Lorenzo Della Maggiora

Analisi della variabilità genetica
mediante marcatori molecolari in tef
•
Lo scopo dell'esperienza consisteva nell’osservare la variabilità
genetica e fenotipica di una collezione di varietà di Eragrostis tef, il
principale cereale coltivato in Etiopia
•
La tecnica della PCR (polymerase chain reaction) è stata utilizzata per
individuare differenze nella lunghezza di marcatori SSR (microsatelliti)
Lorenzo della Maggiora
Cusmibio 21-25 Luglio 2014
Tutors: Enrico Pè, Matteo dall’Acqua, Edoardo Bertolini
Fasi dell’esperienza
1. Analisi fenotipica
2. Estrazione del DNA
3. Amplificazione dei
marcatori con PCR
4. Elettroforesi su gel di
agarosio
5. Analisi dei dati
Cusmibio 21-25 Luglio 2014
1. Analisi fenotipica
Abbiamo osservato in 11 varietà di tef i seguenti
caratteri:
• Tipologia dell’infiorescenza (ramificata aperta, ramificata, ramificata
compatta, senza ramificazione)
• Colore dell’infiorescenza (chiara, scura)
• Portamento della pianta (cascante, semi eretta, eretta)
• Altezza della pianta
• Lunghezza dell’infiorescenza
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2. Estrazione del DNA
Procedimento fisico-chimico che permette l’estrazione di acidi nucleici dai tessuti vegetali
1.
Macinazione della plantula in azoto
liquido
2.
Aggiunta di soluzioni di lisi per distruggere
le membrane cellulari
3.
4.
Precipitazione in centrifuga e
filtrazione surnatante
Aggiunta di una soluzione di legame alla soluzione
composta da DNA e altri residui minori
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5.
Legame del DNA alla membrana di silice
6.
Lavaggio con soluzione contenente etanolo
7.
Eluizione per raccogliere il DNA purificato
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Elettroforesi su gel di agarosio
per rilevazione DNA
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Preparazione del gel
Inserimento dei campioni nei pozzetti
Corsa elettroforetica con intercalante
Analisi qualitativa e quantitativa del DNA estratto
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3. Amplificazione dei marcatori con PCR
• Preparazione di una mix di
buffer e MgCl2, dNTPs, Taq
polimerasi, acqua e primer
specifici (forward e reverse)
• Preparazione della piastra per la
PCR (campioni in colonna,
marcatori in riga)
11 campioni
13 marcatori
Totale 143 reazioni
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4. Elettroforesi su gel di agarosio
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I campioni amplificati con la PCR vengono separati su un gel
La differente altezza delle bande ottenute per ciascun marcatore
in ogni campione è indice di una diversità allelica (si usa un
DNA ladder come riferimento di lunghezza)
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5. Analisi dei dati
la differenza allelica nei microsatelliti dipende dal
numero di ripetizioni
CNLTs 91
200
1 2 3
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CNLTs 328
Digitalizzazione dei dati fenotipici e genotipici
Analisi delle componenti principali (PCA)
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balami
gea lamie ada
alba
dabbi
beten
dz-d1-354
gommadie
red dabi
addise
enatite
Dati fenotipici
C’è una parziale corrispondenza dei
due dati:
I marcatori (anche se non
direttamente) sono buoni descrittori
della diversità fenotipica
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Dati
molecolari
Grazie per l’attenzione
Cusmibio 21-25 Luglio 2014
Prospettive applicative
Lo studio della variabilità genetica in una specie vegetale è il
primo step per il miglioramento genetico
I marcatori molecolari possono essere impiegati per
localizzare i geni associati a determinati fenotipi. È necessario
uno studio su un grande numero di individui ricombinanti e
l'impiego di migliaia di marcatori
Il risultato è una selezione di piante con i genotipi adatti a
produrre i fenotipi richiesti (piante resistenti, erette, produttive,
ecc)
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Fasi della PCR
94°C per 3 min
94°C per 30 sec (denaturazione)
64°C per 30 sec (annealing del primer)
72°C per 30 sec (azione della taq)
Ripetizione delle 3 fasi precedenti per 20 volte
72°C per 7 min
Mantenimento a 4°C
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