Sviluppo e appplicazione di tecniche genomiche avanzate per il

Allegato n. 4
Dottorato di Ricerca in Metodologie di Biomonitoraggio dell’Alterazione ambientale
Presentazione progetto di ricerca
Dottorando: Marco Gerdol
Ciclo: XXIV
Titolo: Sviluppo e applicazioni di tecniche genomiche avanzate per il controllo della contaminazione biotica in
mitilo
Il consumo di molluschi bivalvi è ad oggi responsabile di una buona parte delle tossinfezioni alimentari registrate in
Italia, dovute principalmente alla contaminazione da parte di batteri patogeni o biotossine algali.
Proprio il problema legato alla presenza di alghe produttrici di biotossine sta assumendo dimensioni sempre più
preoccupanti, a causa della diffusione di tali specie anche in aree acquatiche finora incontaminate. La presenza nel Mar
Adriatico di alghe in grado di produrre tossine DSP (responsabili di episodi di diarrea) è ben nota sin dalla fine degli
anni’80, quando si è assistito alla proliferazione di alghe del genere Dinophysis, fenomeno che si ripropone
periodicamente e che pertanto richiede un costante monitoraggio.
La legislazione italiana prevede attualmente la verifica della presenza di tali tossine con il test di Yasumoto (1984), un
saggio in vivo in grado di rilevare la quantità minima di tossina capace di uccidere un topo di 20 g entro le 24h in
seguito ad iniezione intraperitoneale. Dal momento che questo test non ha una sensibilità molto elevata, nel corso degli
ultimi anni si sono susseguite una serie di proposte per test alternativi, che però si sono rivelate generalmente di difficile
attuabilità e troppo dispendiosi per una applicazione di routine.
I cambiamenti climatici ed ambientali inoltre hanno contribuito alla diffusione, per ora su scala limitata, anche di alghe
potenziali produttrici di tossine PSP (tossine paralitiche), in particolare appartenenti al genere Alexandrium, ma non si
può escludere che queste possano rappresentare in un futuro prossimo un considerevole rischio per i consumatori,
richiedendo di conseguenza un monitoraggio costante al pari delle alghe produttrici di DSP.
L’altro elemento di rischio alimentare nei bivalvi eduli è rappresentato dalla contaminazione batterica, problema noto da
lunghissimo tempo e generalmente associato alla consumazione di molluschi crudi o cotti male, che generalmente si
manifesta con sindromi gastroenteriche anche piuttosto gravi. Finora tuttavia l’attenzione si è principalmente
concentrata sui batteri alloctoni, ed in particolare su quelli indice di una contaminazione di origine fecale: le normative
attualmente vigenti prevedono esclusivamente il monitoraggio dei livelli di Salmonella ed Escherichia coli, escludendo
del tutto altri batteri autoctoni potenzialmente pericolosi. In particolare, vista la tendenza generale all’aumento della
temperatura delle acque ed all’incremento della salinità delle lagune, la proliferazione di batteri alofili o alotolleranti
appartenenti al genere Vibrio è un fattore da tenere sotto osservazione: ad esempio Vibrio parahaemoliticus, sebbene sia
ancora scarsamente diffuso in Europa, è uno dei principali responsabili di infezioni alimentari in Giappone e negli Stati
Uniti. Il surriscaldamento delle acque potrebbe portare, anche in tempi piuttosto brevi, alla proliferazione di questo
microorganismo, che gradisce temperature superiori ai 20° C, anche nel Mediterraneo.
Tutti questi fattori in definitiva incidono pesantemente sulla produttività degli allevamenti di bivalvi, spesso costretti a
lunghi blocchi sanitari in seguito alla rilevazione nei mitili di batteri e biotossine algali. Lo sviluppo di tecniche per la
detossificazione naturale degli organismi contaminati non è attualmente di grande aiuto per i mitilicoltori, dal momento
che queste possono essere messe in atto solamente in seguito alla segnalazione della contaminazione, quando di fatto
l’accumulo di tossine e batteri è già notevole. Lo sviluppo e la disponibilità di tecniche per l’individuazione precoce di
infezioni batteriche in atto o di un iniziale accumulo di tossine algali potrebbero essere di grande aiuto per poter
anticipare i tempi, attuando le misure di decontaminazione con molto anticipo rispetto a quanto è possibile fare oggi,
tutelando così sia la salute dei consumatori, sia la redditività degli allevamenti.
Questo progetto di ricerca si propone di utilizzare dei metodi molecolari per poter rilevare, in modo quanto più sensibile
e specifico possibile, elementi di rischio per la salute umana, quali batteri, virus e biotossine di origine algale, nei
mulluschi bivalvi destinati al consumo. Ciò verrà attuato attraverso l’applicazione di tecnologie genomiche e biologicomolecolari avanzate, già ampiamente utilizzate in campo biomedico, al controllo della contaminazione biotica in mitili
eduli.
In un primo periodo sarà posta particolare attenzione nell’investigazione della possibilità di valutare la presenza di
Escherichia coli e di altri altri batteri patogeni nei tessuti e nel liquido intervalvare di mitilo; le metodiche tradizionali,
che tuttora rappresentano lo standard nei laboratori di analisi, si basano sulla conta dei batteri isolati utilizzando
particolati terreni di coltura. La necessità di queste metodiche di dover attendere la crescita dei batteri ne limita la
velocità ed in molti casi per ottenere una elevata specificità sono richiesti arricchimenti multipli.
Anche nel campo della microbiologia alimentare sono state sviluppate nell’ultimo decennio delle nuove tecnologie, che
hanno portato alla ribalta metodologie alternative, basate sull’amplificazione di specifiche sequenze bersaglio di DNA
tramite PCR. L’aumento esponenziale del numero di copie del bersaglio può essere monitorato accuratamente ed in
modo estremamente preciso ed automatico avvalendosi delle tecnologie innovative sviluppate per la Real Time PCR. Il
monitoraggio dell’incremento del DNA così sintetizzato può fornire informazioni precise sul numero di copie iniziali
della sequenza bersaglio. Un grosso vantaggio di queste metodiche, se comparate a quelle tradizionali, risiede nella
velocità intrinseca del metodo. L’identificazione di specifiche sequenze nel genoma di Escherichia coli permetterebbe
ad esempio di poter monitorare il grado di contaminazione nei mitili in modo estremamente rapido, risparmiando
potenzialmente il tempo richiesto alla crescita dei batteri in specifici terreni di coltura.
La real time PCR quantitativa oltretutto si è già dimostrata efficace in campo alimentare, dove viene considerata come
standard assoluto nelle analisi degli organismi geneticamente modificati.
La prima fase di questa parte del progetto di ricerca prevede l’identificazione di potenziali sequenze bersaglio altamente
specifiche di Escherichia coli attraverso studi in letteratura e studi di genomica comparata; l’idea di fondo è quella di
riuscire a disegnare coppie di primer in grado di amplificare solo ed esclusivamente porzioni di DNA genomico di
Escherichia coli comuni a tutti i suoi vari ceppi, di modo da limitare per quanto possibile l’identificazione di falsi
positivi e falsi negativi. La specificità dei primers così disegnati sarà quindi testata attraverso l’amplificazione di
controlli negativi.
Una volta identificate delle coppie di primer che rispondano a questi requisiti, verranno studiati dei metodi per risolvere
una serie di problematiche tecniche: in primo luogo verranno studiati specifici accorgimenti per evitare la
contaminazione ambientale da E. coli, un microorganismo di comune utilizzo nei laboratori biologici. Altre
problematiche da risolvere riguardano: l’ottimizzazione dei protocolli di estrazione di DNA da matrici complesse come
gli omogenati di mitilo; l’eliminazione di potenziali inibitori della polimerasi presenti in tali omogenati, che
ridurrebbero la sensibilità della tecnica; la messa a punto di metodiche per la concentrazione dei batteri su membrane, di
modo da evitare processi di arricchimento in terreni di crescita, che andrebbero a minare l’attendibilità dei dati
quantitativi; l’integrazione di tutte le strategie menzionate sopra in un protocollo standardizzato e facilmente
riproducibile.
Naturalmente questi saggi quantitativi richiederanno delle attente comparazioni con i saggi tradizionali, verificando che
i risultati ottenuti con l’utilizzo delle due metodiche siano in accordo e comparabili. Le stessa linea di ricerca potrà
essere utilizzata anche per l’identificazione specifica di altri batteri che rappresentano un potenziale rischio per la salute,
quali Vibrio vulnificus e parahaemolyticus, Salmonella, etc.
La seconda e più ampia parte di questo progetto di ricerca si propone di identificare dei marcatori del livello di stress in
risposta a fattori ambientali di tipo biotico grazie all’analisi dei profili di espressione genica. Ciò potrebbe portare ad
una maggiore comprensione delle relazioni tra lo stato di salute dell’organismo e la funzionalità del sistema
immunitario; grazie alla collaborazione con l’OGS (Laboratorio di Oceanografia Biologica di Trieste) saranno resi
disponibili mitili trattati sia con batteri che con tossine algali in ambienti controllati, di modo da limitare l’influenza di
altri fattori esterni sull’espressione genica.
Questi campioni potranno essere utilizzati per investigare le variazioni nell’espressione genica di alcune componenti
fondamentali del sistema dell’immunità innata dei mitili: in particolare dei saggi di Real Time PCR verranno effettuati
per analizzare l’espressione dei peptidi antimicrobici (AMP) mitiline, miticine e defensine, la cui sovraespressione in
seguito ad inoculi con alcune classi di batteri è già stata notata nel corso di studi preliminari. Lo scopo è quello di
determinare se tali geni siano sottoposti ad una regolazione differenziale a seconda del tipo di patogeno e se si tratti
dunque di validi indicatori di contaminazione, permettendo anche di approfondire la conoscenza dei meccanismi
dell’immunità innata in cui questi AMP dei molluschi sono coinvolti. Allo stesso modo sarà possibile stabilire se
eventualmente vi sia anche una relazione diretta tra l’accumulo di tossine algali e l’espressione degli AMP.
Uno studio più generalizzato, a livello dell’intero trascrittoma, prevede l’analisi dell’RNA estratto da mitili sottoposti a
stress biotico. La marcatura differenziale degli RNA estratti dai soggetti trattati e dei soggetti di controllo e la successiva
ibridazione competitiva su microarray MytArray 1.0 permetterà di identificare automaticamente, tramite l’analisi con
software statistici specificamente dedicati a studi di questo tipo, geni differenzialmente espressi.
Un attento studio del trascrittoma dei mitili sottoposti a questi trattamenti potrebbe portare all’identificazione di pattern
di espressione correlati a risposte specifiche nei confronti di tossine e patogeni, dati che permetterebbero in prospettiva
di poter mettere a punto dei kit diagnostici per la rilevazione precoce di contaminazione, con la conseguente messa in
atto di misure preventive con notevole anticipo rispetto al raggiungimento della soglia di rischio per il consumatore. I
dati ottenuti grazie agli esperimenti di microarray potranno essere utilizzati in seguito anche per la messa a punto di una
serie di ulteriori esperimenti, grazie ad esempio al disegno di sonde specifiche per analisi di qRT-PCR.
Queste analisi genomiche potrebbero anche essere di grande aiuto nel monitoraggio delle risposte del sistema
immunitario innato del mitilo alle contaminazioni biotiche, permettendo di mettere in luce alcune componenti chiave
nella risposta dei molluschi bivalvi al contatto con biotossine e patogeni.