo filamento al 5'
SNPs o INDELs (inserzioni o delezioni) possono creare o abolire siti di restrizione
per gli enzimi di restrizione, generando frammenti di DNA di diversa lunghezza.
Se un allele
contiene un sito di
riconoscimento
p e r
u n
e n z i m a d i
restrizione ed un
altro no, la
digestione dei due
alleli genererà due
frammenti di
dimensione
differente.
Applicazioni
variazioni anche di singoli nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai
patogeni o ai farmaci. Per questo gli SNPs sono importanti nello sviluppo di nuovi farmaci e nella
diagnostica, in quanto consentono di conoscere l'effetto che può avere un farmaco su un individuo ancor
prima della somministrazione, attraverso uno screening degli SNPs presenti nel gene responsabile della
metabolizzazione del farmaco stesso.
RFLP
Un metodo utile per individuare gli SNPs è la valutazione dei cosiddetti restriction
fragment length polymorphisms (polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione, o
RFLP).
Gli RFLP sono usati in genetica come marcatori per l’identificazione e il confronto dei
geni grazie alle differenze nelle sequenze nucleotidiche che li compongono, dovuta a:
presenza di sequenze ripetute
inserzioni o
delezioni
METODICA: si estrae e si purifica il DNA da un campione. Il DNA viene quindi sezionato in frammenti di
restrizione mediante enzimi di restrizione detti endonucleasi che tagliano solo in corrispondenza di
particolari sequenze nucleotidiche, specifiche per ogni enzima. I frammenti di restrizione vengono
quindi separati per lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio. Successivamente attraverso la
tecnica di ibridazione Southern-Blot si identificano le bande con sonde marcate radioattivamente o
attraverso fluorocromi.
Le differenze tra i genotipi sono determinate dal numero di bande che compaiono utilizzando la stessa
sonda per l'ibridazione e che è a sua volta determinato dal numero di siti di taglio presenti nella
sequenza considerata.
La distanza tra le posizioni di taglio causate dagli enzimi di restrizione (i cosiddetti siti di restrizione) è
variabile tra un individuo e l'altro, dando quindi luogo a variazioni nella lunghezza dei frammenti. Ciò
si riflette in una diversa posizione di alcune bande sul gel, da cui il termine polimorfismo.
Al momento lo studio delle differenze della sequenza nucleotidica studiata mediante RFLP è
realizzato in modo più rapido mediante reazione a catena della polimerasi o PCR.
Gli RFLP sono marcatori a singolo locus, quindi marcatori co-dominanti (trasmissione
mendeliana). Permettono di distinguere:
i loci omozigoti rappresentati dallo dallo stesso pattern
i loci eterozigoti, rappresentati da bande diverse (entrambi gli alleli marcatori)
APPLICAZIONI
 
 
 
 
 
L'analisi delle variazioni di RFLP è stato uno strumento fondamentale nella
mappatura del genoma e nell'analisi delle malattie genetiche (ripetizione di
triplette all’interno del gene (Corea di Huntington)
per l'identificazione dei campioni recuperati da scene del crimine
( fingerprinting genetico)
nella determinazione della paternità
nella caratterizzazione della diversità genetica o di modelli di allevamento
nelle popolazioni animali
determinare le relazioni che intercorrono tra le varie specie
marcatore genetico
è una sequenza nota di DNA che può essere identificata mediante un semplice saggio.
Un marcatore genetico può essere costituito da una breve sequenza di DNA, come la
sequenza che circonda un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP o single nucleotide
polymorphism), o da una sequenza lunga, come i microsatelliti
con lo sviluppo della tecnologia per sequenziare il DNA, è diventato possibile studiare
l’evoluzione molecolare e definire relazioni evolutive fra specie, attraverso il confronto delle
loro sequenze geniche. Le sequenze geniche di organismi evolutivamente vicini hanno, in
genere, un alto grado di somiglianza, mentre le molecole di animali distanti dal punto di
vista evolutivo non si assomigliano molto.
se riuscissimo a trovare un gene la cui sequenza è significativamente diversa tra le varie
specie: tale sequenza costituirebbe un marcatore affidabile per permetterci di identificare
rapidamente le varie specie, partendo da un campione di DNA.
E’ proprio questa l’idea che sta alla base del codice a barre del DNA (così chiamato
perché è simile a quello utilizzato per distinguere i prodotti di un catalogo o i prodotti
commerciali in un supermercato).
In questo caso, l’obiettivo è quello di fornire un catalogo generale della diversità, di facile
accesso per chiunque voglia rapidamente ma accuratamente identificare un organismo.
Un tale catalogo consentirebbe anche di distinguere nuove specie, non ancora descritte, da
quelle già note e potrebbe costituire un valido strumento nel lavoro di conservazione della
biodiversità, nella diagnosi di patogeni, nel monitoraggio di specie invasive (quelle in grado
di colonizzare nuovi ambienti a scapito delle specie native) e in molti altri campi.
DNA barcoding
è una metodica che serve per l'identificazione di
identità biologiche, che si basa sull'analisi della
variabilità di un marcatore molecolare cioè di una
breve sequenza di DNA.
DNA BARCODING E TRACCIABILITA’ MOLECOLARE DELLE ACCIUGHE DEL
MEDITERRANEO
L'innovativa metodologia si è rivelata utile nell'ambito della sicurezza alimentare e in
particolare nel settore ittico, dove la frequente sostituzione di tranci o filetti di specie ittiche
pregiate con carni di esemplari di minor valore ha messo in luce la necessità di sviluppare
nuovi sistemi di tracciabilità molecolare.
Come è possibile discriminare fra popolazioni diverse di pesci?
La tecnica su cui il consorzio europeo sta puntando maggiormente è quella degli SNPs
perchè veloce ed economica.
Il test permetterà di distinguere fra differenti popolazioni di pesci, localizzate in diverse aree
geografiche, all’interno della stessa specie.
Materiali e Metodi
 
 
 
 
Sono stati raccolti e numerati 7 campioni di acciughe provenienti da:
Atlantico-Francia del Nord
Croazia
Mar Ligure/Tirreno
Pescara
San Benedetto del Tronto
Venezia/ S.Stino
Atlantico- Spagna
Preparazione del campione per l’estrazione di DNA
Estrazione del DNA con KIT QUIAGEN
Aggiungere 20 µl di proteinasi K, vortexare e lasciare in stufa a 55C° per 3 ore
Disegno dei primer
 
PCR (denaturazione di 2 min a 94 °C
denaturazione (35 s a 94 °C)
annealing (30 s at 53 °C)
extension (1 min at 70 °C)
extension di 7 min a 70 °C
Gel elettroforesi all'1,5%
 
Sequenziamento nucleotidico
 
Analisi dei dati
 
x35 cicli
Caratterizzazione del polimorfismo di lunghezza della regione intronica CK6-1
Sono stati disegnati i primer per amplificare con una PCR locus-specifica una regione
intronica polimorfica per lunghezza nel locus CK6-1 di una famiglia multigenica di creatinakinasi (Borsa et al., 2004).
CK6-1F (5’ - CGACATTGTAATGATGTTACAATGA- 3’)
CK6-1R (5’ - ATTTCCTTTGGGTTGGCTCTTCTCT- 3’)
I prodotti di PCR sono stati sequenziati per cercare la corrispondenza con gli alleli pubblicati
nell’articolo di Borsa e presenti nei database:
 
GenBank AY486347- E. encrasiculus isolate SET24.2 creatine kinase (CK6) gene 524 bp;
 
GenBank AY486346- E. albidus isolate CUL10.4 creatine kinase (CK6) gene 406 bp
RISULTATI
Misura del polimorfismo al locus CK6-1
Il locus CK6-1 mostra due alleli: un allele di 320 bp
un allele di 524 bp
Omozigote x l’allele da 320 bp:
Francia ATL (1), Pescara (4)
Omozigote x l’allele da 524 bp :
Croazia (2), San Benedetto del Tronto (5), Spagna Atlantica (7)
E. encrasicolus
Eterozigote per gli alleli da 320 e da 524 bp:
Mar Ligure (3) e Laguna di Venezia (6)
Il polimorfismo di lunghezza del locus CK6-1 è di tipo mendeliano, cioè presenta non
più di due bande di DNA in ogni campione
Sono tre gruppi di acciughe geneticamente distinte (2 omozigoti e 1 eterozigote)
Conclusioni
I campioni presi in esame e provenienti dalle stesse aree geografiche rispetto ai
campioni esaminati nel lavoro di Borsa (2008) concordano sull’allele di 524 bp.
Invece non è stato trovato in nessuno dei nostri campioni l’allele di 406 bp.
Il nuovo allele di 320 bp da noi identificato non è citato in letteratura. Potrebbe quindi
essere una nuova variante genetica della specie Engraulis.
A) In GENBANK:
l’allele di 524 bp.
Accession number: AY486347. Engraulis encrasicolus isolate
SET24.2 creatine kinase (CK6) gene 524 bp.
Le sequenze sono scritte con il doppio filamento di DNA.
524 bp
Sequenze di Borsa et al 2004
B) Accession number: AY486346. Engraulis albidus isolate CUL10.4 creatine kinase
(CK6) gene 406 bp
CK6F 5’-cgacattgtaatgatgttacaatga-3’
CK6R 5’-atttcctttggtttggctcttctct-3’
406 bp
Sequenze di Borsa et al 2004
Nel nostro lavoro abbiamo identificato l’allele da 524 bp – uguale a quello presente nel
database - e un nuovo allele da 320 bp. Di questi due alleli sono state lette le sequenze e
si è trovata una nuova delezione di 204 bp.
Clone 1 di 320 bp
Clone 7 di 524 bp
Allineamento delle sequenze
L’allineamento fra due (o più) sequenze consente di mettere in luce l’esistenza di similarità
nucleotidiche, che vengono «misurate» in base percentuale.
Permette di:
• identificazione di regioni conservate: sequenze di regolazione dell’espressione genica;
• attribuzione di una funzione e/o identificazione di un nuovo gene;
• classificazione dei geni in famiglie;
• studi di filogenesi molecolare, per ricostruire le relazioni evolutive fra le specie;
• studi di genetica di popolazione (migrazioni delle popolazioni umane, relazioni fra i vari
gruppi umani)
Allineamento tra
l’allele di 524 bp già
presente in banca dati
e il clone 7 di 524 bp.
Allineamento tra l’allele di 524 bp e il clone 1 di 320 bp
Allineamento totale tra le 4 sequenze: clone 1, clone 7, E.encrasicolus, E. albidus
CONCLUSIONI
 
Gli RFLP sono marcatori utilizzabili nel riconoscimento delle diverse
specie di acciuga
 
Sono una mezzo da poter usare per fare tracciabilità e la ricerca di
contraffazioni alimentari
 
Utilizzare l'allele 320 come possibile marcatore della specie, tra cui
quella del mar Ligure
BIOINFORMATICA
OBIETTIVI
•
•
•
•
Saper consultare banche dati di interesse biomedico.
Apprendere l’utilizzo di alcuni strumenti bioinformatici.
Saper correlare fra loro le sequenze.
Sapere confrontare genomi di organismi differenti.
1) Il sito da cui partire per la nostra navigazione tra i genomi di specie diverse è http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/
1) selezionare il formato FASTA
2) selezionare la sequenza in FASTA e trasferirla in un nuovo programma bioinformatico
chiamato Primer3
8) trasferire la sequenza copiata in un nuovo sito bioinformatico: Primer3
Inserire qui la sequenza FASTA
3) settare i parametri della ricerca dei primer:
Lunghezza dei primer
T di anneling
Range di dimensione dell'amplicone
4) cliccare pick primer e attendere l'esito della ricerca
ESEMPIO: costruzione di primer per la b-actina di pesce zebra Danio rerio
1) aprire il sito NCBI
2) inserire il nome del gene da ricercare e selezionare “nucleotide” nella barra di sinistra
3) selezionare la sequenza desiderata, deve essere un mRNA
4) prestare attenzione alle sequenze “predette”
5) aprire la sequenza selezionata cliccandola
6) cliccare il formato FASTA
7) selezionare la intera sequenza in formato FASTA
9) settare i parametri della ricerca dei primer:
Lunghezza dei primer
T di anneling
Range di dimensione dell'amplicone
10) cliccare pick primer e attendere l'esito della ricerca
GRAZIE PER L'ATTENZIONE