Metodi artificiali x l`aumento della diversità genetica

Metodologie artificiali per
l’aumento della variabilità
Stefano Pavan
DiS.S.P.A
E-mail: [email protected]
Metodologie artificiali per l’aumento della variabilità genetica
di specie coltivate (e/o per creare nuove specie coltivate)
•  Ibridazioni controllate (intra e interspecifica)
•  Poliploidia indotta
•  Mutagenesi sperimentale
•  Ingegneria genetica
•  Etc.
Nota: i metodi ripropongono i meccanismi evolutivi principali che
hanno portato alla biodiversità naturale. Devono essere considerati
complementari ad azioni di salvaguardia delle risorse genetiche
Sul concetto di specie
•  Specie: una definizione comune è che la specie è un gruppo di individui
interfertili e in grado di dare progenie illimitatamente feconda. Tale
definizione implicherebbe tuttavia che specie diverse non possono
assolutamente incrociarsi o, se lo fanno, danno progenie non fertili.
•  In realtà per essere precisi, bisognerebbe dire che le specie sono:
gruppi di individui che, in condizioni naturali, si incrociano
normalmente tra loro a dare progenie fertile. Ciò implica che:
1) incroci naturali tra specie diverse possono occasionalmente
avvenire, come dimostrato dalla storia evolutiva di molte specie
coltivate e non;
2) In condizioni artificiali, le barriere riproduttive che
ostacolano gli incroci interspecifici possono essere superate
Incroci interspecifici
•  Incroci interspecifici permettono di sfruttare i pool genici
secondario e terziario, e dunque aumentare la variabilità genetica di
specie coltivate su cui poi fare selezione. Molto spesso, geni utili sono
stati trasferiti attraverso successivi reincroci con la specie coltivata
•  Ibridi interspecifici e intergenerici artificiali sono stati in alcuni casi
impiegati direttamente in coltivazione (si sono create in tal modo
nuove specie ibride)
•  In alcuni casi, ibridi interspecifici e intergenerici artificiali hanno
permesso, per raddoppiamento cromosomico artificiale, di ottenere
nuove specie poliploidi
Incroci interspecifici
Resistance sources to O. neolycopersici
Name
Source
Ol-1
S. habrochaites G1.1560
ol-2
S. lycopersicum var. cerasiforme
Ol-3
S. habrochaites G1.1290
Ol-4
S. peruvianum LA2172
Ol-5
S. habrochaites PI247087
Ol-6
Unknown origin
Ol-qtl1,Ol-qtl2, Ol-qtl3
S. parviflorum G1. 1601
Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. tangelo
C. reticulata x C. paradisiaca
Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. mapo
C. reticulata x C. grandis
Ibridi direttamente impiegati nella coltivazione
Barriere riproduttive agli incroci interspecifici e intergenerici
•  Barriere pre-zigotiche: isolamento geografico, isolamento ecologico
(habitat diversi), isolamento stagionale (differente epoca di fioritura,
isolamento meccanico (es. differenti specie di pronubi),
incompatibilità genetica che impedisce la formazione dello zigote (es.
il polline non riesce a germinare sullo stimma)
•  Barriere post-zigotiche: non vitalità o scarsa vigoria degli ibridi,
sterilità degli ibridi (es. mancato appaiamento degli omologhi in
meiosi, che determina una anormale distribuzione dei cromosomi nei
gameti)
Come superare le barriere riproduttive
•  Individuare genotipi adatti: la variabilità esistente nelle specie gioca
un ruolo fondamentale sulla possibilità di ottenere ibridi
interspecifici. Es. accessioni italiane di Trifolium negrescens si
incrociano più facilmente con T. repens rispetto ad accessioni turche
•  Incroci reciproci
• 
Incroci con specie “ponte”: es. Nicotiana repanda, N. tabacum e N.
sylvestris (ponte) per il trasferimento di resistenza a nematodi
Come superare le barriere riproduttive
•  Tecniche particolari di impollinazione, es.
1.  Rimozione dello stigma
2.  Applicazione di sostanze ormonali alla pianta portaseme, allo
scopo di favorire l’allungamento del tubetto pollinico all’interno
dello stilo
3.  Impollinazione successiva o contemporanea ad impollinazione con
polline intraspecifico devitalizzato
•  Modificazione del livello di ploidia. Es. da colture di granuli
pollinici di patata tetraploide si ottengono individui diploidi che
possono essere facilmente incrociati con specie selvatiche di
patata (anch’esse diploidi). Dopo l’introgressione di geni utili, lo
stadio tetraploide può essere ripristinato attraverso l’induzione
del raddoppiamento cromosomico
Come superare le barriere riproduttive
•  Coltura in vitro (coltura in vitro di embrioni): viene generalmente
fatto nei casi in cui all’incrocio interspecifico segue la
degenerazione dell’endosperma)
•  Fusione di protoplasti (derivanti da cellule somatiche per
degradazione della parete cellulare)
Come superare le barriere riproduttive
Fusione di protoplasti
Poliploidia indotta
•  Può essere un valido strumento per superare barriere di
incompatibilità interspecifiche ed intergeneriche. In
questo caso, si creeranno nuove specie poliploidi
•  Ancora, può essere sfruttata per sfruttare direttamente
gli effetti della poliploidia:
•  Maggiori dimensioni delle parti vegetative e riproduttive
(importante per specie da fiore). In realtà sembra che la
maggiore eterosi dei poliploidi, più che la poliploidia in sé, sia
responsabile di questi fenotipi (linee inbred poliploidi sono
inferiori alle corrispondenti linee diploidi)
•  Sterilità : es.banano e anguria (triploidi senza semi)
Poliploidia indotta: colchicina
Poliploidia indotta: colchicina
Poliploidi artificiali
Poliploidi artificiali
Poliploidi artificiali
Poliploidi artificiali
•  Semina contemporanea triploidi e diploidi
•  Impollinazione favorisce la formazione di frutti partenogenici da parte della
varietà triploide, di per sè sterile
Poliploidi artificiali
Mutagenesi sperimentale
•  Mutation breeding: ha incominciato ad affermarsi dopo la
seconda guerra mondiale, in concomitanza con l’interesse
verso le applicazioni pacifiche dell’energia nucleare
•  Vantaggio: può essere applicato per creare variabilità
riguardo una o poche caratteristiche in materiali genetici
di pregio (es. genotipi già utilizzati nella coltivazione)
•  Svantaggi: mutazioni sfavorevoli accanto a quelle
favorevoli ed effetti pleiotropici
Mutagenesi sperimentale
•  Organi vegetali sottoposti ad agenti mutageni: semi,
polline, organi di propagazione vegetativa
•  Agenti mutageni
•  Fisici (raggi UV, X e γ)
•  Chimici (EMS)
Mutagenesi sperimentale
Sostituzione
GC/AT e
mutazione
puntiforme
Mutagenesi sperimentale
•  M1: prima generazione dopo il trattamento mutageno
(ottenuta da organi mutagenizzati)
•  La maggior parte delle mutazioni sono recessive, per cui il
loro effetto fenotipico non è osservabile in M1
•  Alcune eccezioni
•  Tranne che nel caso di trattamenti al polline, le piante M1
presentano una situazione chimerica (tessuti
geneticamente diversi in un individuo)
Manifestazione della mutazione nella generazione M2
Solo se le cellule mutate danno origine al tessuto
sporigeno la mutazione si manifesta in M2
Dalla M1 alla M2 alla M3
•  Perché l’evento di mutazione sia osservabile in M2 (ottenuta per
autofecondazione della M1) è necessario che:
•  Le cellule mutate non perdano vitalità o rapidità di moltiplicazione. Se
ciò avviene, si verifica competizione con cellule non mutate nella
chimera per la formazione del tessuto sporigeno
•  Le cellule mutate diano origine alle cellule sporigene
•  Ordine di grandezza: 20000-40000 piante M2
•  Le mutazioni in M2 vengono poi confermate in M3
Esempio applicativo di mutagenesi sperimentale
• Trattamento con EMS
• 2000 piante M1
• 27000 piante M2
• Screening in M2
attraverso inoculo
artificiale
• Conferma della
mutazione in M3
Siamo nell’era post-genomica…
Questo significa che, in molti casi, conosciamo le sequenze di geni e loro funzione
Possiamo mutare specifici geni con funzione nota…
MLO loss of function mutation
leads to powdery mildew
resistance
Mutagenesi mirata a geni specifici: TILLING
•  TILLING: Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
•  Il TILLING permette di identificare, in una popolazione sottoposta a
trattamento mutageno, individui recanti mutazioni in geni specifici di
interesse
•  A differenza del mutation breeding, in cui i mutanti desiderati sono
selezionati analizzando il fenotipo…
•  …con il TILLING si identificano i mutanti desiderati attraverso
l’analisi del genotipo
•  Oltre che per scopi applicativi (miglioramento genetico), il TILLING
costituisce un approccio di genetica inversa importante per studi di
base
TILLING
TILLING
PCR amplification with fluorescently tagged,
gene-specific primers
Amplicons are denaturated and reannealed, resulting in heteroduplexes
between the mutated sequence and its
wild-type counterpart
Heteroduplexes are specifically cut by the
endonuclease activity of the enzyme CEL1
Different labeled fragments for
LiCOR analysis
Strategie cutting-edge per il knock-out genico: TALEN
Le proteine TAL (transcriptional activator-like) sono effettori
prodotti dal genere Xanthomonas, che promuovono la patogenesi
attraverso specifico legame con il DNA, che a sua volta risulta nella
regolazione positiva di specifici geni della pianta
Le proteine TAL hanno 12-27 ripetizioni a tandem di 33-35 aa
Due aa all’interno della ripetizione determinano legame specifico con
un nucleotide e, dunque, permettono di legare specifiche sequenze
Cermak et al. 2011
Strategie cutting-edge per il knock-out genico: TALEN
Per la mutagenesi, si utilizzano vettori che codificano per effettori
TAL fusi con la nucleasi Fok1 (da cui il nome TALEN)
Poiche Fok1 operata come dimero, i TALENs sono disegnati su strand
opposte delle regioni target
Cermak et al. 2011
Durante il processo di riparazione si generano piccole delezioni/
inserzioni, con conseguente knock-out genico
Strategie cutting-edge per il knock-out genico: ZFN
ZF sono fattori di trascrizione eucariotici
La specificità dei ZF si basa sui domini zinc finger, che riconoscono 3 bp
ZF chimerici legati alla nucleasi Fok1 (ZFN) sono customizzati e usati
per il taglio del gene di interesse, così come visto per I TALENs
Urnov et al. 2010
ZFN and TALEN
Kiefer 2011
ZFNs and TALENs can be also used for gene editing
Curtin et al. 2012
Keep in mind:TILLING is not transgenic,ZFNs, TALEN might be not
Tecnologia del DNA ricombinante
•  Argomento propedeutico a comprendere le tecniche che
portano all’ottenimento di piante transgeniche:
•  Permette di clonare (produrre un gran numero di copie)
specifiche porzioni di DNA (es. geni)
•  Due enzimi fondamentali:
–  Enzimi di restrizione (endonucleasi di restrizione)
–  DNA ligasi
Enzimi di restrizione
•  Si trovano in natura prodotti da batteri per osteggiare
infezioni virali (EcoRI: E. coli, HindIII: Haemophilus
influezae, etc.)
•  Riconoscono specifiche sequenze di coppie di basi (sito
di restrizione) del DNA dove operano un taglio (idrolisi
del legame zucchero/fosfato)
•  Il taglio avviene tra il carbonio al 3’ ed il gruppo fosfato
del legame fosfodiesterico
Enzimi di restrizione
•  Gli enzimi di restrizione comunemente riconoscono
sequenze di DNA che sono palindromiche: sequenze di
nucleotidi che si leggono allo stesso modo da sx a dx e da
dx a sx
•  Il taglio degli enzimi di restrizione può dar luogo ad
estremità sporgenti (protruding) a singolo filamento
oppure estremità piatte (blunt). Le estremità sporgenti
sono anche dette coesive
DNA ligasi
La DNA ligasi normalmente catalizza la formazione di
legame fosfodiesterico tra i frammenti di Okazaki
Tecnologia del DNA ricombinante
•  Isolamento del DNA di un organismo
•  Taglio del DNA dell’organismo mediante enzima/i di restrizione
•  Taglio del DNA di un vettore di clonaggio (molecola di DNA capace di
replicarsi in un organismo ospite, es. una cellula batterica) con lo stesso
enzima/i di restrizione
•  Ligazione dei frammenti di DNA dell’organismo all’interno del vettore di
clonaggio (più facile per enzimi che generano estremità sporgenti coesive) e
ottenimento di una molecola di DNA ricombinante (ovvero DNA ottenuto
dall’unione di frammenti da differenti fonti)
•  Trasformazione (inserimento del vettore ricombinante all’interno di cellule
dell’organismo ospite, es. con elettroporazione o metodi chimici) e recupero
delle molecole di DNA ricombinante
Vettori di clonaggio
•  I plasmidi sono i più diffusi vettori di clonaggio
•  I plasmidi sono molecole di DNA a doppia elica
extracromosomiche, presenti nei batteri
•  I plasmidi si replicano prima della divisione cellulare
batterica in modo tale che le cellule figlie contengono
anch’esse almeno una copia del plasmide
•  Hanno una relazione parassitaria e simbiontica con il
batterio
Vettori di clonaggio
I plasmidi oggi utilizzati nella tecnologia del DNA ricombinante non
sono naturali ma costruiti artificialmente e si replicano nel batterio
E. coli. Gli elementi fondamentali del vettore di clonaggio sono:
• Sequenza ori (origine della replicazione)
• Un marcatore selettivo (per selezionare le cellule di E. coli
trasformate con il plasmide, es. gene di resistenza all’antibiotico
ampicillina)
• Siti unici di taglio per diversi enzimi di restrizione (sito di clonaggio
multiplo o polilinker)
Vettori di clonaggio plasmidici
Se il DNA esogeno è inserito nella
regione polilinker non si produce
beta-galattossidasi funzionale.
Quindi, le colonie di E. coli,
piastrate in terreno di coltura
contenente la sostanza chimica Xgal, appariranno bianche quando
contengono DNA esogeno,
altrimenti blu.
Organismi transgenici
•  Organismi transgenici: organismi caratterizzati dall’introduzione
artificiale di transgeni, ossia geni diversi da quelli presenti nella
specie cui l’organismo appartiene
•  La possibilità di ottenere piante transgeniche permette dunque di
superare le barriere riproduttive tra le specie e aumentare la
variabilità a disposizione del miglioramento genetico
•  Organismi geneticamente modificati
•  Caratteristiche oggetto di trasformazione: resistenza ad erbicidi ed
insetti di natura monogenica
•  Colture oggetto di trasformazione: quelle economicamente più
importanti. Al momento, 4 specie agrarie hanno varietà transgeniche
coltivate su larga scala
Global area of biotech crops, 1996-­‐2011 Source: Clive James, 2012
13ο Συνέδριο, Ελληνική Επιστημονική Εταιρεία Γενετικής Βελτίωσης Φυτών
Καλαμάτα, Οκτώβριος 2010
Global area of Biotech crops, 1996-­‐2011 §  By crop (million hectares) 13ο Συνέδριο, Ελληνική Επιστημονική Εταιρεία Γενετικής Βελτίωσης Φυτών
Καλαμάτα, Οκτώβριος 2010
Source: Clive James, 2012
Global adop9on rates (%) for principal §  Biotech crops 2011 (million hectares) 13ο Συνέδριο, Ελληνική Επιστημονική Εταιρεία Γενετικής Βελτίωσης Φυτών
Καλαμάτα, Οκτώβριος 2010
Source: Clive James, 2012
Piante transgeniche
•  Diversi sono i metodi che permettono di ottenere piante transgeniche
(metodi di trasformazione). Tutti si basano sulla totipotenza delle
cellule vegetali, oltre che, naturalmente, sulle tecniche di clonaggio
del DNA
•  Per totipotenza si intende la possibilità di (quasi) tutti i tipi di cellule
vegetali di rigenerare, in opportune condizioni, un organismo intero
(talee, micropropagazione)
Rigenerazione tramite callo
Trattamento della foglia con disinfettanti Espianto fogliare su terreno a bassa
concentrazione di fitormoni
Formazione di callo
Sub-coltivazione del callo
Induzione di germogli su terreno a basso rapporto auxina/citochinina
Induzione di radici su terreno ad alto rapporto auxina/citochinina
Rigenerazione tramite protoplasti
Si disinfetta la superficie di una
foglia e si pela uno strato
di epidermide
Si pone lo strato di
epidermide su terreno
contenente cellulasi e
pectinasi
Filtrazione della miscela
attraverso un filtro con
porosità di 100 µm
Centrifugazione e recupero
dei protoplasti
Coltura dei protoplasti
Coltura di callo
Rigenerazione
Coltura di cellule in sospensione
Metodi di trasformazione
Agrobacteriummediated
Particle Gun
7%
21%
7%
PEG+Electrop.
64%
nda
A. tumefaciens
A. tumefaciens
1. 
La formazione di galle dipende dalla presenza del
plasmide Ti (tumor inducing).
2. 
Elementi del plasmide Ti:
1. 
2. 
3. 
4. 
Regione ori
T-DNA, integrato casualmente all’interno del genoma
vegetale. Contiene i geni oncogeni (Tum) e i geni Nos, che
permettono la sintesi di opine. Delimitato da sequenze
border di 25 bp (LB e RB)
Geni vir (necessari per il riconoscimento delle sequenze
border e il trasferimento del T-DNA). Attivati da sostanze
rilasciate in corrispondenza di ferite, come l’acetosiringone
Geni Noc (catabolismo delle opine)
A. tumefaciens
Per il trasferimento del TDNA, sono determinanti LB,
RB e i geni vir, ma non altri
geni, che possono essere
rimossi per applicazioni
biotecnologiche
A. tumefaciens
Sistema binario: due vettori plasmidici:
1.  Plasmide helper:
¡  sequenza ori
¡  geni vir
2.  Vettore binario:
¡  sequenza ori
¡  T-DNA comprendente LB, RB, gene marcatore per
selezione vegetale (es. KanR) e polilinker (MCS) in
cui inserire il transgene
¡  Poiché il vettore binario prima di essere trasferito
in Agrobacterium viene clonato in E. coli, è presente
anche una sequenza ori specifica per E. coli e un
marcatore di selezione batterica (es. AmpR)
A. tumefaciens: vettore binario
Rigenerazione cellule trasformate
• Eliminazione
di A. tumefaciens (es. con carbenicillina)
• Sfruttamento
transgeniche
della totipotenza e rigenerazione piante
Altri metodi di trasformazione
¡ 
¡ 
I protocolli di trasformazione con A.
tumefaciens riguardano in massima parte le
dicotiledoni
Metodi alternativi
Metodo biolistico
Il DNA di interesse viene legato a microproiettili,
che, accellerati da macroproiettili, impattano sulle
cellule target ad alta velocità
Metodo biolistico
Metodo biolistico
Cells of a mutant of Chlamydomonas that had a deletion in the atpB
gene for photosynthesis was bombarded with the intact atpB gene.
Then, the cells were transferred to minimal medium so that only
photosynthetically competent cells could grow
Control plate – cells were shot with
tungsten particles without DNA
Elettroporazione
• 
• 
Utilizzato su cellule senza
pareti cellulari (cellule animali,
protoplasti)
Scariche elettriche provocano
la formazione di pori nella
membrana, attraverso cui
penetra il DNA
Il dibattito sulle piante transgeniche
Potenziali vantaggi dall’utilizzo di piante transgeniche
• 
Incremento delle produzioni
• 
Miglioramento della qualità nutrizionale dei prodotti
• 
Sostenibilità ambientale
• 
Vantaggi economici per i produttori e i consumatori, oltre che per il
costitutore varietale
• 
Effetto positivi sulla biodiversità, in considerazione di rese maggiori e la
minore sottrazione di habitat naturali
• 
Molecular farming e produzione di biofuel
• 
Etc.
Vantaggi dall’utilizzo di piante transgeniche
Potenziali rischi per l’ambiente
• 
Partiamo da un presupposto: l’agricoltura, per sua definizione, ha un’azione
distruttiva sull’ambiente e sugli ecosistemi naturali. Tale azione distruttiva è
maggiore nel caso si ricorra a sistemi intensivi, che fanno ampio ricorso a
input esterni
• 
Pertanto, i rischi ambientali dovuti alla coltivazione delle piante transgeniche
dovrebbe essere sempre relazionato ai benefici che esse determinano se
sono capaci di diminuire l’utilizzo di pesticidi, erbicidi, etc.
Potenziali rischi per l’ambiente
• 
Rischi ambientali sono:
1.  Effetto sull’ecosistema: es. il mais Bt è stato messo da alcuni autori in
relazione ad effetti nocivi nei confronti di organismi non target (che dire dei
pesticidi utilizzati in alternativa?)
2.  Il trasferimento genico di resistenze ad erbicidi verso specie infestanti (via
incrocio o trasferimento genico orizzontale) potrebbe portare allo sviluppo di
super-infestanti. Attenzione dovrebbe essere dunque posta soprattutto in
zone in cui sono presenti specie selvatiche affini
3.  Perdita di biodiversità dovuto alla sostituzione di varietà locali con altre GM
(varietà migliorate non transgeniche hanno però avuto in passato lo stesso
effetto)
• 
Sarebbe dunque giusto, così come per qualsiasi innovazione tecnologica, testare
accuratamente l’impatto ambientale di piante transgeniche prima della loro
commercializzazione (e metterlo in relazione con le pratiche agricole che andrebbero a
sostituire). Istituzioni no profit
• 
In ogni modo: non è possibile, con le conoscenze attuali, dire se una pianta transgenica
è sicura per l’ambiente al 100%...
• 
E’ sicuro che l’utilizzo di antiparassitari ed erbicidi, così come la sottrazione di habitat
naturali e l’agricoltura in generale non sono attività environmental friendly
Potenziali rischi per la salute umana
• 
In tanti anni, nessuna ricerca ha dimostrato con certezza un effetto avverso
derivante dal consumo di prodotti GM.
• 
In ogni modo, non è dato sapere con assoluta certezza l’effetto dei singoli
eventi di trasformazione sulla salute umana…
• 
…comunque sia molte varietà oggi in commercio sono il risultato di
trattamenti a raggi X e gamma, o incroci con specie selvatiche non alimentari
• 
Potenziali rischi:
•  Sostanze capaci di provocare allergie
•  Presenza di marcatori selettivi che conferiscono resistenza agli
antibiotici (si potrebbe avere trasferimento di tali geni in organismi
patogeni per l’uomo)
• 
Anche in questo caso, è ovvio che Istituzioni non mosse da interessi
economici dovrebbero attentamente valutare ogni singolo evento di
trasformazione
In conclusione..
• 
Non si può a priori prendere posizioni sulle piante transgeniche…
• 
Andrebbero valutati i singoli eventi di trasformazione sulla base dei rischi e benefici…
• 
Si potrebbe incentivare il rilascio di varietà transgeniche con chiari effetti positivi
sulla salute umana e sull’ambiente e che presentino rischi non ovvii.
• 
Ricerca pubblica su piante transgeniche potrebbe garantire maggiori benefici per la
comunità e gli agricoltori locali, rispetto a quelli derivanti dalla ricerca di multinazionali
(es. Golden Rice)
• 
In un mondo perfetto, non sovrappopolato, non inquinato, con accesso al cibo per tutti,
si potrebbe anche fare a meno degli inevitabili rischi correlati alla produzione di
piante transgeniche…
• 
Considerazioni economiche particolari relative all’Italia: in considerazione dell’opinione
pubblica negativa, della vocazione turistica, della qualità delle produzioni locali e
dell’incapacità di essere competitivi con tipi di agricoltura intensiva, forse potremmo
fare a meno delle piante transgeniche
• 
La ricerca non può farne a meno!!!
Piante transgeniche in ricerca…
Inserzione casuale del transgene
• 
Possibili mutazioni
• 
Mutazioni avvengono continuamente nei genomi di tutti gli
organismi
• 
Il mutation breeding ha prodotto numerose cultivar oggi
comunemente utilizzate
• 
Comunque, tentativi ci sono per determinare a priori il sito di
inserzione del transgene
• 
Trasformazione plastidica è sito-specifica e avviene per
ricombinazione omologa
Ricombinazione omologa nella trasformazione plastidica
Presenza del marcatore selettivo
•  Trasferimento genico orizzontale di resistenza ad
antibiotici a batteri patogeni
•  Trasferimento genico verticale (attraverso incrocio) a
specie infestanti di resistenze ad erbicidi. Oppure la
specie coltivata diventa essa stessa infestante
•  Procedure di trasformazione alternative (piante
transgeniche marker-free)
Strategie per piante transgeniche marker free
•  Rinuncia al marcatore selettivo (efficiente metodo di
trasformazione e screening PCR). Pochi casi in cui è
economicamente conveniente
•  Utilizzo di marcatori che non siano geni di resistenza ad antibiotici
o erbicidi (pertanto, quando si parla di marker-free, si fa
normalmente riferimento ai marcatori di selezione tradizionali)
•  Rimozione del marcatore dopo la selezione di cellule/piante
transgeniche
Utilizzo di marcatori diversi da resistenze ad antibiotici/erbicidi
•  Es. sistema basato sulla fosfo-mannosio isomerasi (PMI)
•  Gene che consente alle cellule di vivere in un mezzo
contenente mannosio come sola fonte di carbonio
Rimozione del marcatore dopo la
rigenerazione: co-trasformazione
¡ 
¡ 
¡ 
¡ 
¡ 
Marcatore di selezione e gene di interesse sono su due
T-DNA, all’interno dello stesso vettore o su due diversi
vettori
Selezione positiva con il marcatore di selezione
Identificazione di piante contenenti anche il transgene in
un altro locus non associato
Selezione in una progenie segregante di piante con il solo
transgene
Meno efficiente e più costoso della normale
trasformazione,
non è possibile per specie che si
riproducono vegetativamente o che hanno un ciclo molto
lungo
Ricombinazione sito-specifica
¡ 
¡ 
Ha luogo in corrispondenza di particolari siti di
escissione (es. loxP del batteriofago P1, FRT di
S. cerevisiae, Rs di Zygosaccharomyces rouxii)
Necessarie ricombinasi (rispettivamente Cre,
FLP, R) che riconoscono i siti di escissione
Rimozione del marcatore per
ricombinazione sito-specifica
Ricombinasi
¡ Il
marcatore selettivo è presente all’interno
dei siti di escissione. Bisogna esprimere le
ricombinasi
Rimozione del marcatore per
ricombinazione sito-specifica
Es. vettore che sfrutta la ricombinazione sito specifica:
l 
l 
l 
All’interno dei siti di escissione Rs vi è il gene per la
ricombinasi R fusa ad un dominio (LBD) che la rende
inattiva
All’interno dei siti di escissione si trovano anche nptII
(resistenza a kanamicina) e codA (citosina deaminasi), la
cui espressione è letale in mezzi con fluorocitosina (FC)
Selezione positiva cellule trasformate, attivazione della
ricombinasi con desametasone (DEX) e selezione negativa
in mezzo con FC delle plantule contenenti il solo transgene.
PCR conferma il genotipo delle piante ottenute da doppia
selezione
Rimozione del marcatore per
ricombinazione sito-specifica
3. Presenza di sequenze di origine
batterica o virale
¡ 
¡ 
¡ 
¡ 
Transgeni, marcatori selettivi, regioni
promotore e terminatore, sequenze plasmidiche
comprese tra LB e RB
Produzione di nuovi vettori che abbiano quante
più sequenze di origine vegetale
Trasferimento genico che sfrutta la
ricombinazione sito-specifica
Trasformazione plastidica (soltanto la sequenza
desiderata si integra nel genoma per
ricombinazione omologa)
4. Trasferimento genico (piante non
transgeniche o specie selvatiche)
¡ 
¡ 
¡ 
Introduzione di geni associati al gene di
interesse che riducono la fitness delle piante
che derivano da incrocio
Coltivazione in ambiente protetto,
sterilizzazione del polline
Trasformazione plastidica (impossibile
contaminazione con polline)