Yeast Saccharomyces cerevisiae - ETH E

Dîs&ETH
ZX*3>
Diss. ETH No 10965
Transcription Dependent Chromatin Transitions in the
Yeast Saccharomyces cerevisiae
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZUERICH
for the
degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Giacomo Cavalli
Dipl. Université
Born
di
Parma, Scienze Biologiche
September 16th 1965
in
Cremona, Italy
Citizen of Italy
Accepted
on
the recommendation of
PD. Dr. Fritz Thoma, examiner
Prof. Dr. Theodor
Prof. Dr.
Koller, co-examiner
Timothy Richmond,
1994
co-examiner
-3-
Riassunto délia tesi
Le cellule eucariotiche sono caratterizzate dalla presenza di
grandi
dimensioni che richiede
un
alto
grado
di
genoma di
un
compattazione
per poter
nucleo cellulare. II DNA viene compattato
essere
contenuto nel
piccolo
tramite
l'awolgimento
in una série di strutture dette nucieosomi, fibre di
da
cromatina
nanometri
30
L'impacchettamento
preposti alio svolgimento
replicazione,
di
di
ai fattori di
superiore.
regolazione
enzimatici
complessi
ai
e
process! DNA-dipendenti quali la trascrizione, la
la ricombinazione
e
il
riparo del danno al DNA. Da ciô dériva la
nécessita di transizioni strutturali nella cromatina per
del DNA durante
ordine
in nucieosomi pone delle limitazioni all' accessibilité del
genetico rispetto
materiale
strutture
e
garanti re l'accessibilité
questi processi. Negli Ultimi quindici
anni una
grande mole
di ricerche è stata dedicata all' interazione tra le voluminöse RNA
eucariotiche
e
nucleosoma
e
polimerasi
i nucieosomi durante la trascrizione. L'analisi strutturale del
de I la RNA
polimerasi indica chiaramente che transizioni
strutturali nella cromatina sono necessarie, almeno transitoriamente, alio
scopo di permettere il
durante la trascrizione in vitro
assenza
e
ha fornito dati che variano dall'
in vivo
alia presenza di nucieosomi intatti
ha condotto
trascrizione
attraverso i nucieosomi
stampo. D'altra parte l'analisi della struttura della cromatina
DNA
presenti nel
passaggio della polimerasi
o con una
all'ipotesi secondo cui la stabilité
potrebbe
essere un
dei nucieosomi durante la
paramètre gene-specifico dipendente da vari
fattori, quali la sequenza del DNA, la RNA polimerasi, il
il locus
struttura alterata. Ciô
tasso di trascrizione e
genico.
Alio scopo di far luce sul ruolo di alcuni di
alia costruzione di
dalla RNA
geni artificial! di lievito in cui la
polimerasi
dalla RNA
questi parametri,
I
(Pol l-URARIB) nel
II
locus ribosomale del cromosoma
(GAL-URARIB)
nel locus LEU2 del
o
III.
I dati dimostrano che in cellule cresciute in presenza di
URARIB è represso
in modo
preciso
a
livello trascrizionale
nel promotore e nella
proceduto
stessa sequenza è trascritta
XII,
polimerasi
si è
e
cromosoma
glucosio GAL-
contiene nucieosomi
posizionati
parte in 5' della regione trascritta. II
posizionamento viene perso nel gene durante la trascrizione (in cellule
cresciute
in
presenza di
galattosio),
ma
un
saggio
basato
sul
ritardo
-4-
elettroforetico di DNA sottoposto a
crosslinking
lo
con
che durante la trascrizione i nucleosomi restano
legati
psoralene
ha mostrato
al DNA stampo. Questi
dati, confermati dall' analisi di geni naturali regolati dalla presenza di
galattosio quali GAL1, GAL10
polimerasi
induce
modello in cui
polimerasi
polimerasi
basato sul
dei nucleosomi
riarrangiamento
riassemblati
e
rapidamente
stessa. Diversamente dal gene
crosslinking
con
lo
psoralene ha
stesso modo che nei
geni
compatibile
seguenti
trarre le
posizioni
in
casuali
in evidenza che la
perdita dei nucleosomi alio
polimerasi
I si riflette nella
mentre la trascrizione della stessa sequenza da
II è
un
ribosomali naturali. Quindi la trascrizione della
sequenza URARIB da parte della RNA
polimerasi
suggeriscono
GAL-URARIB, il saggio
messo
trascrizione del gene Pol l-URARIB provoca la
nucleosomi,
e
ottameri istonici vengono transitoriamente destabilizzati dal
gli
DNA davanti alla
dietro alia
un
GAL7, indicano che il passaggio della RNA
e
con
conclusioni:
perdita dei
parte della RNA
la presenza di nucleosomi. Ciô
permette di
(i) la sequenza del DNA stampo
non
è
un
paramètre chiave nel determinare la stabilité dei nucleosomi nella cromatina
di
geni attivi. (ii) L'assenza di nucleosomi sembra
dei
geni
tipica
di classe I
dei
(trascritti da RNA polimerasi I),
nel
caratteristica
mentre la lore presenza è
geni di classe II. L'assenza di nucleosomi nei geni di classe
potrebbe dipendere da
I e il
essere una
interazioni molecolari
specifiche
tra la RNA
I
polimerasi
nucleosoma, oppure dalla compartimentalizzazione dei geni di classe I
nucleolo, che è
una
struttura diversa dalle altre
regioni nucleari dal punto
di vista fisico e biochimico.
Cosa accade al
cessare
della trascrizione? In che modo
tempo puô venire rigenerata la
struttura
glucosio (repressione
represso entre
evidenza che i nucleosomi vengono
da
glucosio.
indipendente
non
dalla
avevano
completare
cellulare
Di
il
istoni
il processo di
(2,5 ore). Questo
replicazione del DNA
sono
durante
o
in
repressione
sembra
dalla sintesi di istoni nei
la trascrizione.
D'altra
necessaria
suggerire che
necessarie per la
piccola parte di istoni che potrebbe
popolazione genica.
entra dieci minuti dalla
riposizionamento è
sembra
terreni
cromatina ha messo
riposizionamento
replicazione del DNA
perso
a
riposizionati quasi completamente sia
regione trascritta
conseguenza
galattosio
glucosio) il gene GAL-URARIB viene
da
qualche minuto. L'analisi della
nel promotore che nella
dopo quanto
tipica della cromatina inattiva?
Trasferendo le cellule da terre ni di coltura contenenti
contenenti
e
essere
geni che
parte, per
una
divisione
la sintesi istonica o la
deposizione sul DNA
essere stata
persa in
una
di una
parte della
-5-
complesso
Poichè il voluminoso
puô
trascritto nascente non
formato dalla RNA
polimerasi
topoisomerasi
negativi dietro
e
sono
trascrizione
grado di
in
topoisomerasi potrebbe
rilassare i
avère
all'ipotesi per
Il
(topl top2).
nei
ceppi
(topl),
o
il loro
riposizionamento
posizionamento
si è
da
II
in
seguito alla
proceduto allô studio
(top2)
o
geni codificanti
entrambi
gli enzimi
dei nucleosomi in GAL-URARIB viene perso
mutanti cresciuti in
crosslinking dipendente
topoisomerasi
la
galattosio,
Psoralene
non
il
ma
saggio
basato sul DNA
ha evidenziato alcuna
perdita di
nucleosomi; quindi l'assenza di attività enzimatica délie topoisomerasi
alcuna
causa
rispetto
trascrizione
riposizionati
come
ulteriore
dei
destabilizzazione
dei
nucleosomi
nelle cellule wild type. Contrariamente al
topoisomerasi
geni ribosomali:
Psoralene
mutanti
giri
di
cluster dei
in
mutanti
superelica
topl top2 si
consiste nella
durante
la
repressione
caso
di
da
glucosio,
GAL-URARIB,
ha effetti drastici sulla cromatina del cluster
topl l'accessibilité al crosslinking da
aumenta selettivamente nei
l'accu m ulo di
non
aile cellule wild type. Inoltre, i nucleosomi vengono
in GAL-URARIB entro dieci minuti dalla
l'inattivazione délie
alla
cui la funzione délie
délia struttura délia cromatina di QAL-URARIB in mutanti nei
I
di fronte
superawolgimenti dipendenti dalla
repressione genica. Per analizzare quest' ipotesi,
topoisomerasi
DNA,
ruolo nel determinare la stabilità dei
un
nucleosomi durante la trascrizione
la DNA
elica del
al
la stessa. La dimostrazione che le DNA
ha condotto
in vivo ci
doppia
superawolgimenti positivi
durante la trascrizione si generano
RNA
alla
ruotare attorno
polimerasi coniugata
geni attivi,
nel DNA in
osserva una
un
dato
spiegabile
seguito alla trascrizione.
transizione strutturale
perdita dello spaziamento regolare
In
con
doppi
più marcata, che
dei nucleosomi in tutto il
geni ribosomali. Questo effetto è specifico dei geni ribosomali,
infatti l'analisi délia cromatina totale
non
rileva alcuna
perturbazione nello
spaziamento regolare dei nucleosomi.
I risultati di cui sopra
disposti
una
suggeriscono
in tandem nel cluster dei
grande quantité di
che la trascrizione di una série di
geni ribosomali genera
stress torsionale che
con tutta
probabilité
porta alla distruzione délia
struttura délia cromatina in assenza dell' attività enzimatica délie
topoisomerasi,
mentre la trascrizione di
URARIB genera
del DNA, che
una
geni
quantità probabilmente
geni
a
singola copia
inferiore di
corne
DNA
GAL-
superawolgimenti
quindi puô diffondere nelle regioni fiancheggianti
il gene in
modo da evitare l'accumulazione di stress torsionale sul DNA trascritto.
Questo
spiegherebbe perché
l'assenza di
topoisomerasi
non
induce effetti in
-6-
GAL-URARIB, né sulla stabilité dei nucleosomi durante la trascnzione, né sul
loro
riposizionamento
in
seguito
alia
repressione
da
glucosio.
-7-
Summary
Eukaryotic cells
are
characterized
by
large genome,
a
which must be
highly
condensed in order to fit the small nuclear volume. Condensation is achieved
by packaging
DNA into nucleosomes, chromatin fibers and
Packaging
structures.
material to
in nucleosomes restricts the
regulatory
factors and
DNA-dependent processes, such
and DNA
order to
RNA
as
in chromatin
are
of extensive
subject
to nucleosomes
in the last fifteen years
investigation
during transcription by
polymerases. Analysis of the
transiently,
nucleosomal
the
large eukaryotic
structures of nucleosomes and of RNA
in
in order to allow RNA
templates. However,
to presence of
This
to
leaded
the
transcription might
an
be gene
polymerase,
attempt
in vitro and in vivo
nucleosomes,
hypothesis
the
specific
that
and
fate
same
by RNA-polymerase-l I (GAL-URARIB)
In
GAL-URARIB, when cells
were
repressed positioned nucleosomes
of the transcribed
on
during
the DNA sequence,
region by
parameters
sequence
grown in
were
indirect
galactose grown
was
we
constructed
transcribed
by
the
in the LEU2 locus of chromosome III.
glucose
transcription
endlabeling analysis
were
cells. However, a
data were confirmed
and
was
found in the promoter and the 5' end
retardation assay revealed that nucleosomes
template. These
nucleosomes
the local torsional stress and the
digested chromatin. Nucleosome positions
transcribed in
of
in the ribosomal locus of chromosome XII
or
regulated
analysis of chromatin
of
might depend
to address the role of some of these
RNA-polymerase-l (Pol l-URARIB)
was
through
transversal
template.
artificial yeast genes in which the
nuclease
needed, at
to altered nucleosome structures.
the
transcription rate,
chromosomal location of the
In
polymerase
are
transcribing templates provided data ranging from loss
nucleosomes,
the RNA
essential in
provide DNA accessibility during these processes. One question
happens
structure
genetic
transcription, replication, recombination
polymerases strongly suggested that chromatin transitions
least
of the
order
machineries which carry out
repair. Therefore, structural transitions
which has been the
is what
enzymatic
accessibility
higher
lost when the gene
psoralen dependent gel
were
by analysis
of micrococcus
still present
of the natural
genes GAL1, GAL10 and GAL7. Therefore, RNA
on
the
galactose
polymerase
transversal induced rearrangement of nucleosomes, consistent with
a
II
model
-8-
transiently displaced
in which histone octamers are
the
the other hand,
in random
rapidly reassembled
and
polymerase
like in the natural ribosomal genes, as evidenced
gel retardation assay. Hence, nucleosomes
in the
maintained
were
of nucleosomes
nucleosomes
to be a
transcription
might depend
displacement might depend
on
but
was
chromatin,
not a
(ii) Loss
I genes, while
of class II genes. Loss of
specific interactions between
compartmentalization
on
template
particles. Alternatively,
I and nucleosome
polymerase
of the
transcribing
in
were
polymerase I,
general feature of class
maintained during
are
nucleosomes in class I genes
RNA
stability
RNA
to
transcription. From these
(i) the DNA sequence
of nucleosome
seems
by
II
during RNA polymerase
data it can be concluded that:
major determinant
behind it. On
by increased accessibility
lost from the URARIB sequence when transcribed
they
positions
of Pol l-URARIB resulted in loss of nucleosomes
transcription
psoralen crosslinking
from the DNA in front of
nucleosome
of class I genes in the
nucleolus, which has physical and biochemical properties different from the
other
regions
of the cell nucleus.
happens when transcription is turned off? When
But what
structure occur?
regeneration of the inactive
glucose it
minutes. Chromatin
large
after
analysis revealed
glucose repression.
was
suggesting
order to
During
nascent
in
that histone
some
that nucleosomes were
or
suggested
histone
that
repositioning
synthesis
order to
synthesis
repositioned
to
ten minutes
can occur
in the
a
generation (2.5
complete the repositioning process,
or
replication might be needed
DNA
nucleosomes in those genes where
in
transcription resulted
histones.
the process of
transcription, the bulky RNA polymerase with its
transcript is prevented from rotation around the DNA double helix.
This generates
positive supercoils ahead of the polymerase and negative
supercoils behind
it. Since it has been shown that DNA
transcription dependent DNA supercoils in vivo, it
lack of
cell
one
to
within few
for those genes that have
during transcription. However,
required
reposition
in loss of
This
replication
full set of histories
hours)
transcription
promoter and the transcribed region within
extent in the
absence of DNA
By shifting cells from galactose
to repress GAL-URARIB
possible
was
and how does
was
topoisomerases relax
conceivable that the
topoisomerase activity might influence nucleosome stability during
transcription
chromatin
or
repositioning
structure
topoisomerase
I
after
repression.
of GAL-URARIB
was
(topi), topoisomerase
II
In order to address this
topic,
mutants for
DNA
studied in
(top2)
or
both
(topi
top2).
-9-
Nucleosome
positioning
in GAL-URARIB was lost in
grown in galactose. However,
loss of nucleosomes
no
psoralen crosslinking. Therefore,
topoisomerase
lack of
was
mutants
detected
topoisomerase activity
by
did not
promote nucleosome loss during transcription. Furthermore, ten minutes after
glucose repression nucleosomes
were
mutants to the same extent as in wild
repositioned
to
psoralen crosslinking increased
supercoiling.
cluster. This effect was
spacing
specific for
was
These results suggest that
to
copies of
disruption
the
transcription dependent
topi top2
in the whole ribosomal gene
the ribosomal genes, since no loss of
observed in bulk chromatin.
transcription
the ribosomal gene cluster is
leading
regular spacing
severe
topi mutants,
A more dramatic transition was observed in
double mutants, with loss of
nucleosomal
In
in the active
ribosomal genes, consistent with the accumulation of
DNA
topoisomerase
type cells. On the other hand,
effects were observed in the ribosomal gene cluster.
accessibility
in
likely
to
of many genes
arranged
in tandem in
generate high levels of torsional stress,
of chromatin structure in the absence of the relaxation
activity of DNA topoisomerases. On the other hand, transcription of single
copy genes like GAL-URARIB is
likely
to
produce less DNA supercoils, which
might diffuse away preventing accumulation
template. This might explain the absence
stability
or on
topoisomerase
of torsional stress on the
of any effects on nucleosome
repositioning after repression of GAL-URARIB transcription
mutants.
in