microRNA

microRNA
Cinzia Di Pietro
Dipartimento GF Ingrassia
Biologia, Genetica e Bioinformatica
G. Sichel
Università degli Studi di Catania
[email protected]
I MicroRNAs (miRNAs) sono dei piccoli
RNAs non codificanti (21 – 25 nucleotidi)
che regolano negativamente l’espressione
genica a livello post-trascrizionale.
Regolazione dell’espressione genica
DIFFERENZE TRA TRASCRITTOMA E PROTEOMA
elettroforesi bidimensionale di proteine
Microarray di cDNA
Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Riconoscono e si legano a sequenze localizzate
nelle regioni 3’ non tradotte (3’UTR) di specifici
mRNAs ed effettuano un meccanismo di
“hetero-silencing” degradando il messagero
target o bloccando la traduzione.
•
• Lo stesso miRNA può avere come bersaglio
differenti mRNAs;
• Differenti miRNAs possono avere come
bersaglio lo stesso mRNA.
WHAT IS A microRNA?
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ~22 nt long
RNAs that can play important regulatory roles
in animals and plants by targeting mRNAs for
cleavage or translational repression.
By this way they can influence the output
of many protein-coding genes.
[David P. Bartel, Cell, Vol. 116, 281–297, January
23, 2004]
La regolazione dell’espressione genica
è alla base della complessità cellulare
La complessità di un organismo non
correla necessariamente con il numero
di geni
Create cellular complexity by differential genes expression
This form of combinatorial coding endows an organism with n genes to create, in
theory, 2n different cell-specific gene batteries.
This rationalization provides an easy explanation for the fact that the absolute
number of genes in a genome does not correlate with organismal complexity
Hobert (2004) TIBS
Hobert (2004) TIBS
La loro scoperta risale al 1993;
Il primo mi-RNA (lin-4) fu identificato in
C.elegans. Regola l’espressione di mRNAs
coinvolti nello sviluppo embrionale del nematode;
Successivamente furono ritrovati sia nelle
piante che negli animali
Oggi si ritiene che il numero complessivo di geni
codificanti per mi-RNA rappresenti circa lo 0.5-1%
del numero di geni codificanti per proteine
• Le sequenze nucleotidiche dei miRNA si sono
conservate nel corso dell’evoluzione;
• I loro geni possono essere localizzati sia in regioni
intergeniche che all’interno di geni di seconda classe (di
solito in introni o in esoni non tradotti;
• Molte volte troviamo cluster di geni;
•Vengono trascritti (RNA pol II) quindi in modo
indipendente o contemporaneamente al gene che li
ospita;
•Subiscono un processo di maturazione sia nucleare che
citoplasmatico.
miRNA GENOMICS: INTERGENIC; INTRONIC; EXONIC AND…
Zhao Y and Srivastava D, 2007
microRNA BIOGENESIS
Il processo di maturazione dei miRNA è estremamente complesso
TRASCRIZIONE
Pri-miRNA
MATURAZIONE NUCLEARE
Pre-miRNA
TRASPORTO NEL CITOPLASMA
MATURAZIONE CITOPLASMATICA
miRNA maturo
Generalmente i geni codificanti per miRNA sono
trascritti nel nucleo dalla RNA-polimerasi II che dà
vita a lunghi trascritti, i pri-miRNA, che presentano
il cap e la poliadenilazione.
Questi ultimi vengono processati da un’RNasi III,
Drosha,e dal suo cofattore, Pasha. Si ottengono
così trascritti di circa 70 nucleotidi, detti pre-miRNA
Successivamente le proteine RAN-GTP ed exportin
5 trasportano i pre-miRNA dal nucleo al citoplasma.
Un’altra RNasi III, Dicer, li processa per generare
molecole di RNA duplex di circa 22 nucleotidi.
Queste molecole vengono caricate nel complesso
miRISC(miRNA-associated multiprotein RNAinduced silencing complex).
I miRNA maturi a singolo filamento vengono poi
mantenuti all’interno del complesso.
I miRNA possono avere due modi diversi d’agire a
seconda della complementarietà che vi è tra il
miRNA e il suo target.
Complementarità perfetta: degradazione
dell’mRNA.
Complementarità imperfetta: blocco della
traduzione.
Il ruolo biologico dei miRNA è associato al ruolo dei loro mRNA target
Fraction of
miRNA target
Ligands
9.1% (3/33)
Cell-surface
receptors
31.2% (122/391)
Intracellular central
signaling proteins
18.8% (15/80)
Nuclear proteins
50.0% (19/38)
Cui Q. er al, 2006 modified
MAIN FUNCTIONS OF miRNAs
• Cell proliferazion;
• Cell death;
• Fat Metabolism
In Flies
(Brennecke et al., 2003; Xu et al., 2003)
• Neuronal patterning
In Nematodes
(Johnston and Hobert, 2003)
• Modulation of Hematopoietic
Lineage differentiation
In Mammals
(Chen et al., 2004)
• Control of Leaf and Flower
Development
In plants
(Palatnik et al., 2003)
microRNA FUNCTIONS: SOME EXAMPLES
miR-125b CONTROLS PROLIFERATION OF DIFFERENTIATED CELLS;
miR-181 IS INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF
MAMMALIAN HAEMATOPOIETIC CELLS TOWARDS THE B-CELL
LINEAGE;
miR-375 IS INVOLVED IN MAMMALIAN PANCREATIC ISLET-CELL
DEVELOPMENT AND IN THE REGULATION OF INSULIN SECRETION;
miR-143 IS INVOLVED IN MAMMALIAN ADIPOCYTE DIFFERENTIATION;
miR-1 PARTICIPATES IN MAMMALIAN HEART DEVELOPMENT
Dal ruolo biologico al coinvolgimento in patologie
Correlation analysis between DNA copy number alteration and miRNA expression.
Zhang L et al. PNAS 2006;103:9136-9141
Correlation analysis between DNA copy number alteration and miRNA expression. (A–C) Expression of mature miRNA
transcripts (by TaqMan miRNA assay) and DNA copy number of loci containing the specific miRNA (by aCGH) in 16
ovarian cancer cell lines. (A) Higher magnification of mir-15a and mir-15b maps. Each spot represents a cell line.
Expression levels of mature miRNA transcripts are presented in the upper lane as a heat map in 16 cell lines. DNA status is
presented in the lower lane (red, DNA copy number loss; green, DNA copy number gain). Cell lines are ranked based on
DNA status (leftmost, amplified; middle, normal; rightmost, deleted gene copy). (B) miRNA genes (n = 57) showing
concordance between DNA copy number alterations and miRNA transcript expression. (C) miRNA genes (n = 21) showing
no concordance. (D) Comparison of miRNA aCGH data from the present tumor set with expression data of 28 miRNAs
overexpressed in a different breast cancer set, as reported by Iorio et al. (50). miRNA genes with normal DNA copy number
are marked in gray; gains are marked in green, and losses in red. miRNA transcript overexpression (relative to normal
©2006 breast)
by National
Sciences
isAcademy
markedofin
pink; underexpression (relative to normal breast) is in blue (50).
microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG
32
I miRNA sono presenti in diversi fluidi biologici.
La loro espressione correla con specifici fenotipi patologici.
Possono essere utilizzati come biomarcatori non invasivi di
patologie.
Possono essere utilizzati a scopo terapeutico.
The MicroRNA Spectrum in 12 Body Fluids,
Clinical Chemistry (2010)
Jessica A. Weber,1 David H. Baxter,1 Shile Zhang,1 David Y. Huang.
Possono essere liberati da una cellula
dopo lisi
Possono essere secreti mediante:
Microvescicole (> 100 nm)
Esosomi (<100 nm)
DIAGNOSI
Analizzando il loro profilo di espressione nel siero di pazienti
e paragonandolo con controlli sono stati trovati
miRNA up o down regolati specificatamente in determinate patologie.
Possibilità di utilizzarli come marcatori precoci, non invasivi di
patologie
oppure
come marcatori di risposta a determinate terapie farmacologiche.
TERAPIA
Possibilità di inserire in particolari vettori e veicolarli in cellule
bersaglio:
miRNA sintetici (nel caso di miRNA specificatamente downregolati)
Antagomir (nel caso di miRNA specificatamente up-regolati)
Tecniche di laboratorio