biosensori: ricerca, sviluppo e applicazioni in
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RT/ PAS18918 G. PALLESCHI, M. PiZZlCHNL A PLLOTON, O. CREMiSINL S. CHAVARIN BIOSENSORI: RICERCA, SVILUPPO E APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO, INDUSTRIALE E AMBIENTALE COMITATO NAZIONALE PER A RCERCA E PER LO SVI ) DELL*RIA NUCEAE E DELL L IERG ALTRNAP’JE ISSN/O39363O9 COMIThTO NAZIONALE PER LA RICERCA E PER LO SVILUPPO DELLENERGIA NUCLEARE E DELLE ENERGIE ALTERNATIVE BIOSENSORI: RICERCA, SVILUPPO E APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO, INDUSTRIALE E AMBIENTALE Il Università di Roma ENEA ENEA - - - G. PALLESCHI Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche M. PIZZICHINI, R. PILLOTON Dipartimento Tecnologie Intersettoriali di Base, Centro Ricerche Energia Casaccia C. CREMISINI, S. CHIAVARINI Dipartimento Protezione Ambientale e Salute dell’Uomo, Centro Ricerche Energia Casaccia Testo pervenuTo neiiane 1989 Progetto Enea: Studi sulla protezione dell’ambiente (EA) contu t tecnc se ti ‘oec.c ano opnont d g au o e no purt €ni d Enta ss e t ueN’ deN’en Riassunto La possibilità di coniugare l’elevata specificità di sistemi biologicamente attivi (enzimi, anticorpi, componenti di membrana, batteri, cellule, tessuti viventi animali o vegetali) con la sensibilità e praticità dei metodi elettrochimici di analisi (potenziometrici ed amperometrici), ha aperto alla ricerca un fertile campo di indagine e portato allo sviluppo di applicazioni di rilevante interesse sia teorico che applicativo industriale. Le stesse caratteristiche costruttive di un biosensore sono alla base della specificità del sistema e rendono possibile l’estensione a semplici sistemi in flusso continuo permettendo quindi il monitoraggio e l’automazione di apparecchiature biochimiche cliniche e di processi biotecnologici. in questa rassegna vengono illustrate alcune interessanti applicazioni in campo medico (determinazione di glucosio, urea, creatinina, proteine, ormoni, lattato, piruvato), industriale (unità sensibili per il controllo automatico in impianti di smaltimento di rei lui di caseificio, determinazione “on line” del glucosio prodotto dalla idrolisi del cellobiosio realizzata con un bioreattore cellulare) e nel settore agro-alimentare (determinazione di glucosio ,lattosio ed acido lattico nel latte, determinazione della lecitina in vari alImenti). Viene inoltre presentata una possibile applicazione (sistemi di analisi per pesticidi organofosI orici) nel settore dell’analisi di microinquinanti organici nell’ambiente con la possibilità di indicazioni di tipo tossicologico e di identificazione di indici di rischio”. la rassegna è corredata di una bibliografia “di base” per l’approfondimento dell’argomento proposto, - The possibility 01 coupling the high specificity 01 biologically active systems (enzymes, antibodies, membrane components, bacteria, cells, living animai and vegetal tissues) with the sensitivity and easiness or handling o! electrochemical..(potentiometric and amperometric) analytical methods, opened a fruitful investigation field to the research and carried to the development of interesting theoretical and applied-industrial applications.’ The structural features themselves are the base br the biosensor specificity, enabling their application to simple, continuous 1 10w systems, in the monitoring and automation or biochemical instrumentation or biotechnological processes. This report reviews some interesting applications in the medical (determination o! glucose, urea, creatinine, proteins, hormones, ‘lactate, piruvate), industrial (sensing units • dedlcated to the automatic control ot waste treatment plants in dairies, on line determination 01 glucoèe from the hydrolysis or cellobiose in a cellular bioreactor) and alimentary i ield (determination o! glucose and lactic acid in milk, dettrmination o! lecitine in food-stuff s). The report shows a possible application (analyticai systems Ior organophosphorous • pesticides) in the field or environmental analytical determination 01 organic micropollutants. The proposed biosensors could also give a broad toxicological information, useful to the delinitton o! a “risk index”. The report comprises a “basic” bibliography, a valuabie help I or a deeper insight in the topics treated herein. a 7. i pag. 3 1) introduzione 2) CaratterIstiche generali dei biosensori 4 3) immobilizzazione di ‘mediatori biochimici’ 11 3.1 immobiiizzazione di enzimi attranerso retzloni chimiche 14 3.1.1 Le reazioni di Immobilizzazione 14 3.2 Membrane poiimeriche 23 4) Rppiicazioni dei blosensori 25 4.1 .nieocotm 26 4.1.1 Determinazione di Glucosio ed Urea nei sangue 26 4.1.2 Determinazione della Creatinina è deiie Proteine 28 4.1.3 Determinaziòne di Ormoni 31 4.1.4 Determinazione di Giucosio, Lattato e Piruuato in pazienti diabetici 33 4.2 36 4.2.1 36 Smaitimento di retiui di caseiticio 4.2.2 Determinazione Non iine dei Glucosio prodotto daiia idrolisi dei ceilobiosio realizzata con un bioreattore ceiiuiare 43; ... 9 47 43 4.3.1 Determinozione cli Glucosio, L8ttosio ed Ficido Lattico nel latte 47 Conclusio 6) Bibliogrefia 66 L©©’ ra© [ J©©E1 Liì1 ©iL ©i©© i) JjROUZIONE Le possibilità di applicazione di mediatori biochimici accoppiati con sensori elettrochimici sono state da tempo Individuate e studiate. Negli ultimi anni le realizzazioni di sistemi funzionali ed effidabili si sono moltiplicate, purtuttauio ancora vastissimo sembra il campo dl indagine a disposizione. in questa rassegna vengono proposte alcune Interessanti applicazioni e presentate le aree di sviluppo più promettenti. Vengono inoltre accennate quelle che, a nostro avviso, potrebbero essere le possibilità di accoppiamento con altre tecniche analitiche per garantire, oltre alla accuratezza e sensibilità, anche una elevata specificità di questi sistemi. A 2) CARRUERIST1CHE GENERALI DEI B1OSENSORI Un biosensore può essere definito come raccoppiamento di un sistema biologicamente attivo immobilizzato, con un trasduttore di segnale che converte il segnale biochimico in uno analiticamente quantificablie e praticamente utilizzabile. Generalmente li materiale biologicamente attivo è rappresentato da un enzima, PIÙ enzimi, anticorpi, componenti di membrane, batteri, cellule, tessuti viventi animali o vegetali. Questi sistemi sono i responsabili del riconoscimento della specie che si vuoie misurare e quindi deiia specificitò dei sensore che si vuole assembiare. li segnaie-prodotto che scaturisce daiia interazione di questi sistemi bioiogicI con i’anaiita può essere un composto chimico ed allora li sensore sarò di tipo eiettrodico (eiettrodi, semiconduttori, ecc...). Se invece li segnaie è di tipo caiorlco li sensore sarò un termistore. Se li segnale è dl tipo luminoso si avrò un sensore ottico. Se infine il sistema genera onde sonore si utiiizzerò un sensore acustico. Questi sensori possono essere più o meno selettlvi per la specie generata dalia reazione biologica; tanto più li sensore sarò selettivo per la specie prodotta dai sistema biologico tanto più li biosensore sarò affidabile. i blosensori che oggi offrono le migliori garanzie di senslbllltò e seiettivitò sono queiii di tipo eiettrochimlco. (1-3) Questi sensori sono stati chiamati, In un recente Convegno tenutosi a Park Cito 1W negli USR, superprobes, proprio per indicare li nuovo tIpo di sensori che possono misurare con sensibliitò eievatisslme alcune specie chimiche di particoiare interesse nella comunitò scientifica biochimica e medica. i biosensori eiattrochimici stanno dunque avendo una larga appilcazione in campo medico, Industriale ed aumentare e sono i soii attuaimente ad essere stati utiiizzati per scopi pratici. Molte industrie dedicano parte della loro ricerca aiio sviluppo e appiicazione del blosensori eiettrochimici e glò sono stati messi in commercio da industrie americane, inglesi, francesi e giapponesi strumenti anaiitici che utilizzano biosensorl per ia determinazione del glucosio e dell’acido lattico. Questi biosensori sono generalmente elettrodi a membrana accoppiati con mediatori biochimici quali enzimi Immobllizzatl e recentemente anche antlcorpi, batteri e tessuti viventi altamente specializzati; ia selettivitò degli elettrodi e ia specificitò dei medIatorI convertono spesso una determinazione chimica altrimenti b e o o r la s rnpF e opero br e d u a mis ra elettr co. !n Fg. e schemolcmnte inaicoto li principio base del biosensori e!ettrochImc. o illustriamo ctendo esempio classico del sensore omperometrico o gfticosio di Clark e Lgons che per primi, nel 1962, lo realizzarono (1). Come tutti biosensori ero costituito di due porti: quella molecolare cli riconoscimento realIzzata con lenzima glucosio ossidosi (60.0) e quello per io trosduzione del segnale effettuata da un sensore per I ossigeno. Venzima catalizza fo seguente reazione: p Glucosio ÷ 2 GOD -> Ficido gluconico ÷ 0 2 H il segnale di corrente, dovuto allo diminuizione dell’ossigeno, è correlato alla concentrazione cli glucosio. Fig. Schema di un biosensore À elettrodo a membrana sostanza da determinare • prcdottc eletiroattivo O aHri prodoth O LÀ strato biocatalitìco o / i corpo della soluzione i 0 +1 la reazione base di un mediatore biochimico è in genere una reazione enzimetico; queste sono infatti motto specifiche, si verificano solo su determinati substrati, avvengono in modo assai rapido e generano o consumano nel loro evolversi specie chimiche che possono essere selettivamente rivelate dai sensori elettrochimici con elevata sensibilità, Nella tabella I sono elencati una serie di substrati di interesse biologico, chimico e farmaceutico che negli anni hanno costituito oggetto di ricerca per la realizzazione di “biosensori specifici’. Fissando l’attenzione sui tipo di sensore elettrochimico utilizzato, troviamo appunto alcuni sensori potenziometrici (elettrodi o vetro. o clanuroad ommoniocoì, alcuni sensori a gas potenziomtritI 6 di i sensori (sensori per ammoniaca ed anidride carbonica); quin per acqua amperometrici come l’elettrodo di Ciark (02), i sensori flg/RgCi) e ossigenata (catodo dl platino poierlzzato a + 600 mu in. ’ 4 catodi dl grafite per la riduzione dei NAD i tipi di mediatore biochimico che tati Nelle tabelle 2 sono ripor Infetti non sono stati utilizzati, in ordine dl crescente complessità; etto “crudo” sempre è sufficiente o possibile utilizzare i’enzima cosid ‘I 7 TBBELLR I Ricuni substrati che possono essere convertiti in specie chimiche individuate da sensori amperometrici e potenziometrici. ofle2nft® cmtmDOm2®rm ocOw ono®rm Urea Ureasi 3 NK gas membr.iiquida Giucosio Giucosioossidasi Oz tiaric 11202 anodo piatino Saiattosio Gaiattosioossidasi IIzOz anodo platino flmigdalina fr-giucosidasi CN ISE Coiesteroio Coiesteroioossidasi Ciark Proteine Proteasl+L-aminoac. os. MI 3 gas Rc. Rscorbico Rscorbatoossidasi Ciark Lattato Lattatoossidasi Oz Ciark Ricooldeidrogenasi NRDH catodo Penicillina Penicillasl 11 vetro Ossalato Ossaiatoossidasi 2 CO gas • Rlcooi • -• i’ 9. TRBELIR 2 Tipici 8ccoppi&flefltl dl bioCt8liZZt2t0rl e sensori elettrochltTìlti fl1T rct ISE 1iquid tiree Enzlmo ureesi Gtuto!ThtO Sequenzo enzimi 2 CO gos SccrosIO SeqUeflZ enzimi 02 Clork Glutmmifl8 Mitocondri del tes.ren1e 3 NH gos Cisteino Cellule batteriChe S 2 H gs Glucosio Lievito 2 02, Co Clrk, gs fldenoSifl monofOSftO Tessuto muscoIre del coniglio 3 NH 800 FunghI, btter1 02 ges RmIgd&lfl Tessuto stomcO lumoc CN ISE G1ut8mmifl Tessuto rene melale 3 NH gas H 0 2 OrmOflI Tessuto fegato ultellO 02 Clark GlutammotO Tessuto vegetale 2 CO gas ) aivolta p u d un enzima e necessario alla trasformazione di una le •Deiabile dai .unsore elettrochimico spe il caso piu semplice è quello dei saccarosio dove sono necessari ben tre enzimi in sequenza per ottenere una relazione tra li saccarosio e i’ossigeno disciolto in soluzione: Saccarosio anvertasi———-> an—Giucosio aO-biucosio -----mutarotas 30-Glucosio 1e> + Fruttosio DO-Glucosio GoD----> Acido Gluconlco + 11202 Aitri casi riguardano enzimi iabiii, che invece, se usati in ambiente più adatto (mitocondri, membrane cellulari, batteri, tessuti interi), sono molto più stabili; il tempo di vita è infatti un parametro molto importante nella realizzazione di un sensore biochimico. Sii esempi riportati nella tabeiia 2 sono li frutto di iunghe ricerche che hanno portato a tipi dl mediatori biochimici differenti. Alla base cè sempre una reazione enzimatica, ma spesso i’enzima non è usato come taie, in forma iiofiiizzata, ma in un ambiente dove è ‘protetto per ia presenza di altri cofattori, altri enzimi e dove il tempo di vita è più lungo. interessante è per esempio li paragone rappresentato neila Fig. 2 tra diversi tipi di biosensori, ii mediatore biologico dei quali è la giutaminasi, un enzima demolitore della giutamina in ammoniaca. Si possono usare diverse “preparazioni”, diversi “mediatori biochimici”; ia reazione enzimatica è sempre la stessa , ma la forma nella quaie in pratica si realizza l’accoppiamento con l’elettrodo ad ammoniaca influenza molto li tempo di vita dei sensore. Basta d’aitra parte osservare la tabeila 2 per notare come i ricercatori abbiano avuto molta fantasia nel selezionare alcuni catalizzatori moito particoiari. Neiia tabella sono inclusi solo alcuni esempi dei lavori realizzati negli ultimi anni, ma questi danno una idea abbastanza precisa dei ventaglio delle soluzioni reaiizzabili. La ricerca in questo campo si trova ad affrontare problemi non indifferenti dovuti aila compiessitò dei numerosi aspetti. (in biosensore può considerarsi infatti come un sistema-sensore costituito da numerosi sottosistemi ognuno con differenti aspetti di natura biologica, chimica e fisica. Lo sviluppo dei biosensori richiede perciò interventi di ricerca a diversi iiveiii su ognuno di questi sottosistemP l’enzima, i’immobiiizzazione enzimatica, li supporto poiimerico, le membrane seiettive, il trasduttore elettrochimico, __ ospetti sul quoli ovremo occosione di tornore, più o meno diffusamente, in seguito nel testo. CI sono poi altri problemi di carattere chimico rappresentati dal sistemo reale che si vuole studiare: I analita nel campione reaie gli effetti dello matrice, delle sostanze interferenti ecc.. Nell affrontare in queste pagine ciascuno di questi aspetti non si ho Io preteso di esaurire un argomento che negli ultimi anni ho coinvolto molti settori dello ricerca, dellindustrio e dello medicina, sì vorrebbe invece, attraverso alcuni dei numerosi esempi reperibili in letterature, illustrare in maniera sia pur generale il funzionamento, le applicazioni e le potenzialità dei biosensori, accennando in taluni tosi anche al procedimenti operativi per ottenerli. FIg, 2 ComparazIone tra tempi di vita minimi per lo utilizzazione dl diversi biosensorì per lo determinazione dello glutamina, TESSUTI E30 / Co > / 2O’ L MITOCONDRI *1 ENZIMA 7//i tipo di elettrodo Liengono qui di seguito riportati alcuni tipi cli immobilizzazIone attraverso cui questi mediatori biochimici sono utilizzabili per I fini analitici ai quali siamo interessati. in genere ciò è particolarmente Importante nel caso dl sistemi basati su enzimi data la loro solubilità In soluzione acquosa. Non ci sono Infatti particolari problemi neirlmmoblllzzazlone dl uno coltura batterica, In quanto le dimensioni del batteri sono tali per cui un filtro dl cellulosa rappresenta già un favorevole supporto per la Immobilizzazione stessa. I metodi di immobilizzazione degli enzimi sono schemeticomente indicati nella FIg. 3 Fig,3 Schema dl tecniche per lo immobilizzazione di un enzima. (rif. 3) SUPPORTO E LEGAME COVALENTE ADSOR8IMENTO CROSS— LINKING INTRAPPOLAMENTO IN GEL ME M BR AN A = enzima ch lo e ltzzozione piu semplic€ ro iuest lo rot e [o StOblil è Io Immobilizzazione fisico di quolcnc mg ai enzima sullo superficie elettrodica, con il semplice ausilio di uno membrana do dtolisL E’ un procedimento di tipo preliminare che permette di sapere se la reazione 8il quale siamo interessati effettivamente avviene e se 18 suo cinetica è compatibile con i tempi di risposto del sensore scelto; essa deve precedere sempre timmobilizzozione ottenuta con altri sistemi generalmente di natura chimica. Lo descriviamo per questo in dettaglio. SI preparo un impasto viscoso mescolando t’enzima con acqua o con un’appropriata soluzione tampone (ad esempio i mg di enzima ed i ul dl soluzione), L’imposto così ottenuto è disteso sulla superficie elettrodico e lo strato coperto con una membrana da dlallsl motto sottile (20-25 u di spessore), l’elettrodo ad enzima così realizzato è stabile per circo una settimana purchè conservato, quando non è in funzione, alta temperatura di 5-l0C. Il procedimento è illustrato nelle sue fasi essenziali in Fig, 4 (rif, 1) Fig.4 C e Preparazione amigdaiina. di un elettrodo A) corpo dell’elettrodo: gli angoli membrana sono sezione con la arrotondati; ad della stati fl) I mg di enzima con I UI dl acqua sono stratificati direttamente sulla superficie; C) membrana da dialisi di spessore 20 u D) anello di gomma. A La quantità di enzima cia strotificere sulla superficie dell’elettrodo, possibilmente piatta, oscillo intorno a 1-10 mg pari o 10-15 unItà, Lo spessore deve essere il più piccolo possibile per non impedire la diffusione delle specie elettroattive alla superficie dell’elettrodo e per eliminare rapidamente il substrato passando do un campione ad un altro o concentrazione diverso. Anche lo spessore dello membrana do dialisi deve essere lI più sottile possibile, pur montenendo uno strutturo resIstente, SpessorI intorno ot 30 u sono risuttoti i più oppropriotL Lelettrodo tosi preporoto deve essere tenuto in ocqua o soluzione tompone in modo do montenere umido lo membrono di ceiluloso e quondo non in uso, in frigorifero per ossicurare uno più lungo vita ol[enzima, Questo tipo di immobilizzaziorìe è talvolta anche conveniente do un punto di vista analitico, poichè Il processo cli immobilizzazIone non comporta uno reazione deilenzima. Le diminuzione di attività nel tempo è dovute o processi cli demolizione spontaneo degli enzimi con conseguente diffusione attraverso lo membrane da diolisi, allo degradazione spontanea degli enzimi nello soluzione tampone durante te misure ed alle stesse diffusione dellenzimo attraverso lo membrana. ffThft!f! RERZIONI CHI1lCHE Negli ultimi anni si sono sviluppate diverse tecniche per lrnmobiilzzare gli enzimi formando un legame di tipo covalente tra renzima ed alcuni supporti Insolubili. Gli enzimi così legati hanno spesso una maggiore stbi!ità nel tempo ed il legame covalente cori il supporto non è influenzato dall’ambiente esterno (fattori quali pi-I, forzo Ionica, tipo di substrato e temperatura) Oggi infatti questo è il metodo più Importante di immobilizzazione tenendo presente anche la semplicità cli alcuni metodi cli preparazione (4 ). Il legame è ottenuto tra gruppi funzionali dell’enzima, che non partecipano olio reazione enzimatico e che quindi non inffuenzano Io attWità enzimatica stessa, e quelli del derivati reattivi di polimeri insolubili. In pratica si ottiene quasi sempre uno parziale denoturazione dell’enzima a causo di reazioni casuali, anche perchè spesso non è ben Individuata io parte dell’enzima che determino le suo attività cotalitica. Nello maggior parte dei casi la scelto deve essere necessariamente sperimentale ma nonostante ciò, I risultati ottenuti Invitano a proseguire nella messa a punto di questa tecnica. Gli elettrodi ad enzima così realizzati hanno come caratteristico peculiare uno maggiore stabilità nel tempo; si passa cioè da tempi cli vita di 1-2 settimane per gli elettrodi realizzati con il metodo di introppolomento precedentemente descritto, e circa 1-6 mesi (cioè un vero ordine di grandezza). 3.1.1 LE REAZIONI Dl !MMOlLIZZfiZlONI A tuttoggi esistono un gran numero di procedimenti di immobilizzazione covalente degli enzimi; la ragione del proliferare di tali metodi è dovuta essenzialmente alle diverse proprietà degli enzimi che si utilizzano. Non bisogna dimenticare che tutti i procedimenti di Immobilizzazione chimica modificano in modo sensibile Io struttura di queste proteine e, se da un lato si ottiene una maggiore resistenza agli agenti denaturonti, in certi casi si pijò assistere alla distruzione del sito attivo con parziale o totale perdita di attività. Appare evidente alloro che ogni enzima richiede differenti condizioni per operare e che I esistenza di piu metodi, diversi per 15 supporti e procedimenti usati, costituisce un valido punto di partenza per l’immobilizzazione di nuovi enzimi. La reazione, in senso generale, consiste di due fasi: la trasformazione o attivazione dei composto inioiubiie in un derivato reattivo e ia reazione tra i gruppi funzionaii deii’enzima con questo derivato. i materiaii più comuni utiiizzati come supporti (tab. 3) sono composti inorganici come li vetro, poiimeri naturali e sintetici come la ceiiuiosa (6), il coiiagene (7—8), il ngion (9—10), l’agarosio (11), ia poiiacriiamide (12) o il poiivinil aicooi (13,14,15). Questi composti sòno attivati con opportune reazioni e quindi fatti reagire con gli enzimi. TRBELLR 3 Supporti insoiubiii utiiizzati per ia insoiubiiizzòzione chimica di enzimi. - Poiiacriiammide Rcido poiiacriiico Vetro poroso Carbossimetiiceliuiosa Poiistirene teiiuiosa Rcido poiiaspartico Rcido poiigiutammico Ngion Sephadesi Sepharose Poiivinii aicooi Coiiagene POL1MERi BiOCOMPRTiBiLi Poiiuretanl Rcriionitriie Acetato di ceiiuiosa Qui di seguito (Fig.5) sono riportate aicune reazioni di accoppiemento con enzima. in genere i residui degli amminoacid! I adatti aiie reazioni di accoppiamento sono: I. 16 e) gruppi emmlnlcl In «ed in E b) leneilo tenolico delle tlroslne e) I gruppI cerbosslllcl In e 7 d) Il gruppo ossldrlllco delle serlne e) Il gruppo Imldezollco delle Istldlne; dl questI I prImI tre sono I pIù comunemente usetl. I. N I E. o L o E o a) E E o o o E a) o. o o a) a) o N o 4-. 4- o o o (f) x z x z o (-) I () I L) + I O/Z o I z z + I - // i 7: I I z z I o o o i b) ettiva i e ed cc opp onerto di ocido po ccciii o o i CH,=(HC O so ooc / O 2 (NHS OH 1 / OH O O 2 SOCI — OH CI O O _/ CI 2 TCI / , / O O O NaNO,, HCI —C NHG_NH, ‘NH—N, OH O / O eC!o 2 \Hc_N NH OH N=NQ CI c reazi ne d ottiunzione vetro ed oc opplomento con enzimi vet o porosc. vetro aichilamminico 3amrninopropiItrie ossilano cr10 2 vetro—NT-! 3 ) 2 (CH + —* vetro-N CHO 3 ) 2 CH(CH CHO 2 ————— vetro-N = CH(CF! ) CHO + enzima—NH 3 vetroN CHN—enzima 3 ) 2 CH(CH vetro lchitmminico può essere convertito in vetro 8rfl8mminico f8cendolo reogire con ecido p—nltrobenzoico e successIu riduzione il d) ttivQzfone ed ccoppimento dl crbossimetilceUulos CH-OH —OCH COOH 2 (CM C) —-—--- iici CONHNH OCH 2 — 2 enzima—NH + CON 2 -OCH 3 -OCH 2 COOH 2 NaNO ——— — -OCH 2 CON CONH—enzima 2 -OCH = (O 3 3 (O CO 3 3 — :i 1! ‘-‘(o ‘I — — c + I o — o o = CO CO —o o == cz D 0 c = o CO o CO g formazione di legami ammdicì con [ausilio dl carbodiimmìde tra supporti nsolubiIi ed enzimi —COOH enzimaCOOH 2 enzima —N11 N = C= N —NHCO---enzima —CONH—enzima h) 6ttivazlone di un supporto emminico con gtutoretde ide CHO 3 ) 2 (CH ± — R-N = CH(CH 2 ), dO CHÒ -R-N = CH(CH ) C}-Icj + 2 enzima —NH —* RN 2 3 CH(CH ) C 11 N—enzima 4 NaBH R-NH(CH 25 NH—enzima 22 La tabella 4 mostre inoltre gli amminoacidi coinvolti nel metodi di immobilizzazione più comuni. Dall’esame di quanto tino ed ore mostrato, conoscendo i slti attivi dell’enzima, si potrò scegliere il metodo chimico più adatto per un particolare enzima. Questa è però ancore una strade teorica che, come spesso avviene nella ricerca chimica, non rappresenta le sicura alternativa rispetto aiia sperimentazione, cioè al metodo triai and error. Tabella 4 Residui reattivi degli amminoacidi in alcuni metodi di insoiubiiizzazione chimica - r®ettIn sniniienmendlo melhmnDtfl bc®OflOOfl®mtw nOlIm rmnOnm Azlde acido Lls. Tir. Cls. Ser. Sale dl dlazonio Lls. Lls. Lis. His. Giutaraidelde Lis. Lis. 1115. TIr. 05. Derivato isotiocienato Lis. Rrg. Dhimmlde Lls. Tir. 05. Rsp. Elu. His. Tir. firg. 05. Hls. TIr. Tir. flrg. Tir. 23 3.2 MEMBRANE POL1MER1CHE Si ere accennato nelle pagine precedenti ai sistema-sensore ed alle sue numerose unità costituenti. Le membrane poiimeriche che si trovano oggi sui mercato costituiscono, insieme aii’enzima ed ai trasduttore elettrico il cuore dei sistema-sensore poiché sono i’interfaccia, l’unione tre ii sottosistema di riconoscimento e quello di rivelazione. Non solo quindi una funzione di supporto, ma anche, in alcuni casi, di selezione (selettività di membrana). E’ per questo motivo che ci soffermiamo, in questo paragrafo, a descrivere aicune caratteristiche chimiche e strutturali dei polimeri costituenti le membrane ed i meccanismi chimico-fisici del trasporto attraverso di esse. Esiste una stretta relazione tra il tipo di polimero costituente ia membrana ed il meccanismo di trasporto. Da un punto di vista chimico fisico è conveniente ciassificare ie matrici poiimeriche in due categorie: omogenee ed eterogenee. Nei primo caso si hanno dense matrici poiimeriche ed il trasporto avviene per diffusione moiecoiare attraverso ia fase solida, nello spazio disponibile tra le catene macromoiecoiari (10-100 A). La diffusione attraverso una membrana poiimerica omogenea è regoiata daila iegge di Ficic, ma è opportuno anche considerare la solubilità dei soiuto permeante nella matrice poiimerica. Per questo motivo la natura dei soluto (dimensione delle molecoie, interazioni elettrostatiche) e della matrice poilmerica possono Influenzare in modo determinante la permeabilità dl una specie. Le matrici polimeriche eterogenee hanno invece una struttura porosa. li trasporto dl molecole avviene attraverso i pori che possono essere di larghezza controllata e quindi costituiscono in genere una barriera selettiva per molecole più grandi. Per questo motivo si propone un modello di trasporto esempilcativo a setaccio, in questo caso le interazioni elettrostatiche tra poiimero e molecola assumono minore importanza eccetto che per molecole di dimensioni confrontabill a quelle del pori. La porosltà della membrana, li suo spessore e ia tortuosità dei poro aisumono allora un ruolo importante nella diffusione di una sostanza. Appare evidente aiiora come ia natura del polimero, Il meccanismo di trasporto, la microstruttura deiia membrana, i gruppi reattivi presenti, possono giocare ruoli determinanti ai fine di una maggiore seiettivit4 del sistema analitico, o dell’attività dei mediatore biologIco o ancora della sua stabilità. Le tecnologia di membrana hanno trovato molteplici applicazioni nelle separazioni industriali (uitra, micro e iperfiitrazione) ed anche nei processi biocatalizzati dove si assiste ad uno sviluppo analogo ai b o se n s o rt, Bosensort e bIoreattor touorno proNeomente ne process biotecnoogIc, gli unì per consentire trsform8zioni in continuo procIuttiumente corìuerìienti ttroverso i! confinarnento dl bIoctaìIzz8torl, gli itri per controllarne ed ottimizz8rne le rese Uedremo nei seguenti porogrofi olcune opplicozioni di blosensorl e bloreattori nel compo procluttiuo ogro—olimentore. I 25 4) APPLICAZIONI BEI BIOSENSORI Le ricerca e le applicazioni di laboratorio hanno consentito uno sviluppo del sistema blosensore lino ella lese dl applicazione pratI ca In diversi campi. E’ ovvio che l’applicazione di un sistema molto partiColare e sensibile come Il biosensore, le cui variabili sono state discusse in precedenza, richiede una approfondita analisi delle condizioni al contorno nelle quali si vuole realizzare il monitoragglo . Standardizzazione delle condizioni dl misura, effetto degli interferen ti, sensibilità dei metodo, misura in flusso, basso costo del “probe”, risposta In tempo reale, calibrazione kapida e sempiice, sono solo alcune delle specifiche richieste ai biosensori ippiicati In campo biomedico o industriale. Le caratteristiche richieste ad un sensore possono cambiare da settore a settore dl applicazione, tosi, acca nto alla specificitò, sensibilità, accuratezza e precisione possono esser e importanti, soprattuto nel campo medico, caratteristiche come la 5 teriiizzabiiità, la biocompatibiiità e la miniaturizzazione. In altri settori, come quello del controllo dei processi biotecnoiogici, la stabilità e la lunga durata del sensore sono in certi casi più rilevanti della sensibilità e della precisione. E’ da sotto lineare l’importanza degli studi anailtici in un’area c.he richi ede specializzazioné, lavoro di equipe e interdisciplinarietò, intesa come capacità al dialogo con altri esperti nei campo biologico, fisico, medico e industriale. Con i sensori blochimici si può ritenere di essere all’inizio di una nuova ed assai promettente fase nella ricerca sui campo specifico dei sensori. Per chiarire questa affermazione si possono pass are rapidamente In rassegna alcune applicazioni recenti che dimo strano l’alto grado di sofistlcazione e la creatività evidenziatl nel disegn o dl alcuni recenti lavori su questo argomento. /4. 4.1 1) li primo esempio riguarda lapplicozione olio determinazione di glucosio ed urea nel siero del sangue. Questa analisi è importante per valutare diversi stati patologici sia In analIsi dl rrnjtine che in urgenza. In queste applicazione sono utilizzati due sensori, uno a glucosio ed uno ad urea, ossembiati insieme in un sistema o flusso continuo per cui la determinazione di azotemio e glicemio iilene effettuate contemporaneamente sullo stesso campione (16). I sensori sono stati preparati immobilizzando gli enzimi Glucosloossidasi ed lireasi su reti di Nulon e poi fissati su due sensori commerciali ad ossigeno ed ammoniaca. Le reazioni sono: Glucosio Urea + + 1-130 02 - G1’cDs1oossidasi---> ---urasi----> 4 2 NH + Rcido Gluconico ÷ 11202 HC0 La attività degli enzimi immobilizzoti si è mantenuta costante per diversi mesi permettendo un notevolissimo numero di analisi. SI è studiato leffetto delle voriozioni di p11 sulla attività degli enzimi e sul tempo di risposta dei sensori. Si è deciso quindi di lavorare a pI-I 8.3 in tampone Tris 0.1 M, diluendo i sieri 1:10. Gli intervalli dì concentrazione dei sieri diluiti sono: Glucosio 6.5-10.5 mg/dl urea 2.0-4.5 mg/dl I sensori sono lineari nellinteruallo: Glucosio 1-20 mg/dl Urea 0.2-10 mg/cli I risultati ottenuti mostrano buon accordo con quelli spettrofotometrici. Lo velocità di analisi è Intorno ai 20 campionI per ora, Flg6 FI C = FI = 5 = W= Sistemo o flusso per i sensori o glucosio ed ureo elettrodo o glucosio; B elettrodo od iireo; cello termostotico; P = pompo perlst&tlco; potenziometro ed omperometro con registrotore; complone do onolizzore. scorico 4 1.2) ftflgrm1npjie dejtt(reojffiiaa &deJJtlLQteLJfl Un’altro applicazione clinico è io determinazione dello treatinina (Fig. 7) e delle Proteine (Fig. 8), utilizzando sistemi o flusso continuo e reattori contenenti enzimi immobillzzati (17-18). Nei coso dello creotinina l’enzima creotininosi è immobilizzato su di uno spirale di ngion. il campione do analizzare, contenente creatinina, viene fatto passare attraverso io spirale enzimatica e iammoniaca prodotte viene anaiizzeta con un sensore ad ammoniaca. Per quanto concerne le proteine, io tecnico di anaiisi si articolo in tre fasi distinte. Neiio primo si reoiizzo uno idrolisi enzimotico deiie proteine con formazione di un miscugiio di L-omminoocidi. Per questo fese si è utilizzata od una proteasi già immobiiizzata su agarosio e teperibile in commercio, od una proteasi immobilizzata suiie pareti interne di un tubo di ngion. Gii L-amminoacidi formatisi nelia prima fase reagiscono con un secondo enzima, io L-amminoacidoossidasi; anche in questo caso, in maniera anaioga alla precedente, si è immobilizzato l’enzima. Queste seconda reazione enzimatica porta alla formazione di ioni ammonio. Neiia terza ed ultima fase vengono determinati gli ioni ammonio come ammoniaca mediante un sensore ad ammoniaca. La quantità di ioni ammonio che si formano è proporzionaie alla concentrazione proteica deiia soiuzione biologica anaiizzata ed è proprio su questo che si baso il metodo per la determinazione di proteine. ‘Il. er I• 8 6) • e 3 i: tI a e a 5 3 la la ti •. li. e. 00 ce I 3la ce ce la •l’l O e ae 00 se e, no la a la o. n’t 0 Si o. Si la(* lat e • 3 u I. t’e lilla e, la l’sU e. o, la Ø la 0-0 rtOla .1 c e 30 la e o Ct o.. o ‘i •-• 0 11 i• Il. a a I ; o la ti i, o e e o 1% la la • -. •8 ,& la • 61 e la o . la •- Cii la •a e • 610W ‘i.’• o se i: e i’ .1 .C • i’ ti :se -. lan 3la • .‘ E i ---e--___::z;ii (a -i--e —a :4, ‘FI o n lii ti te * Ai in ti fl *.. Ai in e I, 12 s n (i o o c b a mV mV rnV 50 00 50 100 120 100 —- 250 500 300 AMMONIACA Fig 8 Schema a — i anaiisi 100 50 diL siero ALBUMINA flusno continuo per -- 1000 d proteine. Ti = fleattore con A = Reattore con proteasi ; PP = Pompa peristaltica; PR = Poten e; Sensor = E Ti = DcgorgogHatore; L-arninoacido .ossidasi; ziomctro registratore. s campione LJnaltra applicazione clinico rguordo ruso di biosensori nello determinazione dl ormoni con una tecnica di EIfl tEnzgme lmmunoossoj), Il sensore utilizzato è un elettrodo od ossigeno con immobIlizzato uno strato di fegato di vitello (in pratico uno alta concentrazione di cotolasi). In ti modo il sensore divento un rivelatore di acqua ossigenato. Locqua ossigenato inoltre non reagisce con molte sostanze organiche direttamente, per esempio il 4—ommino-fenozone (4-omminoontipirino), ma solo in presenza di perossidosi, per cui questo sistemo divento un sensore di perossiclosi (Fig. 9). Rg. 9 - Scherno dl un biosensore per la determinazione dl ormoni. 0+1120 >H 2 — 0 2 Red+H Ormone + Ab Ormone—HRP ÷ Ab 0+Ox 2 >H > —> Ormone—Ab Ormone—HRP-—Ab ÷Red 0 2 H 4 sensore COn tessuH d fegato tDrovetta t oisIrOo) con Daret res.te d antcorp Competizione (EIA) a .ernsi.es a u on, ma trecc’e.”te de p.c’ •w raez a. di P. L’ormone Insu me è steto determneto con questo riveletore (Fig io) Il cempione contenente insulina vleie messo insieme ei coniugeto con i’enzime IiRP in une provette di polistirolo sulle cui pereti è steto previemente letto essorbire i enticorpo dell insuiine; quindi, dopo le reezione immunochimice, i’enzime rimesto sulle pereti dei tubo, le cui quentitò è funzione delle competizione per l’enticorpo tre l’ormone ed il coniugeto, è steto doseto con il sensore per le perossidesi ottenendo quindi con un blosensore une indicezione quentitetive di un ormone in soluzione (19). Fig. IOe) Curve di ceiibrezione con biosensore con tessuto per le determinezione di insuiine. Stenderd e siero dei kit Boehringer. — stenderd — siero ricostituito b) Curve spettrofotometrice / siero a A ee —c INSULINA . 33 4.1.4) Determinazione di Siucosio. Lottato e Piruvato in nazienti diabetici La più recente oppilcezione clinico dei biosensori è io misuro dei Glucosio, Lottoto e Piruvoto in pazienti diabetici sottoposti o cure intensive, utilizzando il pancreas artificiale (Betoiike, Esacontrol-GENO1lA) (20-21). Questo strumento prelevo sangue dal paziente, analizzo il contenuto di glucosio ed in base ol risultato introduce quantità dosote di insulina. Essendo il lottato ed il piruvato due metoboiiti de controllore durante iinfusione di insulina, è sorto la necessità di realizzare due sensori per questi metaboiiti, che potessero operore in continuo, in flusso di sangue eporinizzato eventualmente diluito, Si sono cos-i ottenuti due sensori accoppiando un elettrodo od ossigeno con le iattatoossidasi per io determinazione dei iattato ed un elettrodo ed acqua ossigenata con io piruvatoossidesi per la determinazione dei piruvato. Le reazioni sono le seguenti: ner il iattato: Lottato 0z + > Piruvoto + 11202 ner il ninwato: Piruvato + 2 4 i1P0 > flcetiifosfeto + 11202 + 2 CO Sono stati eseguiti esperimenti determinando “in vivo” lottato e piruvato in pazienti sottoposti ai trattamento con pancreas artificiaie. Durante le misure in continuo sono stati prelevati campioni di sangue ed li contenuto di lottato e piruveto è stato analizzato con i ciassici metodi spettrofotometrici. In Fig. 11 (pag. seguente) viene descritta in maniera dettagliata questa eppiicazione ciinica. i risultati deiie anaiisi spettrafotometriche (linee punteggiate) sono in ottimo accordo con queiii ottenuti “in vivo” utilizzando i biosensori. Ai tempo indicato come ST è state fatta passare attraverso la cella, dove erano eiioggiati i sensori a latteto e piruvato, una soluzione FIg. i! Misuro In continuo del giucoslo lottato e plruvoto “in vivo” durante un esperimento con il poncreas artificiale “BETRLIKE”, (vedi Il testo per spiegazioni ed ebbreviozioniL o LI, o D -J h p / i o > SIQo ex cx, ‘tepdard? attg.tn e p .uL..ta per ca. rre i b’c enari RI tempo indicato come LRL il sensore e glucosio del Retalilce e stato caiibrato. Durante questi periodi il flusso del sangue del paziente veniva disconnesso del sensori. RI tempo indicato come EH è stato chiesto ai pazIente di tare un breve esercizio fisico, che è stato poi Interrotto ai tempo indicato come STOPER. RI tempo indicato come 1NFGLU un • carlco di glucosio e stato iniettato (50 g) nei paziente in un tempo breve. MERL indica il periodo in cui il paziente ha consumato un pasto normale. F interessante notare il grande effetto dell’esercizio fisico sulla concentrazione di iattato e piruvato, seguito dai ritorno parallelo di entrambi gli anaiiti alla concentrazione normale. Come ci si aspettava, li carico di glucosio ha provocato una grossa variazione sulia concentrazione di glucosio nei sangue, ma ha causato variazioni poco apprezzabiii suiie concentrazioni di lattato e piruvato. Dopo il pasto tutti e tre i metaboilti hanno mostrato notevoli e continue variazioni. A) N_.- nt Le r,ossibi!i appiicazbni ir’dustriaii, fra le quell un cenno particoiare merito il tempo delle biotecnoiogie, si basano principalmente sullo misuro di parametri tisici e chimici “in situ” ed in continuo. Da qui i esigenze di metodi non distruttivi e specifici per la determinazione di composti bioiogici anche complessi; i’esigenza, in oltre parnie, dei sensore capace di determinare un metaboiita in tempi brevi con elevata affidabiiita, dando cioè un segnaie anaiitico preciso, accurato e di elevata sensibiiitò. Neiie pagine che seguono si cercherò di iiiustrare il ruolo chiave dei biosensori nei controilo di alcuni processi industriaii acconto alle potenziaiitò di particolari reattori enzimatici a fibre cave dove il catalizzatore è confinato fisicamente per ottenere trasformazioni chimiche in flusso continuo. 4.2.i) Smaitimento di retiui di caseificio Nei nostro paese la grande produzione di siero di latte, vaiutata intorno a 4-5 milioni di tonnellate/anno, crea probiemi di smaitimento anche in reiazione alla vigente normativa di rilascio di refiui industriali (legge Meni), il siero deiie industrie casearie, ma anche i refiui dei settore iattlero, presentano generaimente elevato carico inquinante (BOD 50,000 ppm) e basso valore economico per la notevole diiuizione dei prodotto. A ciò si aggiungono aitri aspetti economicamente negativi come i’eievato costo di trasporto, la bassa soiubiiitò dei lattosio nei siero, la facile fermentabiiitò dei prodotto dovuta ad una elevata carica microbica, l’invecchiamento dei prodotto etc.. L’applicazione della nuova normativa sui controiio dei refiui industriali pone ii problema di riconsiderare, non soio da un punto di vista ambientale, ma anche produttivo, io smaitimento, il recupero e la vaiorizzazione dei costituenti naturali dei siero di iatte. ii trattamento di uitrafiitrazione (UF) dei siero (22) più diffuso nei paesi dei Nord-Europa e negli Stati Uniti che in itaiia, consente una valorizzazione notevole dei suoi costituenti naturali. Fra questi in particolare vanno considerate ie sieroproteine, il iattosio e i’acqua. li iattosio si trova nei siero dilette di vacca ad uno concentrazione che osciiia intorno ai 50 gli. La scarsa digenlbiiitò di questo disaccaride da parte deiie popoiazioni mediterranee aduite, suqgerisce uno parziale idrolisi dei iattosio nei due monosaccaridi costituenti (glucosio e geiattosio). Ciò L’iene gia realizzato medien e !droiisi in ‘batch” per perzni’ner.te edulcoYato e mano p r” diqr.i’ilic t otie”re un iat 37 calorico (23). attualmente l’impiego di tecnologie di VF e rnicrofiitrezio.ne consente separazioni specifiche (proteine, giucidi, acqua) da cui è possibile un utilizzo integreto dei costituenti dei siero dilet te. Le Fig.12 mostre io schema generaie dei processo di trattamento dei siero dilette con tecnologie separative e bioeiettrodi per ii giucos io e li iattosio che costituiscono le unità sensibili per ii controiio auto matico di tutto il processo. L’VF dei siero consente di raccogiiere di raccog liere nei concentrato le frezione proteice e nei fluido perm eeto sostanziaimente lattosio, sali minerali e acque in emb iente parziaimente steriie poiché ie fiore batterica viene tràttenuta daiie membrane. Su questo permeato è possibile realizzare l’idrol isi dei lattosio attraverso i’impiego di un bioreattore enzimatico in contin uo (24). La superficie microporosa deiie membrane a fibre cave asimmetriche fornisce una buona opportunità per imm obiiizzare fisicamente enzimi o ceiiuie. Moduli commerciali da VF (amicon, Romicon, New etc.) sono stati utilizzati con successo a ques to scopo (25—26). Questo tipo di reattore, cosidetto di seconda generazio ne, in cui l’enzima -gaiattosidasi (iattasi) viene immobiiizzato sui suppor to costituito da una membrana da uitrefiitrazione (Fig.13-14), prese nte interessanti vantaggi pratici: a) bassa quantità di enzima impiegato b) reettoristica mòduiare e quindi impientistica ridotta c) reazione in flusso continuo d) ueioce cinetica di reazione (bassa inibizione da prodotto, nel caso specifico gaiattosio) e) separazione dei prodotto daii’enzima f) controilo rigoroso dei parametri di processo. Il e di Ig 3 cher o rot o cJ bioreottore iot o ico ° de !e opporecchioture strumento!t per it controho de processo I Soluzione di substrato (ieed) 2 Termostato 3 4 5 6 7 lo Pompa penstaltica del feed Modulo a fibre cave Raccoglitore di frazioni Crornatografo liquido (HPLC) BoeIettrodo a glucosio 8 Voltamperometro 9 Camicia termostafica 10 Micromanometro in linea 9 i latte LEGENDA feed adjustment 4) 5) bioreattore lattasico impianto da ultrafiltrazione 3) 2) prefiltro meccanico 1) Raccolta omogeneizzatore sedimentatore sedimenti siero dì ‘i pastorizatore recervoire di enzisa 10) caseificio 9) 8) impianto di osmosi inversa;12) computer di gestione lì) acquisitore dati 7) 12 senscre a glucosio [;E 6) LJ zil [L’j1 iO o 0 o CO ‘e CDo o oro o r, __ Fig ! 4 Sezne irnc:tjdino!e d un no[Fi fibra polIsoIfonic6 cn deposito enzirnotico e orocesso di drolisl in continuo del lotosio (simboli in figuro) / / L_ L_P-L_ ‘3 0 ,0 O L’! 0 r o 4/ E __ o • • EJEE) qaIaltos/O / o Loso O DCC ( Tgb.5 Specifiche de! modulo a fibre cave l-HPIO-20 Rmicofl Materiale costituente le fibre: polisolfone Materiale cli riempimento: resine epossidiche Materiale cli rivesttmento (housing): polietilene Molecular weight cut 0ff: nominale 10000 d&ton Rreo superfici8le: 600 cm 2 Diametro interno delle fibre: 0.5 mm Diametro dello cartuccia: 2.3 cm Lunghezza dello cartuccia: 20.3 cm Numero delle fibre: 250 Pressione massimo operativo: 1.8 Kg/cm 2 Temperatura ma operativo in continuo: 50 C Intervallo di p11: 1.5 13 - il consoilo ai pa ametri chimico-fisici dei processo e di notevole importanza per la caratterizzazione del siste ma in esame e per le costruzione di un modello matematico In base ai quale risulta possibile correlare le variabili In gioco ed ottimizzar e li comportamento del reattore in termini di rese (27). Lo sviluppo di un sensore in flusso per li glucosio, posto sulle linee dei permeato ci ha permesso di seguire il processo in contin uo ed in tempo reale. ii controllo on ilnew della resa del proc esso è importante nella fase dl ricerca e studio per consentire la correla zione del parametri chimico-tisici con la resa ldroiitica del proc esso, ma anche nella fase produttiva dove i’acquisizione in contin uo di dati relativi ai processo ne consente l’automazione. Questo siste ma 6 basato suiia stessa reazione enzimatica dell’enzima 600 citat a neiie pagine precedenti,accoppiato con un sensore elett rochimico per l’acqua ossigenata (2) posto in una cella a flusso, in figura 15 è riportato un tracciato registrato durante una fase dei proc esso. La concentrazione di glucosio misurata con questo sensore in continuo è paragonata con queiia misurata con un metodo di riferimento enzimatico su frazioni di permeato raccolte ogni 90 minuti . tr,rìte t’jsensore 0 o D c’J LQ o -J O o o -J 0 L -; Pev.rairsJzja. : L’i LL’ie. 4 pei Sl!1SQ1iO.uIO*Qttfl la.LItJdnl’cLjtcI csligti sJa..setlne e Jji_cpMloyo .dtsin binxnunrtssl.Lulere.. Le tecnoloqie lnnoveth.’e basate su processi fermentetivi, sono probabilmente quelle che, accento e tosti irrisori delle materie prime, spesso costituite de materiali di scarto, producono sostanze pure con un minore dispendio di energie poiché utiiineno ceppi betterici selezionati per le trasformazione fermentatlve richieste. Un esempio è costituito dalle degradazione enzimetice delle cellulose che fornisce prodotti chimici essenziali come glucosio de cui combustibili e chemicals. Inoltre le cellulose è il più diffuso composto organico polimerlco naturale e la disponibilità In ogni parte dei mondo e la rinnovebliltà la pongono come un materiale di notevole Interesse energetico, anche per motivi ecologici. Le conversione enzimetica dei ceiloblosio, un disaccaride intermedio delle idrolisi dl materiali cellulosici, condizione le fettibilità tecnico-economica dei processo complessivo di idrolisi fino a glucosio. Un bioreettore ad attività ceiiobiaslce specifica applicato dopo la fase di idrolisi in batch”, favorisce le cinetice dl trasformazione del celioblosio (inibitore delle cellulesi) e riduce quindi li consumo di questo enzima il cui costo incide per oltre li 607. su queiio complessivo schematlzzato in fig. 16. i reattori sono costituiti de fibre poilsoifoniche cave permeabili ai reegenti ed ai prodotti me non elie cellule; il processo è condotto in flusso continuo. L’aspetto reattoristico dei processo è dei tutto enelogo a quello incontrato nei paragrafo precedente. Peremetri fisici quell le velocità dl flusso, ia temperature e le pressione influiscono In modo determinante sulle rese e sui tempi dei processo. li probleme che si pone e chi lavora in questo settore è allora di ottimizzare le condizioni fisiche e geometriche dei reettore seguendo in continuo le concentrazione dei prodotto (il glucosio) delle ferm ente zione. Per monitorare le produzione del glucosio della cellulosa si è studiato un biosensore per la misura dei glucosio in presenze di ceilobiosio ad alta concentrezione (10 glI). In questo ceso si è risolto il problema delle impurezze degli enzimi ai fine di ottenere un biosensore specifico. impurezze quell emilesi, maltesi, Invertasl e D-galattosidesl normalmente presenti nelle preparezioni commercieli dell’enzima giucosloossidesi, devono essere assenti per ottenere un comportemento linere dei sensore a glucosio E’ ctetn nWndi utilzzfi ner essernbie: Il er,sorc, un enzime ti,, ,.‘rnssIds’... uiifitetc’ —., t..cjInIiz ‘p”,”e!ere ,fl r ctt 44 continuo li glucosio prodotto dal reattore enzlmatlco a celloblasl e confrontare i risultati con quelli ottenuti con un metodo dl riferimento (Flg. 17) (ze). La saccarlflcazlone enzimatlca della cellulosa appena vista ha molte analogie con la Idrolisi degli amidi o delle pectlne. La trasformazIone dell’amido a glucosio e l’idrolisI della pectlna ad acido metilgalatturonico consente, in alcuni processi industriali di aumentare Il valore aggiunto dei prodotto a beneficio dell’industria agroalimentare. Flg. 16 Schema di processo per ridrolisi della cellulosa, c eitulose bali UF modul e glacose eiecrcde explcsicn me s ug a r s REM HF BIOREACTCR ceLlase y e as t ceils (om re one tro lo determirozione on Une del Fq. 17 giucosio (lineo continue) ed un metodo di riferimento utiHzzeto per cempioni pre!eueti doNefifluente e tempi determinotL FU tempo contressegneto con uno freccle Io concentrezione del glucosio eumento perchè H reottore uiene eflmenteto con uno so!uzlone o concentrezione mogglore dl cefloblosio. o imentore biosensori stonno trovondo Rnc[ e nel compo Interessonti oppilcozioni; per le loro carotteristiche dl semplicità di uso specificità, sensibilità, occurotezzo e rapidità, le analisi condotte con biosensori elettrochimici bene si adottano alruso in laboratori per Il controllo di qualità degli nlimentL 4 3 1) nel latte ApplicazIoni recenti nei settore lattiero dimostrano come lunghe e laboriose determinazioni possono essere condotte in breve tempo e, in taluni casi, con maggiore accuratezza con biosensori del tipo descritto nello porte introduttiua. E il coso dello determinazione del lattosio (29-31), disaccarIde presente nel lotte in concentrazioni comprese tra i! 45 ed il 5% La determinazione analitica cli questo zucchero si pone come utile strumento per stabilire lo freschezza di un latte o la sua genuinità e per prevenire trattamenti fraudolenti (aggiunto di acquo o dl lotte non fresco, conservazione e/o trasporto in autobotti non refrigerate ecc.J. Il controllo di questo parametro è Importante non solo al momento dello commerciolizzazione dellolimento ma anche, e soprattutto, al momento dello raccolto do porte delle centrali del lotte, presso i singoli produttori, Linuecchiomento di un lotte, dovuto ollozione dl batterI le cui vie metobotiche utilizzano il lattosio producendo acido lattico, può essere messo in evidenza misurando il pi-I, le concentrazioni di lattosio e di acido lattico. L’esistenza di diversi metodi per la verifica dello freschezza del latte è necessaria per prevenire il rischio di adultera zio n i A questo proposito è stato sviluppato un biosensore elettrochimico a lattosio che costituisce un interessante esempio di immobilizzazione asimmetrico di due enzimi su sensori elettrochimlcl. Su di una faccia della membrana è Immobilizzato l’enzima -golattosidosi che idrolizzo il lattosio in glucosio e galattoslo: Lattosio -- -f3--gaIattosidasi---’-> Glucosio + Galottosio li glucosio prodotto da questo reazione diffonde allora attraverso la membrana incon rando un secondo strato enzimotlco 4 CJS Itu tu da g cosioossidasl che secondo lo bcn n’ta reazione, riveloto essere nuò he ussqenotn cndue ocquo r o m p cm e t ri c o m e o te In questo modo è stoto re&izzoto un sistemo omperometrico o flusso per lo misuro del lottosio in compioni dl lotte; il sistemo non ricluede, controilomente ai metodi ufficiali (titrimetrico, spettrofotometrico) alcun pretrottomento (deproteinlzzozlone, centrifugazione, incubazione) e consente I analisi di circo 20-30 c omploni/oro. Poichè, come si è detto, l’azione metobolico dei batteri lattici produce uno considerevole quantità di acido lattico (10-50 mmoli/litro) abbassando il pli dell’alimento, l’uso di un biosensore specifico per tale substrato (I?) del tipo descritto nello sezione 4.L4 può rappresentare uno utile alternativa alla misura del pi-I; lo determinazione del pli infatti è poco indicativo poichè tale parametro può essere facilmente modificato mediante r aggiunto di bicarbonato sodico, Nello Fig. 18 (pag. seguente) è rappresentato l’andamento dei due parametri (pli e concentrazione dell’acido lattico) di un latte intero nel tempo. In essa si può vedere i effetto dell’ossigeno e del pli sullo crescita batterica ed anche che io misuro dello concentrazione dell’acido lattico può rappresentare un metodo più sensibile e più diretto per stabilire l’età’ di un latte. Nello Fig. 19 è invece riportato un esempio della costruzione di uno retta di toraturo e delle misure condotte su campioni reali, mentre, in tabella 6 sono confrontati i risultati con un metodo di riferimento spettrofotometrico enzimotico basato suwenzima lottato deidrogenosi, che richiede lo deproteinizzazione del latte e lo termostatozione a 37°C per 30 minuti per completare la reazione enzimatica. In tabella 7 sono invece riportati i risultati di misure di acido lattico in diverse specialità lottiero-casearie (creme di formaggio, goghurt e lotte in polvere) (33) Fig. 18 4 20 Campione di latte fresco Variazione di pH e lattato, dovuta alla azione batterica. Conservazione a 37°C. STIRR agitazione per aumentare disponibilità di ossigeno. ADJ. aggiustamento del pH a 7,03 I lo 1’ 1’ STRR 20 h ADJ Fig. 19 Valori di corrente registrati con standards e campioni di latte diluiti 1:200 05 nA 4 mn caflbr I on 5 a mp o a 7 8 dUutlon) 9 50 Tabella 6 - (concentrazione dei lattato in mmol/lltro) campione n metodo nt. (Y) biosensonl (11) Errore?. 1 1.52 1.55 -0.7 2 1.77 1.75 +2.3 3 1.04 1.09 -4.8 4 5.69 6.10 -7.2 5 1.15 1.10 6 9.85 9.20 +6.4 7 19.60 19.10 +2.6 8 1.28 1.22 .4.7 9 1.49 1.38 +7,4 Y—-0.1 + 0.9814 -0.997 2 r Teb elIo 7 Concentrozlone di 1-lo ttnto In siero e derivati del lette misurati con li ‘lucoprocesseur dotato dl un elettrodo o lattaio. campione dl siero tremo formaggio goghurt semplice (o) polvere ricostituita e dolce acido 1.23 24.40 e b c 1-lottato (m?’l) 5.20 8.05 2.56 0ev, Standard 0.08 0.11 0,07 1.40 0,94 1.60 0.01 0.80 D.S.R.() 1.5 1.3 2.7 1.4 1.1 2.1 1.2 3.2 (o) soluzIone 20 g/i Le misure sono lo medio di 6 repliche o-b-c Indicano campioni differenti 99.0 83.7 b 80.6 lo sufluppo delle biotecnologle e delle tecnologie dl membrana ha permesso, In questi ultimi anni, la creazione di nuove specialità nell’industrie casearia, tra le quali il latte a basso contenuto di lattosio ottenuto per idrolisi enzimatice dei disaccaride, Questa specialità è un alimento e basso contenuto celorico, più dicieribite, adatto per alimentezioni dietetiche e per particolari individui che mostrano difficoltà digestive nei confronti del disaccaride, Il controllo di qualità di tele alimento è perciò un problema analitico risoluibile con sensori a glucosio dei tipo descritto nella sezione 4.1i. E’ stato proposto un metodo olternetivo (1 6) per la determinazione del lattosio, che consente l’analisi in flusso anche dei glucosio. In questo caso l’enzima 3-golattosidasi era immobilizzato In un piccolo reattore a fibre polisolfoniche cave dove avveniva l’idrolisi del lattosio e che consentiva l’analisi del disaccaride secondo le reazioni descritte In precedenza. L’enzima glucosìoossidosi era invece immobilizzato sul sensore ad acqua ossigenata e, mediante un rubinetto a quattro vie, era possibile compiere analisi di glucosio o lattosio semplicemente escludendo,o meno il reattore (Fig. 20) hg. 20 Determ nozione dei lottosio e o glucosio con un ettot. LnzmotILo ed uii ensore o glucosio P SCARICO CAk’pIONr R reottore fr-go!ottosidosi; P = pompo peristoltico; T voWolo o 4 ule; S = sensore; UR. = omperometro e registrotore N8 Il reottore è incluso solo per lo determinozione del lottoslo rterrnlo oziono eH e’in in von oiIment Uno recente opplicnzione dei biosensori in compo olimentore è Io determinazione delta lecitina in vari alimenti utilizzando un sensore o colino (33). li metodo utilizzato consiste in due steps di reazioni: nel primo lo tecitino viene Idrotizzato dall’enzima fosfolipasi 0, poi lo colino prodotto vieno determinato con un sensore a colino preporoto immobitizzando io co:lnoossldasl su un elettrodo od ossigeno. Nello tabella 8 sono riportati I risultati ottenuti in vari composti quello con e omperometrico metodo il con alimentari spettro foto metrico. Comparazione dei risultati ottenuti in differenti Tabella 8 alimenti per lo concentrazione di lecitina (ogni valore è la medio di tre de te rm in ozio n i). - Alimento valore trovato (o) valore trovato (b) [b (% in peso) metodo enzimotico o m pero metri c o (% in peso) metodo enzimatico spettro fo t o metrico L forino di solo 9.06 cioccolato 1.69 12.0 1.92 0 -oh? o J +32.5 +13.6 35.4 32.6 -7.9 dolci 4.30 5.30 +23.3 biscotti 0.26 0.29 olio dl sola 0.19 0.19 tuono d’uovo 0.0 Un ulteriore settore che potrebbe rìsultere di estremo interesse per io sviluppo dello ricerco nel cempo del biosensorl è quello delle problemetiche relotive olle anelisi per il controllo dell’inquinomento ombientele. E’ lecito prevedere lo possibilità di utilizzore i biosensori per lo determinozione di composti opportenenti o diverse dossi; qui di seguito viene descritto uno delle possibilità più interessenti: lo determinozione di composti orgeno-fosforici (con perticolore riguordo etto desse degli esteri fosforici utilizzoti come Insetticidi). Questi composti sono di estremo interesse poichè olcuni di essi bonno un tergo impiego come insetticidi e quindi fonno porte dello desse generole dei pesticidi che negli ultimi onnl ho creoto problemi non indifferenti per lo selvoguordio dell’ombiente. li continuo oumento nello utilizzezione dei pesticidi ho generoto un incremento di sensibilità verso gli espetti sonitori e di conteminozione ombientele che potrebbero soprottutto derivere do uno insufficiente tutelo delle ocque potenziolmente destineblli al consumo umono. Si rendono dunque necessorie un numero sempre meggiore di onelisi di controllo che tengono conto dello gronde varietà di inquinonti e dei loro metoboliti potenziolmente tossici. 1a presenze di questi composti a livelli di concentrezior,e ossei bassi richiede lo disponibilità di tecniche enoiitiche di notevole sensibilità ed occurotezzo. 4.4.1) Cerihl generoli sullo determinozione dl compostI orgono-fos forici Lo strutture bose degli esteri fosforidi utilizzati come insetticidi è lo seguente: 0(S) RO \// X=varie ,O-PhNO (OR) R’ /\ X ‘ned e te trattamen i con o es e c. ‘cceierc t azio’ esime. p1 idina-aid cima n’e’. (PRM) ‘ .uro (39) c idross cnmina (40). La inibizione e la riattlva7ione dell enzima sono mostrati delle seguenti reazioni: Le En: 5t Cd.)lOp OR inh&b oq, tcn —e.* taz Gli, e òoa, OR, ti CN-0HEn:—Ser-O-p” fl”CR: (PAn) reaceivatsop -s tn:-Ser—OH PAN - 8’ OR, Sulla base delle precedenti osservazioni si è dunque sviluppato un campo dl ricerca per la messa a punto dl blosensorl basati sull’accoppIamento con enzimi Immobillzzatl, per la determinazione degli lnlbltori della collnesterasl. E’ In prima approssimazione Impossibile distinguere tra I singoli Inlbltori quando presenti In miscela nello stesso campione, ma può essere Interessante considerare la procedura per misure dl IndIcI dl tossicItà (41). Il metodo è In generale semplice e molto sensibile In confronto ad altre tecniche anelitlche e può essere usato In sistemi a flusso per misure In continuo (42). E’ Inoltre, In linea teorica, possibile utilizzare delle tecniche di separazione (cromatografla) a monte del sistema (blosensore) per dlscrimlnare I vari Inlbltorl e determlnarll singolarmente. SI possono utilizzare vari sistemi elettrodlci basati su principi diversi per la costruzione dl un sensore con enzima Immobilizzato. La ImmobilIzzazIone dl AChE su dl un elettrodo a vetro permette, medIante la reazione (a), dl seguire la inibizione dovuta al residuo del pesticlda mediante la variazione dl pii. lmmobllizzando l’enzima colme ossldasl su nglon fissato ad un sensore per acqua ossIgenata (platino polarizzato a 0.6 1) vs. Rg/AgCi) si può seguire lo stesso fenomeno di InibIzIone mediante la seguente coppia di reazioni: estere colme ollna • 2 02 > collna + acidi —-coilresterasl ->betalna + 211202 coira ossidasi 1120 -—- — - -- L stesse prop ieta tossic’w I questi composti hann portato, q’a da 9olto temp’ ella i- troduz,on di varie tecniche biochimicl’e per ia loro individuazione e determinazione quantitativa (34-37) L’azione base degli esteri fosforici è associata con le loro capacitè di inibire le colinesterasi (AChE) nei sistema nervoso centrale e periferico, dove l’enzima gioca un ruolo importante nelia trasmissione deil’impuiso nervoso (38). Le reazione (a) può essere scritta nei seguente modo: CH, - C O — — CH, - CH, —CCH,) 3 fg!. CH, - 0 HO COO - CH, - CH, -?(CH,), . Sulla considerazione di questo meccanismo si è sviluppata la ricerca per le realizzazione dl un sensore per la determinazione analitica di questi composti. in Fig. 21 vIene mostrata la risposta dl un sensore ad fiChE lmmobiiizzata per varie concentrazioni di pesticidl organo-fosforici. % Inibizione 100 -«e 80 60 40 20 10.1 a io’ MethyI-Parathion .Malaihion oEthyl-Parathion Fig. 21 - ioM • Paraoxon curva di caiibrazione di un sensore ad RChE per la determinazione di pesticidi; La inibizione della fiChE è in una certa misura permanente e la attivitò no i ritorna st or tar eamcnte se non dopo iunghi pertodi. Elettrodo a BuChi (butirriicjffi.gsterasi) ner la dejexin!poztontfil .nsilrWI organo tpjjorict 4 4 ) Come esempio di applicazione in questo tempo prendiamo In considerazione un elettrodo e BuchE (43-46), sui quale sono stati condotti diversi esperimenti per una corrette vaiutezione di tutti i parametri che possono influenzare la determinazione analitica. Prendendo come esempio ii Pnraonon è stato condotto uno studio per valutare ia risposte deii’eiettrodo a BuChE. E’ stato scelto ii Paraoxon perché suiia base deiie DL è riconosciuto come uno dei più tossici tra i pesticidi organo—fostorici. Si riportano ie torme ossidate deii’Ethui Parathion e dei Methgi Parathion: MiO O LO O Ed 2 ‘b.’o Me Paranzon methvl. Parnoxnn ethyL — Fig.22: risposta deii’eiettrodo a BuChE per: concentrazione di ParaoHon 2w io M tempo di incubazione della membrana neiia soluzione di Paraowon 30 minuti diverse concentrazioni di substrato tampone tostato a differenti concentrazioni (pH 7,2) temperatura 22C membrana : 4 unità di BuChE — — — :. 5 WM. A prima .vt... I depo e I .‘• t,z,’ne — • — •.•I —-e • :‘ 40 itt s tobu o lo r ercentuole di Inibizione, si noto che effetto inibitore aei PorooHon e omplificoto quondo si Icuoro od uno concentrozione di substroto devoto. Conviene dunque utilizzore uno concentrozione di substreto piuttosto devote, pur rimonendo nel 2 ) tempo di Hneorità ( iO Tebelle 9 Relazione tre la concentrazione dl substrato e percentuale di inibizione BuChE % di inibizione 1 0 OLI OLi - OLIO 5H10 5 I1O 1H1O 2 5H10 O 17 63 66 ove 0110 = risposto deirelettrodo ol substrato DLII = risposto dopo la inibizione dello membrane enzim E’ estremamente importante enche Io concentrazione dell’enzime come si può rilevare dello Fig. 23 Fig. 23 Influenze dello concentrozione sensibilità delle risposte dell’elettrodo ol PorooHon ‘ dell’enzimo sullo 5 H M 2H 10 H 8 inibizione i 00 8 1 ‘o ‘o 2’ ‘enzima) .4 possono inflns re aefle on.idera7Icni sulle clnetaa di nib’zlone ufla hfiuenn del pH. l’i yrnareie si ruò affernsie Ciw la iniblzionc. e p u efficace a p1 leggermente basico. Per i tempi dl incubazione, dopo prove da 10 a 40 minuti, si può affermare che un tempo ottimale dl incubazione è di 30 minuti i Fig 24: curva dl taratura dl una membrana a BuchE in funzione dl concentrazioni crescenti di Paraonon. tempo dl incubaz!one : 30 minuti tampone fosfato iir 2 M , pH — 7,2 conc. di lavoro In substrato:102 tel caratteristiche di membrana : 4 unità di BuChE temperatura : 22C - - - - - v i (wfl 6 6. 4U (o. (Praoon) 1(M). 4,4.3> IorenofosforlcI Dopo Io estrozione del principi attivi dal campione ( o direttamente sul campione ) si può determinare l’attività antlcolinesterosico, I volori potrebbero essere ventoggiosomente espressi in equivalenti inibitore di riferimento ( si può utilizzare come rifer!mento i! Porothion, e quindi equivalenti Porothion”, come pure si può prendere come riferimento un altro pesticida orgonofosforico ). In pratico si assume che nel campione in eseme sia presente uno quantità cli sostanza di riferimento tele do causare uno inibizione equivalente e quello dello quale sono responsabili I composti anticolinesterasicl effettivamente presenti e dosabili nelle condizioni sperimentali riportate, Questo tipo di valutazione biochimico, olio quale concorrono in misuro diverso i vari ontico!inesterosici presenti nei campione, è comunque un indice estremamente interessante do un punto di visto tossicologico per effettuare corrette valutazioni sul campione in esame, E infetti possibile valutare, porellelemente allo Identificazione del singoli rappresentanti di uno classe di composti (ad esempio gli insetticidi organo-fosforici) mediente tecniche ges-crometogrofiche, le effettive incidenza cli queste classe di composti sulla attività anticolinesterasica totale del campione. Del punto di vista della valutazione tossicologico si riportano qui dl seguito alcune considerazioni tratte da una breve rassegno bibliografico di LeonI (35) su quanto proposto do diversi autori per questo tipo di indagii. llieiss (1959,1964 e 1965 ) come criterio di giudizio ha proposto di utilizzare il % di inibizione della colinesterasi del cervello dei pesci; questo metodo, benchè utilizzato in qualche studio di inquinamento da esteri fosforici ( Williams,!966; !iofland,1967 ) e carbammici (Lowe,1967) risulta complesso e soggetto a diversi errori in quanto è difficile stabilire il livello di riferimento standard della attivitò onticolfnesterasica, che varia, oltre che con la specie considerata, anche con la zona del cervello che può essere prelevata e con la stagione (Gibson et aL,1969) Un criterio valido per una valutazione tossicologico potrebbe anche essere quello proposto da tJavis e P.lalanay (1967 ), ossia di considerare 11 % di inibizione della attivitò anticolinesterasica ottenuta da plasma umano, eseguendo la prova in condizioni standard su estratti dl acque potabili; è comunque necessario reperire l’enzima nilo stato puro per una corretta determinazione. ‘ ‘ Lon le tecniche occennete, comur que non e possibile alcuna d,fferenzia7,one qualitativo tra I diversi inibitori della colinesterasi, Per questi motivi è stata introdotta la cromotografio su strato sottile con evidenziozione enzimatico e chimico (Leoni, 1969,1971 ). Diversi AR. hanno infatti proposto questa tecnica per la valutazione, soprattutto negli alimenti, dei residui di esteri fosforici; la evidenziazione chimico del principi attivi ( Baumier e Rippstein, 1 961 ; Wolker e Beroza, 1 963; Bunyon, 1964; Kouacs, 1964; Helchlorrl e coI!,, 1964; Fischer e Plunger, 1965; Watts, 1965; Quaranta, 1967; Guth, 1967; Rogob,1967 o,b; Fischer e Plozer, 1969; Askew e co!!,1969) pur potendo dare informazioni sullo presenza o meno di determinati gruppi atomici nelle sostanze cromatogro fate è tuttavia meno sensibile e significativa della evidenziazione enzima tica. In fatti tale tecnico cli rilevamento delle macchie ( Bungan, 1964; El-Refai ed Hopklns, 1965; Winter!fn e co!,’., 1968; Schutzmann, 1968; Mendoza e colI., 1969 a,b ) deve essere considerato più specifica della evidenziozione chimico ed avente un grado di sensibilità pari ed In qualche caso molto maggiore della gos-cromatografie con I vari rivelatori. ? tIueerlautlli z z azionijLbIosensor mbientole 4,4,4 fin certo numero di sostanze organiche naturali di origine vegetale ( soprattutto alcaloidi , in generale sprovviste di azione insetticida, ed altri in’ejuinanti chimici, sono inibitori della colinesterasi del siero umano. Lei diffusione di queste sostanze nell’ambiente (in particolare nelle acque ) non è esattamente nota, me i metodi che attività determinazioni della esclusivamente utilizzano anticolinesterasico come criterio di giudizio per i! grado di inquinamento causato dalla utilizzazione in agricoltura cli esteri fosforici o corbammici, ne restano compromessi. V’altra parte non è sempre garantita ia identificazione analitica di molti dei prodotti di trasformazione e degradazione ditali pesticidi dotati di attività anticolinesterasica, e ciò soprattutto ne! caso di indagini di una certa uastità e che implicano numerose determinazioni, Esiste però la esigenza di identificare almeno i principali responsabili dei fenomeni di inquinamento, per avere indicazioni sui provvedimenti più opportuni che è necessario intraprendere, mentre è anche indubbia l’utilità di valutare la carica antico!inesterasica totale de! campione in esame. “Leoni (35) La ricerca su questo tipo di indagini analitiche ha subito negli ultimi anni un rallentamento per le difficoltà in parte accennate. In definitiva con queste tecniche dovrebbe essere possibile valutare più correttamente lo stato cli inquinamento da esteri fosforici ed accertare che ne sono responsabili prodotti dei quali spesso sono sottovalutote le caratteristiche cii persistenza nell’ambiente. Rispetto alla rassegna bibliografica precedentemente riportata, I’ introduzione dei sensori cui questo testo fa riferimento e lo sviluppo delle tecniche cromatografiche (in particolare modo [IPt.C ) abbinobili, dovrebbe consentire il superamento di una serie di problemi prima seriamente limitanti per Io sviluppo di queste metodiche di indagine biochimica. MiaI 4iiCi1 Le breve ressegne proposte he come scopo quelle dl evidenzlere le enormi potenzlelltà d sviluppo delle ricerce nel cempo del blo sensori. Gli esempi rlportetl nel peregrefi 4.1 (MedIcine), 4.2 (IndustrIe), 4.3 (Rllmentezlone) illustreno le grendi potenzlelltà del medietori biochimici eccoppleti con sensori elettrochimlcl. In questi cesi è stete messe In evidenze une ceretterlstice pecullere di teli biosensori che, non richiedendo elcun pretrettemento del cemplone, rendono possibile un’estensione e semplici sistemi In flusso continuo permettendo quindi li monitoreggio e i’eutomezlone di epperecchleture biochimiche cliniche e dl processi blotecnoiogici. in cempo medico le commercieilzzezlone di un pencrees ertificiele ( Slostetor, Beteiike) beseto su un sensore e glucosio testimonie i’eite ettidebilità dl questi sistemi. Reletivemente e questo settore nuove ricerche stenno producendo i presupposti per un ulteriore sviluppo dei sisteme pencrees con controlli sempre più eseustivi del quedro clinico del peziente (controllo multisensore) e le possibilità di mlnieturizzere il sisteme rendendolo tresporteblie, semplice ed economico, per uso domestico e non più ospedeliero. Nei cempo delle blotecnoiogie il controllo del processi vie biosensore ne rende possibile l’eutomezione. i biosensori stenno infetti trovendo potenzieii epplicezioni leddove processi in continuo richiedono un controllo In linee ed in tempo reeie. Nel settore elimentere il controiio dl queiltà del prodotto industrlele e delle meterle prime richiede nuovi metodi enelitici doteti oltre che dl selettività, precisione ed eccuretezze, enche di semplicità, repidità di esecuzione, economicità dl epperecchieture e reegentl. Quento riporteto nel peregreto 4.4 (Rmbiente) mette in evidenze le reeiistiche potenzielità dl questi sensori in un cempo nel queie, e nostro evviso, henno evuto fino ed ore, per veri motivi, une iimitete eppilcezione. Le possibilità dl ricevere oltre el deto eneiitico enche indicezioni dl tipo tossicologico è senze dubbio l’espetto più interessente in questo settore. Tele possibilità derive dei tetto che le determinezione enelitice strutte proprio il meccenismo elie bese delle tossicità dei composti in eseme. Tutto questo neliottice dl giungere e considerere i problemi riguerdenti I inquinemento embientele non solemente con l’eusilio di numeri reietivi elle indegini enelitiche me in un contesto più empio nel quele troveno posto enche veluterlo il più complete, sino e giungere 65 elridentlrlcezlone dl indicI dl rlschio eventi più profondo slgniflceto (47). Questi poi dovrebbero Includere enche tests tosslcologlci, i rlsulteti dei quell dovrebbero essere enellzzetl perellelemente el rlsultetl delle determlnezlonl enelltlche (48). In conclusione, per quento concerne I blosensorl, si può veremente effermere che Il limite è costituito delle fentòsle del ricercetori, mentre d’eltre perte molte scienze guerdeno el rlsultetl dl queste tecnologie cercendo dl risolvere problemi eneiltlci entichi, problemi nel quell.mlsure lunghe e leborlose possono, In elcunl cesi, essere sostItuite de un semplice “probe”. i I, i 2 3) LyOS L. 1rk, Arìn 962) Y Acaì 5c 122.. 2 6.6. Guilbault Anaiticai Uses of mmobHLi Enzymes Marce I Dekker Pjbh1. 984 J.D. Czaban 345A (1985) Anal. Chem. DA. Rechnltz Anal. Chem. 54, 11 94A (1982) M. Masclni, M. Iannello, 6. Palleschi Anal. Chim. Actajla, 65(1982) N. Welikl, FS. Brown, E.C. Dale Arch. Biochem Biophys 1 131 (1969) W,R. Wieth, 5.5. Wang, R. Saini Biotechnol Bioeng. j.., 565 (1973) P,R, Coulet, J.H, Julllard, DC. Gautheron 1055 (1974) Biotechnol Elioeng. D.J. Inman, W,E, Hornby Bìochem.J. IZ9. 255 (1972) M. Mascini, M. lannello, 6, Palleschi Anal. Chim Acta 145, 213 (1983) R. Axen, J. 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